ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

Summary

アン

Abstract

異なる種の

Protocol

1。トランスジェニックリーシュマニアと小動物の感染症

1。寄生虫行

トランスジェニックリーシュマニア属。ルシフェラーゼを発現する寄生虫は、エピソームまたは報告されたとして組み込みベクターを用いて生成されます^{。1 2}クローンの線が好ましい。 2つの重要な点は以下のとおりです。

理論的にはこれらの寄生虫のラインが良く哺乳動物に導入後の薬剤の圧力、すなわち非存在下での導入遺伝子を保持する必要がありますので、（a）に統合されたルシフェラーゼは、エピソームルシフェラーゼよりも好まれます。それは株式の文化に選択的な薬剤の圧力を維持するために重要であるので、しかし、さらに統合された導入遺伝子は、低金利^、3に失われることがあります。実際には、 リーシュマニア属。多くの場合、細胞あたりのプラスミドコピー数の変化とが、さらに生体内で延長期間のエピソーム要素を保持するトランスジェニック原虫のいずれかのタイプ^に4を 、彼らは常に潜在的な薬剤の影響を避けるために、前に動物への接種にin vitroで一度に渡す必要があります。

（b）のリーシュマニア属。寄生虫は、in vitro培養中に病原性を失う可能性があります。いくつかの種で（例えばL.ドノバン、L. infantum chagasi）この損失は、文化の数週間で急速に発生する可能性があります。他の種では（例えば、L.メジャー、L.メキシカーナ ）病原性は、数カ月から数年間、長期的に保持されます。それにもかかわらず、クローンのトランスフェクタントは、小動物のためのそれらの保持、完全な病原性を同定するためにスクリーニングされるべきである。多くのラボでは、逐次実験に使用する前に病原性を増大させるためにマウスやハムスターを数回（4以上）寄生虫を通過します。

2。感染の感染metacyclicステージ寄生虫の準備

リーシュマニア属の感染形態。哺乳動物宿主への砂フライによって送信されているmetacyclic promastigoteであるので^5は 、寄生虫のこのフォームを持つ動物の感染症は、自然感染のモデルとして好まれている。砂のハエが維持することが困難であるが、in vitroで成長寄生虫は便利metacyclogenesisを受けることになる。文化の存在metacyclicsのパーセントは、培地および寄生虫種や菌株、動物からの分離以来、パスの数によって異なります。

Metacyclicsは、 リーシュマニアの種と線に応じて正または負の選択によって精製することができる。 L.の豊富な表面lipophosphoglycanの末端または側鎖の炭水化物残基の変化（LPG） 大手は、それがレクチンPNA（ピーナッツ凝集素）と凝集の損失によって精製することができます^。5,6その他のリーシュマニア種またはL.は metacyclic LPGを欠く主要な変異体は、フィコールステップ勾配で精製することができる⁷ IVISはバルク非精製培養を用いて行うことができますが、それはこれらがmetacyclicと少ない感染形態の混合物が含まれていることを認識すべきである。

バルク固定相L.の通常は、15から20パーセントI. chagasi培養物は 、ハムスターやマウスから3週間以内に単離されている寄生虫を使用してmetacyclicsとして回収されています。寄生虫は、遠心分離によって洗浄バッファーで目的濃度（HBSSまたはPBSのCa ²の有無にかかわらず⁺およびMg ^{2 +）}に懸濁し、4℃に維持前のマウスへの接種の2時間までのCされています。

3。 リーシュマニア属の接種のための経路の選択。ホストへの

ヒトリーシュマニア症の臨床的疾患の症状は、寄生虫と宿主因子の両方の種によって異なります。マウス感染に対応する違いが、異なるモデルや感染の経路を使用する主要な研究者があります。例えば、人間のCL（例えばL.メジャー、L.メキシカーナ、L. amazonensis）原因となる種は多くの場合、足蹠にまたは皮の耳の皮下マウスに接種されています。人間のVLを引き起こす^8,9種はしばしば尾を通して静脈内に導入されています耳の皮静脈^10-12を¹³尾静脈感染は、ハムスター由来amastigotesでまたはpromastigotesのいずれかで行われている。我々は日常的にL.のpromastigoteフォームを持つマウスを感染させるI. chagasi、どちらかの皮の耳または外側足根領域¹⁴または静脈インチ

4。麻酔薬によるマウスの前処理

野生型、遺伝子導入や遺伝子ノックアウトマウスを使用することができます。正式には、定量化されていませんが、それはそのようなBALB / cマウスのようなヌードやアルビノは、浅黒い肌とそのようなC57BL / 6のような毛の色素を持つマウスに比べて組織を通るより、光伝送のために許可されている可能性が最も高いと思われる。

そのような[80〜100 mg / kgの+ 10 mg / kgを、それぞれケタミンプラスキシラジンの混合物、intrapとして注射anesthestic剤動物は単回投与で少なくとも10分間、軽く麻酔になるのでeritoneally（IP）]生理食塩水で希釈しては、一つの好ましい方法です。 100 - 200ulの合計量は25から30ゲージの針を用いて腹腔内注射される。動物は、手動でそれらの腹部上下指摘ヘッドとの背部皮膚でしっかりと拘束されています。針が上と若干斜めにベベルに配置する必要があります。針の先端はわずかに腹壁の左下の象限に浸透してください。

イソフルランなどの吸入麻酔薬を交互に使用することができますが、動物がいる限り彼らは麻酔薬を吸入されるために麻酔下で維持されます。

5。 リーシュマニア属によるマウスの感染症。寄生虫

動物は軽く麻酔したら、感染部位は70％エチルまたはイソプロピルアルコールで洗浄されています。寄生虫種、投与量と感染経路は、治験責任医師によって決定されます。注入量は、皮内（10μl）あるいは筋肉内（25〜50μlの）感染経路のための過剰な組織の損傷を防ぐために最小化する必要があります。マウスの許容注入量は静脈内（100〜200μlの）、皮下（最大2 ml）または腹腔内（最大2 ml）を感染経路のための大きくなる可能性があります。

私たちの実験で使用されている感染経路とボリュームは、耳の耳介（10μl）を、脇腹の皮下（100〜200μl）を、腹腔内（100〜200μl）あるいは静脈内（100〜200μlの）の皮が含まれます。寄生虫の用量は10 ² 10 ⁷ promastigotesであったしました。

2。 IVISを使用してリーシュマニアの生物発光イメージング（in vivoイメージングシステムで ）

1。生体生物発光イメージングのためのD -ルシフェリンの調製

D -ルシフェリン（キャリパーライフサイエンス）はダルベッコPBSのMg ²の有無に関係なく⁺とCa ^{2 +}の15 mg / mlの濃度に再構成し、シリンジは（0.2μm）で濾過される。アリコートを° C使用時まで-80℃で凍結されています。注入前に、ルシフェリンは° Cの水浴中で37に加温する。

2。 D -ルシフェリンの注入

注射部位を洗浄され、ルシフェリン、150 mg / kgの用量で、DPBSで15 mg / mlのルシフェリン溶液の腹腔内注射によって意識の動物に導入される。ルシフェリンは、麻酔処置動物に注入することができますが、生物発光反応速度が若干異なる場合があります。

一度動物に注射、ルシフェリンは急速に循環する。ルシフェリンの分布の動態が異なる場合がありますので、それは経験的に、各実験モデルおよびマウスの異なる解剖学的位置についてはルシフェリンの投与後に発光データを取得する最適な時期を決定するのに便利です。運動曲線は、複製画像のシーケンスを取得することによって生成されます。

3。動物は軽く麻酔

吸入または注射麻酔は、イメージの作成処理に使用することができる。イソフルランは、ほとんどのIVISシステムが接続されている麻酔チャンバーとイメージング室内の麻酔のノーズコーンのマニホールドを持っているので、この段階での管理が簡単です。麻酔は麻酔チャンバーとイメージングチャンバー内のマニホールドの間で分割されます。

動物は、明確なプレキシガラス麻酔チャンバー内に設置し、2.5〜3.5パーセントイソフルランで軽く麻酔している。動物は、視覚的に麻酔の効果的な度合いが誘導されたことを確認するために監視し、彼らの呼吸が妨げられることであることをされています。麻酔のに十分な程度は、痛みを伴う足の圧力からの撤退の欠如によって検証されます。動物は軽く麻酔した後、イソフルランの量は、1.5から2パーセントに低下することがあります。

4。生物発光のデータが収集されます

十分に麻酔動物を麻酔室から撮影室に搬送し、マニホールドに接続されたノーズコーンはイソフルランの連続と規制の流れを配信するように配置されています。

リビングイメージのソフトウェアプログラム（キャリパーライフサイエンス）が開かれ、IVISが初期化されます。私たちの実験のために、我々はXenogen IVIS 200システム（キャリパーライフサイエンス）を使用します。 CCDカメラは、自動的にIVISを初期化した後に冷却し、適切な温度で維持されます。カメラシステムのセットアップと画像取り込みのパラメータは、IVISシステムのコントロールパネルで設定されています。取得パラメータは、主に動物の数と生物発光の強度に基づいています。重要なパラメータは以下のとおりイメージングモード（発光または蛍光灯）、露光時間（シャッターが開いている時間）、ビニング（CCDのピクセルサイズを決定する）、フォーカス、被写体の高さ（焦点面）、F /停止を（開口サイズ）視野（FOV）のとフィールド。プリセットFOVIVISイメージングシステム用の（正方形の画像領域）200シリーズは、4、6.5、13、20および25センチメートル（FOVの幅）です。

IVISシステムコントロールウィンドウでの連続写真を取得または取得を押すと、IVISの画像とデータ収集を開始します。取得時間は数秒から数分に及ぶ範囲で設定できます。我々の実験では、60秒、デフォルトの露出設定を使用してください。

クローズアップ画像（小FOV）が大きい解像度を提供することが、必ずしも必要ではないが強化された感度より大きなFOVを使用して撮影した画像と比較して。

彼らは麻酔から回復するまでの撮像手順の後、動物は、撮影室から除去され、そのケージに戻したと監視。

7。データの分析

発光データは、リビングイメージのソフトウェア（Xenogen）を用いて解析し、CCDカメラによって検出される光子の数で表される光強度に相当する。これらのデータは、動物の白黒写真の上にオーバーレイされる擬似カラー画像で表されます。画像の特定の領域を関心領域（ROI）を作成して分析することができる。リビングイメージのソフトウェアは、データ出力のさまざまなオプションを提供していますか。データを分析する最も簡単な方法の一つは、関心領域（ROI）を選択し、＃検出された光子/秒の平均値を測定することです。これらのデータは、Microsoft Office Excelなど（マイクロソフト社）などのスプレッドシートにエクスポートすることができます。グラフパッドプリズムは、（グラフパッドソフトウェア）その後、この原稿のためのグラフを生成するために使用されていました。

3。代表的な結果

要約：

IVIS技術は、ルシフェラーゼを発現するリーシュマニア属の可視化を可能にします。リアルタイムで麻酔BALB / cマウスを生きているの寄生虫。基質のルシフェリンが組織を通じて配布したら、トランスジェニック原虫によって発現ルシフェラーゼによるD -ルシフェリンの急速な酸化が放出される光が発生します。組織によって吸収されない光子は、IVISイメージング技術のCCDカメラによる動物の表面で検出されています。

1。人間の内臓対人間の皮膚リーシュマニア症を引き起こす寄生虫感染のモデル。

感染症の進展が評価各時点でのマウスのグループの安楽死を必要とするので、内臓リーシュマニア症のマウスモデルは、皮膚リーシュマニア症のモデルよりもさらに問題です。 IVISの制限は、光の排出量が異なる内臓組織の別のエクステントに急冷され、肝臓や脾臓などの高血流と組織は、皮膚よりも問題となる可能性があるということです。したがって、IVISは皮膚のように肝臓と脾臓におけるルシフェラーゼ発現寄生虫の検出の場合と小文字が区別されないことがあります。また、寄生虫の負荷が組織のサイト間で比較されるべきではないことをお勧めします。それにもかかわらず、同じ組織内の寄生虫負荷は、同系統の年齢をマッチさせた感染マウス間で比較することができます。

ルシフェラーゼシグナルが容易に動物間感染の比較を容易に、我々の実験で内臓器官で検出された。人間の内臓リーシュマニア症、リチウムを引き起こしてルシフェラーゼ発現寄生虫と5週間の感染症の例。 chagasi SSU/IR1SAT-LUC（A）は、図1に示されています。感染の5週間後、visceralized寄生虫は、すべてのマウスの肝臓やマウスの1と2の脾臓で検出することができます。図2は、同一の寄生線、寄生虫の導入後1時間で投与量の滴定を示しています。人間の皮膚リーシュマニア症を引き起こす寄生虫を持つ縦感染の例、L.メキシカーナ SSU/IR1SAT-LUC（A）は、図3に示されています。

2。ルシフェラーゼ検出の速度論。

予備的運動の研究は、生物発光の寄生虫から放出された光子の検出を最大化するために不可欠です。最適な撮像時間はおそらく寄生虫の数と明るさ分離にとマウスの発光微生物の解剖学的位置に応じて異なりますので、経験的にこれを決定することが重要です。運動の研究では、ルシフェリンの組織全体に配布、ルシフェラーゼ発現リーシュマニアを保有するマウス組織、および単離する各寄生虫のルシフェラーゼ発現/酵素活性の効率の速度に依存しています。マウスは感染とルシフェリンを接種上記のように、画像のシーケンスは、ルシフェリンの投与後2分ごとに収集されている。放出された光の大きさは（図1Bの例を参照）最大検出点を決定するために定量化し、グラフ化されます。最大光検出の時間が決定されると、実験中のすべての画像は、図1Aに、ルシフェリンの接種後の画像の同じ時間を使用する必要があります。私たちの運動の研究L.とIVを感染したマウスの肝臓からピークルシフェラーゼシグナルを示したI. chagasi 10〜25分後にIPルシフェリンの接種（図1B）。

3。寄生虫の接種の効率を評価。

IVISは、 リーシュマニア属のルシフェラーゼ発現で最初の感染の一貫性と効率性を推定するために使用することができます。限り同じルートが各動物のために使用されるように、放出された光子は、接種の有効性の概算として使用することができます。例は、BALB / cマウスがmetacyclic L.の指示された番号を接種された、図2に示されていますI. chagasi promastigotes、リーシュマニアのvisceralizing種。感染マウスの後の一時間は、ルシフェリンのIPを接種した、と20分後の画像が撮影された。図は、単独で黒と白のイメージ（図2A）および疑似カラーの発光（図2B）を重ねて画像を示しています。図2Cは、マウスの画像から関心の選択した領域（ROI）から放射される光子の数を示しています。

図2の例では、感染の投与量は、寄生虫の数の増加とともに放出された光子のグラデーションに正比例することを示しています。データはL.に似て、ことを示しているメジャーとL.メキシカーナ 、 リーシュマニア属と皮膚感染症のイメージング。未満の10 ⁴の寄生虫が明らかに視覚化できるようにすること、非常に敏感です。このようなデータは、感染の強さを定量化するために使用することができます。図2Bに示す例では、約1光子/秒/寄生虫があります。

4。マウスの感染症の経過を監視する。

皮膚リーシュマニア症のマウスモデルは、特徴的に縦方向に感染を追跡する手段として、病変のサイズを使用してください。疾患の進行の良好な推定値が、病変のサイズは、組織内の寄生虫のレプリケーションの速度に加えて、炎症反応の程度によって影響されます。マウスは、実際に寄生虫の負荷を測定する実験の最後に安楽死されている必要があります。 IVISは、皮膚リーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア種に感染したマウスの皮膚組織に縦方向に寄生負荷の進行を推定するために使用することができます。図3に示すように、BALB / cマウスは、10 ⁵ Lで0日目に皮下接種したメキシカーナ航空は、感染後、順次週間でルシフェラーゼと画像化された表現。図3Aは、感染後10〜31週での代表画像を示す。同じデータは、図3Bの定量的な形で表示されます。病変は、他の方法によって検出される前に重要なことは、感染部位での寄生虫の数は、IVISによって定量化することができる。

時間が経つにつれて、生物発光の漸進的増加は、寄生虫の数の増加に対応しています。信号強度、すなわち光子/秒/寄生虫は、、、寄生虫数の関数としてin vivoでの増殖期および寄生虫の健康を組織の位置を変えることができます。その生物発光は、寄生虫の番号に直接比例すると仮定する前に寄生虫と発光の関係を校正することが重要です。 L.の場合主要な ¹⁵またはL.メキシカーナ航空 ^、16 promastigotes相対足蹠病変内amastigotesで生物発光の相対的に少ない減衰があるように見える。予備的データは、減衰がLのより深いかもしれないことを示唆しているchagasi infantum ¹⁷またはLのbraziliensis ¹⁵

図1。ルシフェラーゼ検出の動力学。ルシフェリンの分布の動力学的解析は、肝臓でのイメージングリーシュマニア感染症のための最適な時期を確立するために実施した。マウスは、10 ⁷ L.したIVを感染させたI. chagasi pIR1SAT - LUC（）。 A）四感染マウスは、感染症の5週間後一感染していないマウスと一緒に画像化した。ルシフェリンは、24分間、2分ごとに収集されたすべての5匹のマウスと画像に腹腔内注射した。 ROIは、選択され、発光は（B）を測定し、定量した。

図2。イメージングは。寄生虫予防接種の効率性を評価し、IVISで感染時に生物発光リーシュマニア原虫を定量化する。野生型BALB / cマウスをHBSS（モック）またはトランスジェニックリーシュマニア iと右下のわき腹に皮内注射されたchagasi L. I. chagasi pIR1SAT - LUC（）。マウスは、接種後のIVISイメージング技術一時間で分析した。 A）マウスの黒と白の写真は発光信号（光強度）を測定した直前に行われました。赤の矢印は各注射部位を指して動物。 B）発光の擬似カラー画像は、写真に重層した。 C）関心領域（ROI）が選ばれた（赤丸）と発光は、各ROIで定量した。データは、感染したROIマイナス感染モックのROIの正味の発光を表しています。

図3。生物発光リーシュマニアメキシカーナpIR1SAT - LUC（A）を注射した単一の動物に寄生負担の人間の皮膚リーシュマニア症を引き起こす寄生虫との長期的な感染症。タイムコースの評価。野生型BALB / cマウスは、100,000固定相トランスジェニックリーシュマニアメキシカーナpIR1SAT - LUC（）と飛節に皮下注射した。 IVISのデータは、週の指定された数、感染後における感染マウスから採取された。 A）発光の擬似カラー画像は、対応する時点から、白黒写真の上に重ねていた。 B）純投資収益率がグラフ化された感染ホックで発光を測定し、対側の非感染ホックからバックグラウンドのROIを引くことにより決定した。散布図は、様々な時点で、感染後の正味投資収益率を表しています。

Discussion

in vivoイメージングシステム（IVIS） で全体の動物のイメージングやリーシュマニア症のさまざまな形態のin vivoイメージングの実験感染モデルにおける方法^。18,16 リーシュマニア属を提供します。寄生虫は、IVISイメージング技術による生体内で検出されたレベルでのホタルのルシフェラーゼを発現するように設計することができます。この方法の大きな利点の一つは、 リーシュマニア属の非侵襲的可視化を可能にすることです。生きている動物のホスト内部。このメソッドは、明示的な組換え遺伝子ができる^{。19 20は}さらに、IVISはC57BL / 6マウスの皮膚でリーシュマニア主要な感染症の薬物療法を評価するモデルとして使用されている感染性病原体を使用して、他の感染症のモデルに適用されている^。16,21

この方法のいくつかの重要な注意事項と制限事項があります。 CCDカメラで検出された光信号の強度は、D -ルシフェリンの酸化反応の補因子の可用性によって、寄生虫のルシフェラーゼ発現の強さによって、哺乳動物宿主内寄生虫の位置によって影響を受ける可能性がとを覆う組織による光の吸収による。さらに、肝臓と脾臓における信号強度はおそらく、地元の血液供給とを覆う組織による消光のために皮膚の信号よりも1秒あたりの寄生虫あたりの光子のレベルで弱いです。放出された光子の定量化、時間の経過、または動物の間で同じ組織に単一の動物で進行性感染症を比較するために使用することができます^。16がさらに最適化されるまで、これらの注意事項は、感度、したがっての定量的評価法の有用性を制限するvisceralizing リーシュマニア属による深部感染。最後に、画像が白（例えば、BALB / c）のマウスに比べて黒（例えば、C57BL / 6）マウスで弱い傾向があります。関心の領域を覆う皮膚から毛を剃ると黒いマウスからの信号を検出するのに役立ちます。

その他の考慮事項は、寄生虫の負荷の定量的尺度としてIVISを検証する必要があります。顕微鏡との間の比較は、定量PCRとIVISはいくつかのインスタンスで行われているが、病気の進行の指標としてのメソッドの使用を検証するために、各システムで必要になります。イメージングのための^{22 16}の新しい手法が出現している、に結合することがどの生物発光画像。トランスジェニック原虫に加え^、16、動物のホストは、生物発光または蛍光分子を発現するように設計することができます。このテクニックを使用して今後の研究は、病因と同時に寄生虫に関与する宿主因子を検出するために特定の細胞区画に導入遺伝子を発現している動物を含めることができます。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
D-Luciferin Potassium Salt	Reagent	Caliper Life Sciences	122796
IVIS Imaging System 200 Series	Equipment	Caliper Life Sciences		Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum.