Summary
Ein
Abstract
Verschiedene Arten von
Protocol
1. Die Infektion von kleinen Tieren mit transgenen Leishmania
1. Parasite Linien
Transgene Leishmania spp. Parasiten, die Luciferase erzeugt mit Hilfe eines episomalen oder eine integrierende Vektor wie berichtet. 1 2 klonale Linien werden bevorzugt. Zwei wichtige Punkte sind:
(A) Integrierte Luciferase über episomalen Luciferase bevorzugt, da in der Theorie dieser Parasit Linien besser behalten sollte das Transgen in der Abwesenheit von Drogen Druck, dh nach der Einführung in ein Säugetier. Aber auch integrierte Transgene können zu günstigen Konditionen, 3 verloren und muss deshalb kritisch, um eine selektive Medikament auf den Bestand Kultur aufrecht zu erhalten. In der Praxis Leishmania spp. Oft behalten episomalen Elemente für einen längeren Zeitraum auch in vivo, wenn auch mit Schwankungen in Plasmid-Kopienzahl pro Zelle. 4 Für beide Arten von transgenen Parasiten, sie sollten immer in vitro einmal bestanden vor der Inokulation werden in Tiere um potenzielle Arzneimittelwirkungen zu vermeiden.
(B) Die Leishmania spp. Parasiten können Virulenz während in vitro-Kultur zu verlieren. Bei einigen Arten (zB L. donovani, L. infantum chagasi) diesen Verlust schnell auftreten, die über Wochen Kultur. Bei anderen Arten (zB L. major, L. mexicana) Virulenz bleibt längerfristig über Monate bis Jahre. Dennoch sollte klonale Transfektanten gesiebt, um die Beibehaltung voller Virulenz für kleine Tiere zu identifizieren. Viele Labors wird seriell passieren die Parasiten mehrmals (4 oder mehr) durch Mäuse oder Hamster zur Virulenz vor zu erweitern, um in Experimenten verwendet werden.
2. Vorbereitung der infektiösen metazyklisch Parasiten für eine Infektion
Die infektiöse Form von Leishmania spp. Dies wird durch die Sandmücke, die Säugerwirt übertragen wird die metazyklisch promastigote. 5 Darum werden Infektionen von Tieren mit dieser Form des Parasiten als Modell der natürlichen Infektion bevorzugt. Obwohl Sandmücken schwierig zu pflegen sind, werden Parasiten in vitro gezüchtet bequem unterziehen metacyclogenesis. Der prozentuale Anteil der metacyclics in einer Kultur wird mit der Anzahl der Durchläufe seit isoliert von dem Tier, den Kulturmedien und der Parasit Art und Stamm variieren.
Metacyclics kann durch positive oder negative Selektion je nach Art und Leitung von Leishmania gereinigt werden. Änderungen im Terminal oder Seitenkette Kohlenhydratreste der reichlich vorhandenen Oberfläche lipophosphoglycan (LPG) von L. große lassen Sie es durch den Verlust der Agglutination mit dem Lektin PNA (Peanut-Agglutinin) gereinigt werden. 5,6 Andere Leishmania Spezies oder L. großen Mutanten metazyklisch LPG kann auf einem Ficoll Stufengradienten gereinigt werden. 7 IVIS durchgeführt werden unter Verwendung von Bulk nicht gereinigt Kulturen sein, aber es sollte erkannt werden, dass diese eine Mischung aus metazyklisch und weniger ansteckende Formen enthalten.
In der Regel 15-20% der Großteil der stationären Phase L. i. chagasi Kulturen werden als metacyclics mit Parasiten, die innerhalb von 3 Wochen wurden von einem Hamster oder Maus isoliert erholt. Parasiten werden durch Zentrifugation gewaschen, um die gewünschte Konzentration in Puffer (HBSS oder PBS mit oder ohne Ca 2 + und Mg 2 +), und bei 4 ° C für bis zu 2 Stunden vor der Impfung in der Maus.
3. Wahl der Fahrspur für die Impfung von Leishmania spp. in den Wirt
Die klinische Symptomatik der menschlichen Leishmaniose variieren sowohl auf die Art von Parasit und Wirt Faktoren abhängig. Es gibt entsprechende Unterschiede in murine Infektion, führender Forscher auf unterschiedliche Modelle und Wege der Infektion verwendet werden. Zum Beispiel sind Arten verursachen menschliches CL (zB L. major, L. mexicana, L. amazonensis) oft in Mäusen subkutan in die Fußsohle oder intradermal in das Ohr geimpft. 8,9 Species verursacht menschlichen VL oft intravenös über einen Schwanz eingeführt Vene 10-12 oder intradermal in das Ohr. 13 Schwanzvene Infektionen wurden entweder mit Hamster-derived Amastigoten oder mit Promastigoten durchgeführt. Wir routinemäßig infizieren Mäuse mit dem promastigote Form von L. i. chagasi, entweder intradermal in das Ohr oder lateralen Fußwurzel Bereich 14 oder intravenös.
4. Pre-Behandlung von Mäusen mit Betäubung
Wild-Typ, transgenen oder Knockout-Mäusen verwendet werden kann. Obwohl formal nicht quantifiziert, so scheint es sehr wahrscheinlich, dass nackt oder Albino wie BALB / c-Mäusen für eine größere Lichtdurchlässigkeit durch das Gewebe im Vergleich zu Mäusen mit dunkler Haut und Haare Pigment wie C57BL / 6 zu ermöglichen.
Injizierbare anesthestic Mittel wie eine Mischung aus Ketamin und Xylazin [80-100 mg / kg + 10 mg / kg bzw. intraperitoneally (ip)] in Kochsalzlösung verdünnt ist eine bevorzugte Methode, da die Tiere werden leicht betäubt für mindestens 10 Minuten mit einer einzigen Dosis. 100-200 &mgr; l Gesamtvolumen ip injiziert Verwendung von 25-30 Gauge-Nadel. Die Tiere werden von Hand fest an ihrem dorsalen Haut mit ihren Bauch hielt und den Kopf nach unten gerichtet. Die Nadel sollte mit der Fase nach oben und leicht schräg positioniert werden. Die Spitze der Nadel sollte nur leicht eindringen linken unteren Quadranten der Bauchdecke.
Eine Inhalations-Anästhetika wie Isofluran kann abwechselnd verwendet werden, aber Tiere werden nur unter Narkose bleiben, solange sie das Einatmen der Narkosemittel.
5. Die Infektion von Mäusen mit Leishmania spp. Parasiten
Sobald die Tiere leicht betäubt sind, sind die Infektion Standorte mit 70% Ethyl-oder Isopropylalkohol gereinigt. Der Parasit Spezies, Dosis und Infektionsweg ist vom Prüfer bestimmt. Das Injektionsvolumen sollte minimiert werden, um übermäßige Gewebeschäden für die intradermale (10 ul) oder intramuskulär (25-50 ul) Infektionswege zu verhindern. Die zulässige Injektionsvolumina in Mäusen größer sein kann für die intravenöse (100-200 ul), subkutane (bis zu 2 ml) oder intraperitoneal (bis zu 2 ml) Infektionswege.
Infektionswege und Volumina in unseren Experimenten verwendet werden, umfassen intradermal in die Ohrmuschel (10 ul), subkutan in die Flanke (100-200 ul), intraperitoneal (100-200 ul) oder intravenöse (100-200 ul). Parasite Dosen von 10. Februar - 10 Juli Promastigoten reichten.
2. Bioluminescent Bildgebung von Leishmania mit dem IVIS (in vivo Imaging-System)
1. Herstellung von D-Luciferin in vivo Biolumineszenz Bildgebung
D-Luciferin (Caliper LifeSciences) ist zu einer Konzentration von 15 mg / ml in Dulbeccos PBS mit oder ohne Mg 2 + rekonstituiert und Ca 2 + und Spritze filtriert (0,2 &mgr; m). Aliquots werden bei -80 ° C bis zur Verwendung eingefroren. Vor der Injektion ist Luciferin bis 37 ° C im Wasserbad erwärmt.
2. Die Injektion von D-Luciferin
Die Einstichstelle wird gereinigt und Luciferin ist in bewusste Tiere durch eine intraperitoneale Injektion von 15 mg / ml Luciferin-Lösung in DPBS eingeführt, bei einer Dosis von 150 mg / kg. Luciferin kann auch in Narkose behandelten Tieren injiziert werden, aber die Biolumineszenz-Kinetik können leicht variieren.
Sobald sie in Tiere injiziert, zirkuliert Luciferin schnell. Es ist sinnvoll, empirisch zu ermitteln den optimalen Zeitpunkt für Lumineszenz-Daten nach Luciferin Einspritzung für jeden experimentellen Modell und unterschiedlichen anatomischen Stellen der Mäuse zu erwerben, da die Kinetik der Luciferin Verteilung kann variieren. Eine kinetische Kurve ist durch den Erwerb einer Abfolge von replizieren Bilder erzeugt.
3. Die Tiere sind leicht narkotisierten
Inhalations-oder Injektionsnarkosemittel kann für die bildgebenden Verfahren eingesetzt werden. Isofluran ist einfacher, zu diesem Zeitpunkt zu verabreichen, da die meisten IVIS Systeme eine angehängte Anästhesie Kammer und Anästhesie Nasenkonus vielfältig in der Bildgebung Kammer haben. Die Anästhesie ist zwischen der Anästhesie Kammer und der vielfältigen in der Bildgebung Kammer aufgeteilt.
Die Tiere sind in der klaren Plexiglas Anästhesie Kammer platziert und leicht narkotisierten mit 2,5-3,5% Isofluran. Die Tiere sind visuell überwacht, um sicherzustellen, das ein Maß an Betäubung induziert wurde, und dass ihre Atmung behindert wird. Ausreichendes Maß an Betäubung durch einen Mangel an Rückzug aus dem schmerzlichen paw Druck überprüft. Der Betrag von Isofluran kann 1,5-2% reduziert werden, nachdem die Tiere leicht betäubt sind.
4. Bioluminescent Daten werden gesammelt
Ausreichend narkotisierten Tiere sind aus der Narkose Kammer zur Bildgebung überführt und so positioniert, dass die Nase Kegel am Verteiler wird eine kontinuierliche und geregelte Fluss von Isofluran liefern.
The Living Image Software-Programm (Caliper Life Sciences) wird geöffnet und der IVIS initialisiert wird. Für unsere Experimente nutzen wir die Xenogen IVIS 200-System (Caliper Life Sciences). Die CCD-Kamera wird automatisch gekühlt werden und bei entsprechender Temperatur gehalten nach der Initialisierung des IVIS. Die Kamera-Setup und Bildaufnahme Parameter sind in der IVIS System Control Panel eingestellt. Die Aufnahme-Parameter sind weitgehend von der Anzahl der Tiere und die Intensität der Biolumineszenz auf. Wichtige Parameter sind: Imaging-Modus (Lumineszenz-oder Fluoreszenz), Belichtung (Zeit, dass der Verschluss geöffnet ist), Binning (bestimmt die Pixelgröße auf dem CCD), Fokus und unterliegen Höhe (Brennebene), f / stop (Maschenweite) und Field of View (FOV). Die voreingestellte FOVs (Platz Bildbereiche) für die IVIS Imaging System der Serie 200 sind 4, 6,5, 13, 20 und 25 cm (Breite FOV).
Drücken erwerben oder erwerben kontinuierliche Fotos im IVIS System Control-Fenster initiiert Bild-und Datenerfassung auf der IVIS. Erfassungszeiten kann zwischen wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten. Für unsere Experimente nutzen wir die 60 Sekunden default Belichtungseinstellung.
Ein Close-up Bild (kleine FOV) kann eine größere Auflösung, aber nicht unbedingt eine erhöhte Empfindlichkeit auf ein Bild aufgenommen mit einer größeren FOV verglichen.
Nach der bildgebenden Verfahren, sind Tiere aus der Imaging-Kammer entfernt, kehrten in ihre Käfige und überwacht, bis sie wieder aus der Narkose.
7. Datenanalyse
Die Lumineszenz-Daten unter Verwendung des Lebens-Image Software (Xenogen) und entspricht der Lichtintensität als die Anzahl der Photonen, die durch die CCD-Kamera detektiert ausgedrückt. Diese Daten werden von einem Pseudo-Farbbild, das auf einem Schwarz-Weiß-Foto von den Tieren überlagert dargestellt. Bestimmte Bereiche des Bildes kann durch die Schaffung von regions of interest (ROI) analysiert werden. The Living Image Software hat eine Vielzahl von Daten Output-Optionen. Eine der einfachsten Möglichkeiten, um die Daten zu analysieren ist eine region of interest (ROI) aus und misst die durchschnittliche Anzahl der Photonen / Sekunde, dass erkannt wird. Diese Daten können dann an einer Tabellenkalkulation wie Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation) exportiert werden. GraphPad Prism (GraphPad Software) wurde anschließend verwendet, um Grafiken für das Manuskript zu generieren.
3. Repräsentative Ergebnisse
Zusammenfassung:
IVIS-Technologie ermöglicht die Visualisierung von Luciferase-exprimierenden Leishmania spp. Parasiten in lebenden anästhesierten BALB / c-Mäusen in Echtzeit. Sobald das Substrat Luciferin vertreibt durch Gewebe, verursacht die schnelle Oxidation von D-Luciferin durch Luciferase durch die transgene Parasiten ausgedrückt Licht emittiert wird. Die Photonen, die nicht durch das Gewebe absorbiert werden an der Oberfläche des Tieres durch die CCD-Kamera des IVIS Imaging-Technologie erkannt.
1. Modelle von Infektionen mit Parasiten verursacht menschlichen viszeralen versus menschliche kutane Leishmaniose.
Murine Modelle der viszeralen Leishmaniose sind viel problematischer als Modelle der kutanen Leishmaniose, da der Fortschritt der Infektion erfordert Euthanasie von Gruppen von Mäusen zu jedem Zeitpunkt zu beurteilen. Eine Einschränkung der IVIS ist, dass Licht-Emissionen in unterschiedlichem Ausmaß in verschiedenen viszeralen Geweben abgeschreckt und Geweben mit hoher Blutfluss wie Leber und Milz kann problematischer als die Haut. Daher kann IVIS nicht so empfindlich für den Nachweis von Luciferase-exprimierenden Parasiten in Leber und Milz, wie in der Haut. Es ist auch darauf hingewiesen, dass Parasiten Lasten sollten nicht zwischen Gewebe Standorte verglichen werden. Dennoch können Parasiten Belastungen in den gleichen Geweben zwischen gleichaltrigen infizierten Mäusen des gleichen Stammes verglichen werden.
Die Luciferase-Signal wurde leicht in inneren Organen in unseren Experimenten festgestellt, erleichtert Vergleich von Infektionen zwischen den Tieren. Ein Beispiel für eine 5-wöchige Infektion mit einem Luciferase-exprimierenden Parasiten verursacht menschlichen viszerale Leishmaniose, Li. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (A), ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach 5 Wochen der Infektion kann visceralized Parasiten in der Leber von allen Mäusen und in der Milz von Mäusen 1 und 2 erkannt werden. Abbildung 2 zeigt eine Dosis-Titration mit dem gleichen Parasiten Linie, eine Stunde nach der Einführung des Parasiten. Ein Beispiel für eine Längs-Infektion mit Parasiten verursacht menschlichen kutane Leishmaniose, L. mexicana SSU/IR1SAT-LUC (A), ist in Abbildung 3 dargestellt.
2. Kinetik der Luciferase-Erkennung.
Vorläufige kinetische Untersuchungen sind unerlässlich, um den Nachweis von Photonen aus dem Biolumineszenz Parasiten emittiert maximieren. Es ist wichtig, diese empirisch zu ermitteln, wie die optimale Belichtungszeit wahrscheinlich variieren je nach Anzahl und Helligkeit des Parasiten zu isolieren und von der anatomischen Lage der leuchtenden Mikroorganismen in Mäusen. Die kinetische Untersuchungen sind abhängig von der Geschwindigkeit der Luciferin Verteilung in Geweben der Maus Gewebe beherbergen Luciferase-exprimierenden Leishmania, und die Effizienz der Luciferaseexpression / Enzymaktivität in jedem Parasiten zu isolieren. Mäuse infiziert sind und geimpft mit Luciferin, wie oben beschrieben, und eine Sequenz von Bildern wird alle 2 Minuten nach dem Luciferin Injektion gesammelt. Die Größenordnung der Licht emittiert wird quantifiziert und graphisch dargestellt, um die maximale Erkennung zu bestimmen (siehe Beispiel in Abbildung 1B). Sobald der Zeitpunkt der maximalen light detection ermittelt haben, sollten alle Bilder in das Experiment zur gleichen Zeit der Bildgebung nach der Impfung von Luciferin zu verwenden, wie in Abbildung 1A. Unsere kinetischen Untersuchungenzeigte eine Spitzenleistung Luciferase-Signal aus der Leber von Mäusen infizierten iv mit L. i. chagasi zwischen 10 und 25 Minuten nach ip Luciferin Impfung (Abbildung 1B).
3. Die Beurteilung der Effizienz der Parasiten.
IVIS kann verwendet werden, um die Konsistenz und Effizienz der Erstinfektion mit Luciferase-exprimierenden Leishmania spp schätzen. Solange die gleiche Strecke für jedes Tier verwendet wird, kann der emittierten Photonen als eine grobe Schätzung der Impfung Wirksamkeit verwendet werden. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 gezeigt, in dem BALB / c Mäusen, die mit der angegebenen Anzahl von metazyklisch L. inokuliert i. chagasi Promastigoten, ein visceralizing Arten von Leishmanien. Eine Stunde nach der Infektion wurden die Mäuse mit Luciferin ip inokuliert und nach 20 Minuten Bilder aufgenommen wurden. Die Abbildung zeigt die Schwarz-Weiß-Bild alleine (Abbildung 2A) und das Bild mit pseudo-farbigen Lumineszenz (Abbildung 2B) überlagert. Abbildung 2C zeigt die Anzahl der Photonen aus ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) von der Maus Bilder emittiert.
Das Beispiel in Abbildung 2 zeigt, dass die Infektion Dosis direkt proportional zu der Abstufung von Photonen mit einer zunehmenden Zahl von Parasiten abgegeben wird. Die Daten zeigen, dass, ähnlich wie bei L. Haupt-und L. mexicana, Bildgebung des kutanen Infektionen mit Leishmania spp. ist sehr empfindlich, so dass weniger als 10 4 Parasiten werden übersichtlich visualisiert. Daten wie diese können verwendet werden, um Infektionen Intensität zu quantifizieren. In dem Beispiel in Abbildung 2B gezeigt, gibt es ca. 1 Photonen / sec / Parasit.
4. Die Überwachung der Verlauf der Infektion in Mäusen.
Murine Modelle der kutanen Leishmaniose charakteristisch verwenden Läsionsgröße als eine Maßnahme, um Infektionen in Längsrichtung zu folgen. Obwohl eine gute Schätzung des Fortschreitens der Krankheit ist Läsionsgröße durch den Grad der entzündlichen Reaktion zusätzlich zu den von Parasiten Replikation im Gewebe beeinflusst. Mäuse müssen am Ende des Experiments, um tatsächlich zu messen, Parasiten Last eingeschläfert werden. IVIS kann verwendet werden, um das Fortschreiten der Parasit Lasten in Längsrichtung Schätzung in Hautgewebe von Mäusen mit Leishmania Spezies, die kutane Leishmaniose verursachen infiziert werden. Nachgewiesene in Abbildung 3 wurden BALB / c Mäusen subkutan am Tag 0 mit 10 5 L. geimpft mexicana, die Luciferase und abgebildet auf die sequentielle Wochen nach der Infektion. Abbildung 3A zeigt repräsentative Bilder in 10-31 Wochen nach der Infektion. Die gleichen Daten werden in quantitative Form in Abbildung 3B gezeigt. Wichtig ist, dass die Zahl der Parasiten am Ort der Infektion durch IVIS quantifiziert werden, bevor eine Läsion nachweisbar ist mit anderen Methoden.
Im Laufe der Zeit entspricht die progressive Zunahme der Biolumineszenz zu einem Anstieg der Parasit Zahlen. Die Signalstärke, dh Photonen / Parasiten / Sekunde, kann als eine Funktion von Parasiten Zahlen-, Gewebe-Lage, Wachstumsphase und Parasiten Gesundheit in vivo variieren. Es ist daher wichtig, die Beziehung zwischen Parasiten und Lumineszenz vor davon aus, dass Biolumineszenz ist direkt proportional zur Anzahl Parasiten zu kalibrieren. Im Fall von L. große 15 oder L. mexicana, 16 scheint es relativ wenig Dämpfung von Biolumineszenz werden in Amastigoten im Fußballen Läsionen gegenüber Promastigoten. Vorläufige Daten legen nahe, dass Dämpfung kann tiefer für L. chagasi infantum 17 oder für L. braziliensis. 15
Abbildung 1. Kinetik der Luciferase-Erkennung. Kinetische Analyse von Luciferin Verteilung wurde durchgeführt, um den optimalen Zeitpunkt für die Bildgebung Leishmania Infektion in der Leber zu etablieren. Die Mäuse wurden infiziert iv mit 10 7 L. i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). A) Vier infizierten Mäuse wurden zusammen mit einer nicht infizierten Maus nach 5 Wochen der Infektion abgebildet. Luciferin wurde ip in allen fünf Mäusen und Bilder injiziert wurden gesammelt alle zwei Minuten für 24 Minuten. ROI wurden ausgewählt und Lumineszenz wurde gemessen und quantifiziert (B).
Abbildung 2. Die Beurteilung der Effizienz der Parasiten. Imaging und Quantifizierung Biolumineszenz Leishmania-Parasiten während der Infektion mit IVIS. Wild-Typ BALB / c-Mäuse wurden intradermal in die untere rechte Flanke mit HBSS (mock) oder transgenen Leishmania i. injiziert chagasi L. i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). Die Mäuse wurden dann mit dem IVIS Imaging-Technologie 1 Stunde nach der Impfung untersucht. A) Eine schwarz-weiße Fotos der Mäuse wurde unmittelbar vor der Lumineszenz-Signal (Helligkeit) gemessen wurde übernommen. Rote Pfeile weisen auf die Injektionsstelle auf jederTier. B) Die Falschfarben-Bild der Lumineszenz wurde auf das Foto gelegt. C) Regions of Interest (ROI) ausgewählt wurden (rote Kreise) und die Lumineszenz in jeder ROI quantifiziert. Die Daten stellen die Netto-Lumineszenz von infizierten ROI abzüglich der ROI von mock infiziert.
Abbildung 3. Langfristige Infektion mit Parasiten verursacht menschlichen kutane Leishmaniose. Zeitlicher Verlauf Auswertung der parasitären Belastung bei einem Tier mit Biolumineszenz Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A) injiziert. A-Wildtyp BALB / c-Maus wurde subkutan in den Sprunggelenken mit 100.000 stationäre Phase transgenen Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A) injiziert. IVIS Daten wurden aus den infizierten Maus an die angegebene Anzahl von Wochen nach der Infektion gesammelt. A) Pseudo-farbigen Bilder der Lumineszenz wurden auf Schwarz-Weiß-Fotografien aus den entsprechenden Zeitpunkten überlagert. B) Die Netto-Rendite wurde durch Messung Lumineszenz in den infizierten Sprunggelenk und Subtrahieren Hintergrund ROI von der Gegenseite nicht infizierten Sprunggelenk wurde graphisch ermittelt. Das Punktdiagramm stellt net ROI zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion.
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Discussion
Die in vivo Imaging System (IVIS) stellt ein Verfahren zum ganzen Tier Bildgebung oder in-vivo-Bildgebung experimenteller Infektion Modelle der verschiedenen Formen der Leishmaniose. 18,16 Die Leishmania spp. Parasiten können gentechnisch Glühwürmchenluciferase auf einem Niveau, dass in vivo mit dem IVIS Imaging-Technologie erkannt wird ausdrücklich erklärt werden. Einer der wichtigsten Vorteile dieser Methode ist, dass es nicht-invasive Visualisierung von Leishmania spp ermöglicht. innerhalb des lebenden Tieres Host. Diese Methode hat sich auf andere Infektionskrankheiten Modelle angewandt worden, mit Infektionserregern, dass Transgene ausdrücken können. 19 20 Darüber hinaus IVIS als Modell wurde verwendet, um medikamentöse Therapie von Leishmania major Infektion in der Haut von C57BL / 6 Mäusen zu bewerten. 16,21
Es gibt einige wichtige Einschränkungen und Grenzen dieser Methode. Die Stärke des Lichtsignals von der CCD-Kamera detektiert werden kann durch die Lage der Parasiten innerhalb der Säugerwirt, durch die Stärke der Luciferase-Expression in den Parasiten, durch die Verfügbarkeit von Co-Faktoren für die Oxidationsreaktion von D-Luciferin betroffen sein und durch Absorption von Licht durch darüber liegende Gewebe. Darüber hinaus wird die Signalstärke in Leber und Milz schwächer auf der Ebene der Photonen pro Parasiten pro Sekunde als das Signal in die Haut, wahrscheinlich aufgrund Abschrecken von lokalen Blutversorgung und die darüber liegende Gewebe. Die Quantifizierung der emittierten Photonen verwendet werden, um progressive Infektion bei einem Tier im Laufe der Zeit oder im gleichen Gewebe zwischen den Tieren zu vergleichen. 16 jedoch bis auf weiteres optimiert, so werden diese Vorbehalte schränken die Empfindlichkeit und damit den Nutzen der Methode für die quantitative Beurteilung der tiefen Infektionen mit dem visceralizing Leishmania spp. Schließlich werden die Bilder wahrscheinlich schwächer in schwarz (zB C57BL / 6) Mäuse als in weiß (zB BALB / c) Mäuse. Das Rasieren der Haare aus der Haut über dem Bereich von Interesse sein kann hilfreich bei der Erkennung des Signals vom schwarzen Mäusen.
Weitere Überlegungen sind die Notwendigkeit, die IVIS als quantitatives Maß der Parasit Lasten zu überprüfen. Vergleiche zwischen Mikroskopie, qPCR und IVIS haben in einigen Fällen gemacht, würde aber mit jedem System die Verwendung der Methode als Maß für die Progression der Erkrankung zu validieren benötigt werden. 22 16 Neue Methoden zur Bildgebung entstehen, was zu gekoppelt werden Biolumineszenz Bilder. 16 Zusätzlich zu transgenen Parasiten, können tierische Wirte entwickelt, um Biolumineszenz oder fluoreszierende Moleküle zu exprimieren. Zukünftige Studien mit dieser Technik könnten Tiere zum Ausdruck Transgene in spezifischen zellulären Kompartimenten zu Wirtsfaktoren in Pathogenese und Parasiten gleichzeitig beteiligt zu erkennen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Merit Bewertung Zuschuss aus dem Department of Veterans Affairs finanziert, die von NIH gewährt AI045540, AI067874, AI076233-01 und AI080801 (MEW), und durch AI29646 (SMB). Die Arbeit wurde zum Teil während der Finanzierung von CT und JG von NIH T32 AI07511 durchgeführt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent |  Caliper Life Sciences |
122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper Life Sciences |
Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
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