Summary
Um
Abstract
Espécies distintas de
Protocol
1. Infecção de pequenos animais transgênicos com Leishmania
1. Linhas parasita
Transgênicas Leishmania spp. parasitas expressar luciferase são gerados usando um epissomal ou um vetor de integração, quando relatada. 1 2 linhas clonais são os preferidos. Dois pontos importantes são:
(A) luciferase integrado é preferível a luciferase epissomal, uma vez que, em teoria, estas linhas devem parasita melhor manter o transgene na ausência de drogas ou seja, pressão, após a entrada em um mamífero. No entanto, mesmo transgenes integrados podem ser perdidos a preços baixos, 3 por isso é fundamental para manter a pressão selectiva da toxicodependência na cultura estoque. Na prática, Leishmania spp. muitas vezes mantêm elementos epissomal por longos períodos, mesmo in vivo, embora com variação no número de cópias do plasmídeo por célula. 4 Para qualquer tipo de parasita transgênico, que deve sempre ser passado in vitro de uma vez antes da inoculação em animais para evitar os efeitos de drogas potenciais.
(B) A spp Leishmania. parasitas pode perder virulência durante o cultivo in vitro. Em algumas espécies (eg L. donovani, L. infantum chagasi) esta perda pode ocorrer rapidamente durante as semanas de cultura. Em outras espécies (eg, L. major, L. mexicana) virulência é mantida a longo prazo, por meses ou anos. No entanto, transfectants clonal devem ser rastreados para identificar aqueles virulência retenção completa para pequenos animais. Muitos laboratórios série passar os parasitas várias vezes (4 ou mais) por meio de ratos ou hamsters para aumentar a virulência antes do uso em experimentos.
2. Preparação de parasitas metacíclicos infectantes palco para a infecção
A forma infectante de Leishmania spp. que é transmitido pela mosca de areia para os mamíferos é o promastigotas metacíclicos. 5 Por isso, as infecções animais com esta forma do parasita são preferidas como um modelo de infecção natural. Apesar de flebotomíneos são difíceis de manter, parasitas crescidos in vitro será convenientemente sofrer metaciclogênese. A porcentagem de metacíclicos presentes em uma cultura varia de acordo com o número de passes desde o isolamento do animal, os meios de cultura e as espécies de parasitas e tensão.
Metacíclicos pode ser purificado pela seleção positiva ou negativa, dependendo da espécie e linha de Leishmania. Mudanças no terminal ou resíduos de cadeia lateral de carboidrato da superfície abundantes lipophosphoglycan (GLP) de L. importante permitir que ele seja purificado pela perda de aglutinação com a lectina PNA (aglutinina de amendoim). 5,6 Outros espécies de Leishmania ou L. mutantes grande falta metacíclicos GLP pode ser purificada em um gradiente de Ficoll passo. IVIS 7 pode ser realizada utilizando a granel não-culturas puras, mas deve-se reconhecer que estes contêm uma mistura de metacíclicos e formas menos contagiosas.
Normalmente%, 15-20 de massa estacionária fase de L. i. culturas chagasi são recuperados como metacíclicos usando parasitas que foram isolados dentro de 3 semanas a partir de um hamster ou um rato. Parasitas são lavados por centrifugação, suspenso para a concentração desejada em tampão (PBS ou HBSS com ou sem Ca 2 + e Mg 2 +), e mantido a 4 ° C por até 2 horas antes da inoculação no mouse.
3. Escolha da via de inoculação de Leishmania spp. para o host
As manifestações clínicas da doença leishmaniose humana variam de acordo com ambas as espécies de parasita e fatores do hospedeiro. Existem diferenças correspondentes na infecção murina, levando os investigadores a utilização de diferentes modelos e rotas de infecção. Por exemplo, espécies que causam CL humana (por exemplo, L. major, L. mexicana, L. amazonensis) são muitas vezes em camundongos inoculados por via subcutânea na pata ou intradérmica na orelha. 8,9 Espécies causando VL humanos são muitas vezes introduzidas por via intravenosa através de uma cauda 12/10 veia ou por via intradérmica na orelha. 13 infecções veia da cauda foram realizadas tanto com hamster derivados amastigotas ou com promastigotas. Rotineiramente infectar ratos com a forma promastigota de L. i. chagasi, seja por via intradérmica na orelha ou região tarsal laterais 14 ou por via intravenosa.
4. Pré-tratamento de camundongos com anestésico
Camundongos knockout do tipo selvagem, transgênicos ou gene pode ser usado. Embora não formalmente, quantificados, parece mais provável que nus ou albino como camundongos BALB / c permitir uma maior transmissão de luz através do tecido em comparação com camundongos com pele escura e cabelo, como pigmento C57BL / 6.
Injetável agentes anestésico, como uma mistura de quetamina mais xilazina [80-100 mg / kg + 10 mg / kg, respectivamente, intraperitoneally (ip)] diluído em soro fisiológico é um método preferido, uma vez que os animais serão levemente anestesiados por pelo menos 10 minutos, com uma única dose. 100-200ul volume total é injetada ip usando uma agulha de calibre 25-30. Os animais são manualmente contido firmemente por sua pele dorsal com seu abdômen para cima e cabeça apontada para baixo. A agulha deve ser posicionada com o bisel para cima e ligeiramente inclinado. A ponta da agulha deve penetrar ligeiramente no quadrante inferior esquerdo da parede abdominal.
Um anestésico inalante, como o isoflurano pode ser usados alternadamente, mas os animais só permanecerão sob anestesia por quanto tempo eles estão inalando o anestésico.
5. Infecção de camundongos com Leishmania spp. parasitas
Uma vez que os animais são levemente anestesiados, os locais de infecção são limpos com 70% de álcool etílico ou isopropílico. A rota espécies dose, e infecção parasitária é determinado pelo investigador. O volume de injeção devem ser minimizados para evitar danos aos tecidos excessiva para intradérmica (10 ml) ou intramuscular (25-50 mL) vias de infecção. Os volumes de injecção permitido em camundongos pode ser maior para intravenosa (100-200 mL), subcutânea (até 2 ml) ou intraperitoneal (até 2 ml) vias de infecção.
Vias de infecção e volumes utilizados em nossos experimentos incluem intradérmica no pavilhão auricular (10 ml), subcutânea no flanco (100-200 mL), intraperitoneal (100-200 mL) ou intravenosa (100-200 mL). Parasita doses variaram de 10 fevereiro - 10 julho promastigotas.
2. Bioluminescente de imagem de Leishmania utilizando o IVIS (in vivo sistema de imagens)
1. Preparação de D-luciferina bioluminescente para in vivo de imagens
D-luciferina (Caliper Life Sciences) é reconstituído a uma concentração de 15 mg / ml em PBS Dulbecco, com ou sem Mg 2 + e Ca 2 +, seringa e filtrada (0,2 mm). Alíquotas são congeladas a -80 ° C até o uso. Antes da injeção, a luciferina é aquecida a 37 ° C em banho-maria.
2. Injeção de D-luciferina
O local da injeção é limpo e luciferina é introduzido em animais conscientes por uma injeção intraperitoneal de uma solução de luciferina 15 mg / ml em DPBS, na dose de 150 mg / kg. Luciferina também pode ser injetado em animais tratados com anestésico, mas a cinética bioluminescência pode variar um pouco.
Uma vez injetado em animais, a luciferina circula rapidamente. Ele é útil para determinar empiricamente o momento ideal para adquirir dados luminescentes após luciferina de injeção para cada modelo experimental e para diferentes localizações anatômicas dos ratos, porque a cinética de distribuição luciferina pode variar. A curva cinética é gerada através da aquisição de uma seqüência de imagens replicar.
3. Os animais são levemente anestesiados
Os anestésicos inalantes ou injetável pode ser usado para o procedimento de imagem. Isoflurano é mais simples para administrar nesta fase, já que a maioria dos sistemas IVIS tem uma câmara de anestesia e anestesia anexado múltiplas cone de nariz no interior da câmara de imagem. A anestesia é dividida entre a câmara de anestesia e do coletor no interior da câmara de imagem.
Os animais são colocados na câmara clara Plexiglass anestesia e levemente anestesiados com 2,5-3,5% de isoflurano. Animais são visualmente monitorado para garantir um grau efetivo de anestesia foi induzida, e que sua respiração é irrestrito. Grau suficiente de anestesia é verificada por falta de retirada da pata pressão dolorosa. A quantidade de isoflurano pode ser reduzida para 1,5-2% após os animais são levemente anestesiados.
4. Bioluminescentes dados são coletados
Animais adequadamente anestesiados são transferidas da câmara de anestesia para a câmara de imagem e posicionado de modo que os cones no nariz, atrelado ao colector irá entregar um fluxo contínuo e regulado de isoflurano.
The Living programa de software de imagem (Caliper Life Sciences) é aberta e os IVIS é inicializado. Para nossos experimentos, usamos o sistema de Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences). A câmera CCD será automaticamente resfriado e mantido à temperatura adequada depois de inicializar o IVIS. A configuração do sistema de câmera e os parâmetros de aquisição de imagem são definidas no Painel de Controle Sistema IVIS. Os parâmetros de aquisição são em grande parte com base no número de animais e da intensidade da bioluminescência. Parâmetros importantes incluem: modo de imagem (luminescentes ou fluorescentes), tempo de exposição (tempo que o obturador é aberto), binning (determina o tamanho do pixel no CCD), foco e altura sujeito (plano focal), f / stop (tamanho da abertura) eo campo de visão (FOV). O pré-FOVs (regiões imagem quadrada) para o IVIS Imaging System Série 200, são 4, 6.5, 13, 20 e 25 cm (largura do FOV).
Adquirir ou pressionando Adquirir fotos contínuas na janela Sistema de Controle IVIS inicia imagem e de aquisição de dados sobre o IVIS. Tempos de aquisição pode variar de alguns segundos até vários minutos. Para nossos experimentos, usamos a definição de exposição 60 segundo padrão.
Uma imagem Close-up (FOV pequeno) pode proporcionar uma maior resolução, mas não necessariamente maior sensibilidade em comparação com uma imagem tirada com uma maior FOV.
Após o procedimento de imagem, os animais são removidos da câmara de imagem, voltaram para suas gaiolas e monitorada até que se recuperar da anestesia.
7. Análise de dados
Os dados de luminescência é analisado usando o software Image Living (Xenogen) e corresponde à intensidade da luz expressa como o número de fótons detectados pela câmera CCD. Estes dados são representados por uma imagem de pseudo-cor que é sobreposta a uma fotografia em preto e branco dos animais. Áreas específicas da imagem podem ser analisados através da criação de regiões de interesse (ROI). A imagem viva software fornece uma variedade de opções de saída de dados. Uma das maneiras mais simples para analisar os dados é selecionar uma região de interesse (ROI) e medir o número médio de fótons / segundo, que é detectado. Estes dados podem ser exportados para uma planilha como o Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation). GraphPad Prism (GraphPad Software) foi posteriormente usado para gerar gráficos para este manuscrito.
3. Resultados representante
Resumo:
IVIS tecnologia permite a visualização de luciferase expressar-Leishmania spp. parasitas em viver anestesiados camundongos BALB / c em tempo real. Uma vez que o substrato luciferina distribui através dos tecidos, a oxidação rápida do D-luciferina pela luciferase expressas pelos parasitas transgênicos causas luz para ser emitido. Os fótons que não são absorvidas pelo tecido são detectados na superfície do animal pela câmera CCD da tecnologia de imagem IVIS.
1. Modelos de infecção por parasitas que causam leishmaniose cutânea humana visceral contra humanos.
Modelos murino de leishmaniose visceral são mais problemáticas do que os modelos de leishmaniose cutânea, uma vez que o progresso da infecção requer a eutanásia de grupos de camundongos em cada momento avaliado. Uma limitação do IVIS é que as emissões de luz são extinto em diferentes graus em diferentes tecidos viscerais, e tecidos com fluxo arterial elevada, tais como fígado e baço pode ser mais problemática do que a pele. Portanto, IVIS pode não ser tão sensível para a detecção da luciferase expressando parasitas no fígado e baço como na pele. É também aconselhado que carrega parasita não devem ser comparados entre os sites tecido. No entanto, as cargas do parasita nos mesmos tecidos podem ser comparados entre pareados por idade camundongos infectados da mesma linhagem.
O sinal de luciferase foi prontamente detectado em órgãos viscerais em nossos experimentos, facilitando a comparação de infecções entre os animais. Um exemplo de uma infecção por cinco semanas com um parasita luciferase expressando causando a leishmaniose visceral humana, Li. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (A), é mostrado na Figura 1. Após 5 semanas de infecção, os parasitas visceralized pode ser detectado no fígado de todos os ratos e no baço de camundongos 1 e 2. A Figura 2 mostra uma titulação de dose com a linha mesmo parasita, uma hora após a introdução do parasita. Um exemplo de uma infecção longitudinal com parasitas que causam leishmaniose cutânea humana, L. SSU/IR1SAT-LUC mexicana (A), é mostrado na Figura 3.
2. Cinética de detecção de luciferase.
Preliminar estudos cinéticos são essenciais para maximizar a detecção de fótons emitidos dos parasitas bioluminescente. É importante determinar isso empiricamente, como o tempo ideal de imagem provavelmente irá variar dependendo do número e brilho do parasita isolar e na localização anatômica dos microorganismos luminescentes em camundongos. Os estudos de cinética são dependentes da taxa de luciferina de distribuição em todo os tecidos, o tecido do mouse abrigar luciferase expressando Leishmania, ea eficiência da actividade expressão / enzima luciferase em cada parasita isolar. Camundongos são infectados e inoculados com luciferina, como descrito acima, e uma seqüência de imagens é coletada a cada 2 minutos após a injeção de luciferina. A magnitude da luz emitida é quantificada e gráficos para determinar o ponto de máxima detecção (ver exemplo na Figura 1B). Uma vez que o tempo de detecção de luz máxima é determinada, todas as imagens no experimento deve usar o mesmo tempo de imagem após a inoculação de luciferina, como na Figura 1A. Nossos estudos cinéticosdemonstrou um sinal de pico luciferase do fígado de camundongos infectados com L. iv i. chagasi entre 10 e 25 minutos após a inoculação luciferina ip (Figura 1B).
3. Avaliar a eficiência da inoculação do parasita.
IVIS pode ser usado para estimar a consistência e eficiência de infecção inicial com luciferase expressar-Leishmania spp. Enquanto o mesmo caminho é usado para cada animal, os fótons emitidos podem ser usados como uma estimativa aproximada de eficácia da inoculação. Um exemplo é mostrado na Figura 2, em que camundongos BALB / c foram inoculados com os números indicados metacíclicos de L. i. chagasi promastigotas, uma espécie visceralizing de Leishmania. Uma hora após a infecção camundongos foram inoculados com ip luciferina, e após 20 minutos de imagens foram tiradas. A figura mostra a imagem em preto e branco isoladamente (Figura 2A) ea imagem sobreposta com pseudo-colorido luminescência (Figura 2B). Figura 2C mostra o número de fótons emitidos a partir de regiões de interesse escolhida (ROI) das imagens de mouse.
O exemplo da figura 2 demonstra que a dose de infecção é diretamente proporcional à gradação dos fótons emitidos com um número crescente de parasitas. Os dados mostram que, semelhante a L. principais e L. mexicana, de imagem de infecções cutâneas por Leishmania spp. é muito sensível, permitindo que menos de 10 4 parasitas devem ser claramente visualizado. Dados como estes podem ser usados para quantificar a intensidade de infecção. No exemplo mostrado na Figura 2B, há cerca de 1 fótons / seg / parasita.
4. Monitorar o curso da infecção em camundongos.
Modelos murino de leishmaniose cutânea, caracteristicamente, use o tamanho da lesão como uma medida para seguir infecções longitudinalmente. Embora uma boa estimativa da progressão da doença, o tamanho da lesão é afectado pelo grau de resposta inflamatória, além de a taxa de replicação do parasita nos tecidos. Camundongos devem ser sacrificados no final do experimento para realmente medir a carga parasitária. IVIS pode ser usado para estimar a progressão de cargas parasita longitudinalmente em tecido cutâneo de camundongos infectados com espécies de Leishmania que causam leishmaniose cutânea. Demonstrado na Figura 3, camundongos BALB / c foram inoculados por via subcutânea no dia 0 com 10 5 L. mexicana expressar luciferase e fotografada na semana seqüencial após a infecção. Figura 3A apresenta imagens representativas de 10-31 semanas após a infecção. Os mesmos dados são mostrados em forma quantitativa na Figura 3B. Importante, o número de parasitas no local da infecção pode ser quantificado por IVIS antes de uma lesão é detectável por outros métodos.
Ao longo do tempo, o aumento progressivo na bioluminescência corresponde a um aumento no número de parasita. A intensidade do sinal, ou seja, fótons / parasita / segundo, pode variar em função do número de parasitas, a localização do tecido, fase de crescimento e saúde do parasita in vivo. Portanto, é importante para calibrar a relação entre parasitas e luminescência antes de assumir que a bioluminescência é diretamente proporcional ao parasita números. No caso de L. principais 15 ou L. mexicana, 16, parece haver atenuação relativamente pouco de bioluminescência em amastigotas nas lesões pata em relação ao promastigotas. Dados preliminares sugerem que a atenuação pode ser mais profunda para L. infantum chagasi para 17 ou L. braziliensis. 15
Figura 1. Cinética de detecção de luciferase. Kinetic análise da distribuição de luciferina foi realizado para estabelecer o momento ideal para imagens de infecção por Leishmania no fígado. Camundongos foram infectados com iv 10 7 L. i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). A) Quatro camundongos infectados foram fotografadas juntamente com um rato infectado após 5 semanas de infecção. Luciferina foi injetada ip em todos os cinco ratos e as imagens foram coletadas a cada dois minutos para 24 minutos. ROI foram selecionados e luminescência foi medida e quantificada (B).
Figura 2. Avaliar a eficiência da inoculação do parasita. Imagem e quantificar parasitas Leishmania bioluminescentes durante a infecção com IVIS. Do tipo selvagem camundongos BALB / c foram injetados por via intradérmica na parte inferior do flanco direito com HBSS (mock) ou Leishmania transgênicos i. L. chagasi i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). Os ratos foram então analisados com a tecnologia de imagem IVIS uma hora após a inoculação. A) Uma fotografia a preto e branco dos ratos foi tomada imediatamente antes do sinal luminescente (intensidade de luz) foi medida. As setas vermelhas apontam para o local da injeção em cadaanimal. B) A imagem pseudo-cor da luminescência foi sobreposta na fotografia. C) Regiões de interesse (ROI) foram selecionados (círculos vermelhos) ea luminescência foi quantificado em cada ROI. Os dados representam a luminescência líquido de ROI infectados menos o ROI de mock infectados.
Figura 3. Infecção a longo prazo com um parasita causador da leishmaniose cutânea humana. Horário de avaliação do curso da carga parasitária em um único animal injetado com bioluminescent Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A). Um tipo selvagem BALB / c do mouse foi injetada por via subcutânea no jarrete com 100.000 fase estacionária de transgênicos Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A). IVIS dados foram coletados a partir do rato infectado com o número indicado de semana pós-infecção. A) Pseudo-coloridas imagens da luminescência foram sobrepostos em fotografias a preto e branco a partir de pontos de tempo correspondente. B) O ROI líquido foi determinada medindo luminescência no jarrete infectados e subtraindo ROI fundo do jarrete contralateral não infectados foi representado graficamente. O gráfico de dispersão representa ROI líquido em vários pontos do tempo pós-infecção.
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Discussion
O sistema de imagem in vivo (IVIS) fornece um método para geração de imagens animal inteiro ou in vivo de imagens modelos de infecção experimental de diferentes formas de leishmaniose. 18,16 A spp Leishmania. parasitas podem ser projetados para expressar luciferase firefly a um nível que é detectado in vivo com a tecnologia de imagem IVIS. Uma das grandes vantagens deste método é que permite visualização não invasiva de Leishmania spp. dentro do animal hospedeiro vivo. Este método tem sido aplicado a outros modelos de doenças infecciosas, utilizando agentes infecciosos que podem expressar transgenes. 19 20 Além disso, IVIS tem sido utilizado como modelo para avaliar a terapia medicamentosa da infecção por Leishmania grandes na pele de camundongos C57BL / 6. 16,21
Existem algumas ressalvas importantes e limitações deste método. A força do sinal de luz detectada pela câmera CCD pode ser afetada pela localização dos parasitas dentro do hospedeiro mamífero, pela força de expressão luciferase na parasitas, pela disponibilidade de co-fatores para a reação de oxidação de D-luciferina e pela absorção de luz pelos tecidos envolventes. Além disso, a intensidade do sinal no fígado e baço é mais fraco ao nível dos fótons por parasita por segundo do que o sinal na pele, provavelmente devido à extinção pelo fornecimento de sangue local e os tecidos envolventes. Quantificação dos fótons emitidos podem ser usados para comparar infecção progressiva, num único animal ao longo do tempo, ou no mesmo tecido entre os animais. 16 No entanto, até mais otimizado, essas advertências irá limitar a sensibilidade e, assim, a utilidade do método para a avaliação quantitativa da infecções profundas com o visceralizing Leishmania spp. Finalmente, as imagens são susceptíveis de ser mais fraco em preto (por exemplo, C57BL / 6) do que em ratos brancos (por exemplo, BALB / c) camundongos. Raspar o cabelo da pele que recobre a área de interesse pode ser útil para detectar o sinal de ratos negros.
Considerações adicionais são a necessidade de validar o IVIS como uma medida quantitativa de cargas do parasita. Comparações entre microscopia, qPCR e IVIS foram feitas em alguns casos, mas seria necessário com cada sistema para validar a utilização do método como medida da progressão da doença. 22 16 Novos métodos para geração de imagens estão surgindo, o que pode ser acoplado a imagens bioluminescência. 16 Além de parasitas transgênicos, animais hospedeiros podem ser projetados para expressar moléculas bioluminescentes ou fluorescentes. Futuros estudos utilizando esta técnica poderia incluir animais expressar transgenes em compartimentos celulares específicos para detectar fatores do hospedeiro envolvidos na patogênese e parasitas ao mesmo tempo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão comentário Mérito do Department of Veterans Affairs, pelo NIH concede AI045540, AI067874, AI076233-01 e AI080801 (MEW), e por AI29646 (SMB). O trabalho foi realizado em parte durante o financiamento de CT e JG pelo NIH T32 AI07511.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent |  Caliper Life Sciences |
122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper Life Sciences |
Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
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