De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie

Summary

Drosophila Schneider (S2)-cellen zijn een steeds populairder systeem voor de ontdekking en functionele analyse van genen. Ons doel is het beschrijven van een aantal van de microscopische technieken die S2 cellen te maken die een steeds belangrijker experimenteel systeem.

Abstract

De ideale experimentele systeem zou zijn goedkoop en gemakkelijk te onderhouden, vatbaar voor een verscheidenheid aan technieken, en zou worden ondersteund door een uitgebreide literatuurstudie en de genoomsequentie database. Gekweekte Drosophila S2 cellen, het product van gedistantieerd 20-24 uur oude embryo's ^1, bezitten al deze eigenschappen. Bijgevolg, S2 cellen zijn uitermate geschikt voor de analyse van cellulaire processen, waaronder de ontdekking van de genen die coderen voor de moleculaire componenten van het proces of mechanisme van belang. De kenmerken van S2 cellen die het meest verantwoordelijk zijn voor hun nut zijn het gemak waarmee ze worden onderhouden, hun gevoeligheid voor exquise dubbelstrengs (ds) RNA-gemedieerde interferentie (RNAi), en hun volgzaamheid aan fluorescentie microscopie als live of vaste cellen.

S2 cellen kunnen worden gekweekt in een verscheidenheid aan media, waaronder een aantal goedkope, in de handel verkrijgbare, volledig gedefinieerd, serum-vrije media ^2. Daarnaast, ze groeien optimaal en snel bij 21-24 ° C en kan worden gekweekt in een verscheidenheid van containers. In tegenstelling tot de cellen van zoogdieren, hoeft S2 cellen niet nodig een geregelde atmosfeer, maar in plaats daarvan doen het goed met normale lucht en kan zelfs worden gehandhaafd in verzegelde flessen.

Als aanvulling op het gemak van RNAi in S2 cellen is de mogelijkheid om gemakkelijk experimenteel geïnduceerde fenotypes analyseren door fase of fluorescentie microscopie van vaste of levende cellen. S2 cellen groeien in de cultuur als een monolaag maar niet tonen contact remming. In plaats daarvan, cellen hebben de neiging om te groeien in kolonies in dichte culturen. Bij een lage dichtheid, S2 culturen geteeld op glas of weefselkweek behandelde plastic zijn rond en losjes bevestigd. Echter, de cytologie van de S2-cellen sterk verbeterd worden door hen ertoe te uitgebreid plat door kort kweken ze op een oppervlak bedekt met de lectine, Concanavaline A (ConA) ^3. S2 cellen kunnen ook stabiel getransfecteerd worden met fluorescent-gemerkte markers te labelen structuren of organellen van belang in levende of vaste cellen. Daarom is de usual scenario voor de microscopische analyse van cellen is dit: ten eerste, S2-cellen (die kan bezitten transgenen te getagd markers te uiten), worden behandeld door RNAi naar een doelwit eiwit (s) te elimineren. RNAi behandeling tijd kan worden gecorrigeerd voor verschillen in eiwit-turn-over kinetiek en naar cel trauma / overlijden te minimaliseren als het doel eiwit is belangrijk voor de levensvatbaarheid. Vervolgens worden de behandelde cellen overgebracht naar een schotel met een dekglaasje aan pre-gecoat met ConA tot cellen te verspreiden induceren en strak houden aan het glas. Tot slot worden de cellen afgebeeld met de keuze van de onderzoeker van de microscopie modi. S2-cellen zijn bijzonder goed voor studies die uitgebreide visualisatie van levende cellen, omdat deze cellen gezond te blijven bij kamertemperatuur en normale atmosfeer.

Protocol

1. Voorbereiden S2 cellen voor microscopie

Schneider S2 cellen waren afkomstig van getrypsineerd late embryo's van Oregon R Drosophila. Oorspronkelijke cultuur Schneider bestond uit een mengsel van celtypen, maar werd steeds homogener bij voortzetting van de passage ^1. Ze zijn beschreven als macrofaag-achtige (zij zijn fagocyterende) met hemocyte-achtige genexpressie. S2 cellen kunnen worden verkregen bij de ATCC, DGRC of Invitrogen.

A. Selectie van groeimedium

Een aantal van de media zijn gebruikt om de cultuur S2 cellen. Geen van de hieronder vermelde media vereisen een 5% CO ₂ atmosfeer.

1. Schneider oorspronkelijk gebruikt haar beschreven medium (Schneider Drosophila medium) aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal bovine serum (FBS). Terwijl FBS maakt dit medium duurder is dan de serum-vrije media hieronder genoemde, heeft het relatief lage autofluorescentie en is dus een goede keuze voor epifluorescentie microscopie van levende cellen. Echter, het bevat voldoende metaal op een laag niveau van expressie van de transgenen te stimuleren onder controle van de induceerbare metallothioneïne promoter (bijvoorbeeld, genen gesubkloneerd in Invitrogen's bet vector), waardoor "lekkende" expressie van het gen voor de inductie.
2. Meerdere serum-vrije media zijn commercieel verkrijgbaar (bijvoorbeeld Sf900 II, Hyclone SFX-Insect, en Insect-Xpress). Deze media zijn relatief goedkoop, maar meestal te stimuleren hogere niveaus van expressie bij het gebruik van metallothioneïne promotor-gereguleerde transgenen in vergelijking met medium Schneider. Bovendien zijn deze media significante autofluorescentie in vergelijking met medium Schneiders '/ FBS (een belangrijke overweging bij het uitvoeren van live cell fluorescentie microscopie).
3. Optioneel kan antibiotica worden toegevoegd aan het medium, deze zijn meestal penicilline G en streptomycine sulfaat (50-100 eenheden / ml en 50-100 ng / mL uiteindelijke concentraties, respectievelijk). Ook kan de anti-schimmel reagens, amfotericine B, worden toegevoegd aan 250 ng / mL (eindconcentratie).

B. Cultuur voorwaarden

S2 cellen zijn gemakkelijk te onderhouden onder normale laboratorium temperatuur en atmosferische omstandigheden. Bij de beeldvorming S2 cellen voor langere tijd wonen, de voornaamste oorzaken van celdood zijn uitdroging en foto-toxiciteit. Uitdroging is eenvoudig te voorkomen door voldoende medium in de schotel op de microscoop. Foto-toxiciteit is een lastiger probleem waarvoor het minimaliseren van de cellen 'cumulatieve blootstelling aan hoge intensiteit, hoge-energie-licht terwijl de beeldvorming vaak genoeg naar interessante gebeurtenissen vast te leggen met voldoende ruimtelijke en temporele resolutie.

1. S2 cellen groeien op weefselkweek plastic zijn over het algemeen afgerond en losjes aanhanger. Confluente cellen groeien als een dichte monolaag en dan, in toenemende mate, meer cellen zullen opstijgen en groeien in suspensie. Voor microscopie van zowel vaste als levende cellen, is de beeldvorming sterk verbeterd als de cellen worden geïnduceerd te vlakken op het dekglas. Deze truc is zoals hieronder beschreven (2. A. 2.).

2. Microscopie van S2 cellen

A. Levende cel microscopie

We maken gebruik van omgekeerde microscoop om te leven S2 cellen uitgeplaat op glas-bodem gerechten te visualiseren. De glazen bodem gerechten hieronder beschreven zal de cellen in een toestand vergelijkbaar met het kweken van hun normale toestand, en maakt het ook mogelijk levende cellen moeten worden onderzocht door middel van microscopie-grade glas.

1. Voorbereiding van de glazen bodem gerechten
   
   Componenten:
   1. Sylgard 184 siliconenelastomeer kit
      Dit is de lijm om de dekglaasjes hechten aan de gerechten. De kit heeft een uit twee delen, de hars basiscomponent en de verharder, die worden gemengd in een 10:1 (hars: verharder) gewichtsverhouding net vóór gebruik.
      Ter voorbereiding op de hars / verharder mengsel:
      1. Weeg ongeveer 5 g van de hars in een plastic weegt boot. Let op het gewicht van de hars.
      2. Bereken hoeveel verharder is nodig door vermenigvuldiging van het hars gewicht met 0,1. Voeg dit bedrag van de verharder om dezelfde wegen boot met behulp van een nieuwe transfer pipet.
      3. Roer grondig mengen van de componenten. Maak je geen zorgen over de belletjes die verschijnen, ze zullen langzaam verdwijnen.
      4. De lijm is nu klaar. Het heeft een honing-achtige consistentie en zal bruikbaar zijn voor minstens een uur. 5,5 g van de lijm is voldoende om ongeveer 75 gerechten te maken, maar dit hangt af van hoe gierig je bent bij het toepassen van de lijm.
   2. Plastic 35mm petrischalen
      Wij gebruiken geen celkweek klas gerechten, omdat we alleen geïnteresseerd in het hebben van cellen hechten aan de glazen bodem (en niet de plastic) - dus in plaats daarvan gebruiken we goedkopere, standaard petrischalen. Sommige microscoop stadia van ronde klemmen tot 35 te houdenmm gerechten, als je dit hebben, er zeker van zijn dat uw gerechten zal de klem past. Verrassend, niet alle 35mm gerechten hebben dezelfde buitendiameter.
   3. Afdekglas
      Kies dekglaasjes past bij uw microscoop en behoeften. Alles wat van dure speciaal glas met foto-geëtst grids (bv. Electron Microscopy Sciences, 23x23 mm ronde, gerasterde, nee. 2, cat. Nee. 72264-23) te veel goedkopere bulk dekglas (bv, VWR, 22x22 mm vierkant glas , nee. 1.5, cat. nee. 48366-227) kunnen worden gebruikt. Let op: Het glas moet iets groter (tenminste ongeveer 1 mm) dan het gat dat je maakt in een petrischaal, en moeten ook kleiner zijn dan de diameter van de schotel. Als u van plan bent vierkant glas te kopen, zorg ervoor dat het glas volledig zal dekken (en uit te breiden een beetje verder) de ronde gat, maar zal niet bij de zijkanten van de schotel. Als u liever uw dekking glas te reinigen, dat doen voordat lijmen ze aan de gerechten.
   4. Boormachine
      We maken gebruik van een handboor met variabele snelheid en een lock-on knop voor continu gebruik. Boren gerechten is veel gemakkelijker met een boor pers, maar kleinschalige productie van glazen bodem gerechten niet rechtvaardigt de aanschaf van een kolomboormachine.
   5. Boor
      Gebruik een ¾ inch spade boor (een houtboor is afgebeeld op deze pagina: http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit). Natuurlijk, de diameter van het bit is bepalend voor de diameter van het gat in de bodem van de schaal.
   6. Conische slijpen boor
      Gebruik een kegelvormige slijpen bit met een grove korrel en een diameter van ongeveer hetzelfde als de spade bit. Nadat alle gaten zijn geboord, kunt u deze iets naar boor weg plastic stukjes aan de rand van het gat dat project van de bodem van de schotel. Plastic fragmenten op de buitenkant van de schotel wordt voorkomen dat de dekking van glas van zitten vlak tegen de schotel. Maak je geen zorgen over de kleine plastic stukjes omhoog in het interieur van de schotel op steekt: ze zullen geen invloed op de dekking van glas of de cellen.
   7. Piepschuim doos met dikke muren
      Dit wordt gebruikt als het boren oppervlak. Betrekking hebben op een buitenzijde van de piepschuim doos met stroken afdichtingsband (we gebruiken 1,5 inch Scotch plakband), de tape minimaliseert het ontsnappen van stukjes piepschuim tijdens het boren.
   
   Montage
   1. Plaats de onderste helft van een 35mm Petrischaal op geplakt het piepschuim box het oppervlak, plaats de schotel dus dat is de onderkant is tegen het piepschuim doos. Terwijl u de zijkanten van de schotel stevig, boor een gat in de schotel. Let op: Je vingers die de schotel zal een fractie van een centimeter zijn van een draaiende boor. Natuurlijk, dit is gevaarlijk. Stop boren als het gerecht begint te draaien. Als je een kolomboormachine en / of een slimme manier om de schotel stevig vast te houden, gebruik ze. We hebben nog nooit een ongeluk gehad, maar doen wat je nodig hebt om deze procedure veilig is.
   2. Na het boren van al uw gerechten, gladde buiten de rand van de gaten met behulp van de slijpen boor. Plaatsen we de elektrische boormachine op zijn kant, met het bit te projecteren over de rand van de teller. De boor is op zijn plaats gehouden door het plaatsen van iets zwaars, maar soepel op (we gebruiken een zware plastic zak met 10 kg zand). Gebruik maken van de lock-on-knop te houden de boor continu draait, en vervolgens glad de randen van al uw gerechten door te oordelen elk gerecht en verplaatsen het tegen de slijpen bit om een ​​soepele weg de ruwe rand van het nieuwe gat.
   3. Zet de schotel alle bodems in een grote bak en spoel ze meerdere keren met gedestilleerd water om de kleine, losse stukjes plastic of piepschuim (die blijft drijven) te verwijderen. Daarna lag de schotel bodem uit te drogen.
   4. Als de vaat droog zijn, de voorbereiding van uw Sylgard 184 lijm. Breng een kleine kring van lijm rond het boorgat op de buitenzijde van elk gerecht. Niet veel lijm nodig is, in feite, te veel lijm zal een puinhoop maken. Leg een deksel glas over het gat, in contact met de lijm. Het deksel glas dient te zitten tegen de schotel soepel en gelijkmatig. Als de lijm was niet perfect verdeeld over het gat, dan is er misschien kleine openingen waar de lijm ontbreekt tussen het dekglas en schotel bodem. In eerste instantie geen zorgen te maken over deze openingen, meestal de lijm zullen kruipen in deze lacunes te vullen.
   5. Na het verlijmen op alle dekglas, ga terug en controleer de gerechten voor lacunes die niet zijn afgesloten door de lijm. Op elk gat, breng een kleine schar van lijm op de rand van het dekglas de buurt van de kloof, de lijm zal lont in het gat.
   6. Zet de gerechten, onderkant omhoog, om te drogen. Dit kan een dag of meer bij kamertemperatuur, maar u kunt de genezing te verhogen door de invoering van de gerechten in een warme couveuse.
   7. Als u steriele gerechten, zet de schotel bodems en deksels in een weefselkweek kap en spreid ze uit. Kom niet met de deksels op de schotel bodems. In plaats daarvan, zo draai de stukken die hun innerlijke oppervlakken dire zijnctly tegenover de UV-lamp. Zet de sterilisatie UV-licht voor ten minste 45 minuten. Als u van plan bent ConA de vacht van de gerechten (zie hieronder), niet steriliseren van de gerechten pas nadat ze zijn gecoat.
   8. De gerechten zijn nu klaar voor gebruik.
2. Met behulp van Concanavaline A
   De lectine, Concanavaline A (ConA), bleek S2 cellen te stimuleren om plat tegen een oppervlak bedekt met ConA ^3. Bij de S2 cellen gezaaid op dekglaasjes bedekt met ConA, ze verspreiden en worden uitstekende exemplaren voor microscopie.
   1. Om ConA jas gewoon dekglaasjes, verspreid over het gereinigde dekglaasjes op de top van een stuk van Parafilm vastgeplakt aan een bench top. Plaats 10 μLs van een 0,5 mg / ml oplossing van ConA (in steriel water) op het oppervlak van elk dekglas, en dan verspreid het materiaal over de gehele bovenkant van het dekglas. Na het drogen, bewaren de dekglaasjes in een schone, droge container. Het gecoat glas kan gesteriliseerd worden met het UV-licht in een weefselkweek kap.
   2. Om ConA jas met glazen bodem gerechten, eveneens 10 μLs van de ConA oplossing verspreid op de bovenkant (dat wil zeggen, deksel gerichte zijde) van het glas. Na droging kunnen de gerechten worden gesteriliseerd zoals hierboven beschreven. ConA-gecoate gerechten of dekglaasjes worden bewaard bij kamertemperatuur en kan worden gebruikt maand na de bereiding.
3. Imaging
   1. Voorzichtig resuspendeer de RNAi-behandelde S2 cellen en overbrengen naar een ConA-coating, met glazen bodem schotel met 2 ml van medium. Gezonde cellen die de ConA gecoate dekglas contact zal strak houden aan het en beginnen te verspreiden. Dit proces moet duidelijk worden door het ongeveer 15 minuten, en moet compleet zijn met 45 minuten tot 1 uur. Merk op dat aangesloten cellen niet kan cytokinese uitvoeren door hun strakke gehechtheid aan de ConA-gecoate oppervlak en zal polyploïde loop van de tijd. Cellen gezaaid in ConA-coated gerechten gezond blijven voor langere tijd, maar zal niet vermenigvuldigen in deze gerechten.
   2. Na de cellen hebben aangesloten, kan het medium worden uitgewisseld als het oude medium is autofluorescente. Dit is misschien niet nodig zijn voor studies met behulp van confocale of deconvolutie microscopen of wide-field microscopen met een kleine diepte-van-veld doelstellingen.
   3. Aangezien de S2-cellen gezond zijn bij kamertemperatuur / normale atmosfeer, dan is er geen speciale voorwaarden of apparatuur nodig zijn wanneer de cellen op de microscoop. We nemen vaak lange time-lapse filmpjes van live-S2 cellen. In de praktijk is de looptijd van deze experimenten beperkt door de gebruikelijke problemen van fotobleken en fototoxiciteit.

B. Vaste cell microscopie

1. Glazen bodem gerechten vs duidelijk dekglaasjes: Elk van deze kan worden gebruikt bij de vaststelling cellen. Bij het gebruik van gewone dekglaasjes, een enkele ConA gecoate dekglas te plaatsen in een individueel 35mm schotel (die niet hoeft te weefselkweek rang), voeg 2 ml van media, en breng de RNAi-behandelde cellen in de schaal. Na de cellen hebben aan de dekglas, verwijder het medium, kort de cellen te wassen met een geschikte buffer (PBS werkt goed), en voeg het fixeermiddel (zie hieronder) aan het gerecht. Daarna kan het dekglas worden verwijderd uit de schotel en verder verwerkt, bijvoorbeeld door immunokleuring.
2. Fixatie: Een verscheidenheid van methoden zijn gebruikt om de cellen te repareren S2. De beste fixatie methode zal worden bepaald door hoe goed een fixatief behoudt kenmerken die van belang, zonder te vernietigen of te verliezen epitopen of gemerkte eiwitten. Sommige procedures vereisen een extractie stap voor fixatie in om de epitopen van een aantal eiwitten die zich in dichte of compacte structuren bloot te leggen. Sinds de S2 cel literatuur is vrij uitgebreid, is het meestal mogelijk om een ​​gepubliceerde methode om optimaal te repareren van je S2 celstructuur van belang.
   1. Methanol is een veel voorkomende fixeermiddel. De methanol moet koud (minstens -20 ° C) en watervrij (moleculaire zeven [type 3A] kan worden toegevoegd aan de methanol te abstract water). We chill ongeveer 300 ml watervrij methanol in een overdekte 1L bekerglas in een explosieveilige 20 ° C vriezer. Als de methanol koud is, haal hem uit de vriezer, al snel het medium te verwijderen uit de glazen bodem schaal (of schotel met een deksel slip), en vervolgens snel dompelen de schotel naar beneden in de methanol en het daarbij laten. De beker van methanol houdt meestal ongeveer een dozijn gerechten. Werken snel en de terugkeer van de beker (met de borden) om de vriezer zo snel mogelijk. Fixatie is compleet in 10-15 minuten. Daarna verwijdert u de gerechten uit de beker, giet alle methanol nog in hen, en hydrateren ze door de toevoeging van PBS / 0,1% Triton X-100. Ze zijn nu klaar voor standaard kleuringen.
   2. Formaldehyde is een andere veel voorkomende fixeermiddel. We maken gebruik van 10% formaldehyde in buffer (PBS is aanvaardbaar, maar gebruik maken van de buffer meest geschikt is om uw behoeften). We maken gebruik van deze relatief hoge concentratie van formaldehyde, omdat S2 cellengebrek aan cytoplasmatische intermediaire filamenten die anders zouden helpen handhaven celmorfologie en de organisatie tijdens het fixatie proces.
   3. Giet het fixeermiddel in een afval beker en was de vaste cellen met drie korte wassen van PBST (PBS + 0,1% TritonX-100).
   4. Voeg vervolgens 1 ml van het blokkeren oplossing om de cellen voor 15 minuten. We routinematig gebruik van 5% normaal geit serum in PBST.
   5. Giet de blockingbuffer en voeg primaire antilichaam (verdund in het blokkeren van oplossing) direct op de cellen. 100 ul van het antilichaam oplossing moet volledig bedekken van de cellen. Plaats het deksel terug op Petri schotel om verdamping van het antilichaam oplossing te voorkomen. Laat het antilichaam incuberen met de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Verwijder het antilichaam-oplossing en het uitvoeren van drie PBST wasbeurten. Gebruik een transfer pipet tot en met 2 ml van PBST toe te voegen aan het gerecht. Wacht 5 minuten tussen elke wasbeurt (geen behoefte om krul de schotel).
   7. Giet de laatste wasbeurt en voeg 100 ul van de secundaire antilichaam (verdund in het blokkeren van oplossing) direct op de cellen. Plaats het deksel terug op Petri schotel om verdamping van het antilichaam oplossing te voorkomen. Laat het antilichaam incuberen met de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   8. Verwijder het secundaire antilichaam en het uitvoeren van drie 5 minuten wassen met PBST. Na het storten van de laatste wassen, voeg een paar druppels van uw montage media naar keuze direct op de cellen. We maken gebruik van 0,1 M propylgallaat opgelost in een oplossing van glycerol: PBS (9:1) en bewaard bij 20 ° C. Plaats de Petri deksel en bewaar het gerecht in een donkere omgeving.

3. Beperkingen / problemen

Net als bij elke experimenteel systeem, zijn er beperkingen aan het gebruik van S2 cellen. De eerste, gekweekte S2 cellen meestal vertonen een lage mitotische index (ongeveer 1% in serum-vrije media), terwijl de mitotische indexen voor veel getransformeerde zoogdiercellijnen worden zo veel als tien keer hoger. Daarom, voor studies van mitotische fenotypes, S2 celculturen vereisen een langere zoektocht naar behoren-geënsceneerde cellen te vinden. Ten tweede, voor de celcyclus studies, medicamenteuze behandelingen zijn zeer effectief in het arresteren van S2 cellen tijdens bepaalde fasen van de celcyclus. Echter, verbindingen die omkeerbare cel-cyclus arrestatie effecten in gekweekte cellen van zoogdieren zijn niet gemakkelijk wash-out in S2 cellen. Zo zijn protocollen voor het synchroniseren van prolifererende S2-cellen niet vastgesteld. Ten derde, S2 cellen worden niet trekkende noch hebben ze weer epitheliale kenmerken.

4. Verwachte resultaten

Het grootste selling point voor de S2-cellen is hun nut als een modelsysteem. Zij zijn bijzonder nuttig voor de beoordeling van de cellulaire functies van uw eiwit van belang: S2-cellen worden behandeld met behulp van RNAi dsRNA dat gemakkelijk is (en relatief goedkoop), gesynthetiseerd in het lab, en ze dienen goed voor live cell analyse en voor immunofluorescentie van vaste cellen . Daarnaast is een belangrijk voordeel aan S2 cellen is het gemak waarmee ze kunnen worden gehandhaafd in het lab, met behulp van relatief goedkope serum-vrij medium en geen weefselkweek incubator.

Een typisch experiment zou betekenen plating S2 cellen in een geschikte weefselkweek container (zeg, een 6 of 96 wells-plaat), het toevoegen van zelfgemaakte dsRNA aan de putjes, en vervolgens in stand houden van de cultuur als de beoogde eiwitten worden langzamerhand uitgeput door RNAi. Afhankelijk van de doeleiwitten zijn uitgeput, de cellen kunnen een morfologische en / of gedragsverandering vertonen als gevolg van target eiwit knock-down. De tijd die nodig is om doelwit eiwit expressie te reduceren tot een minimum is specifiek voor het eiwit en moet worden bepaald door Western blotting.

Normaal gesproken S2 cellen niet strak houden aan plastic of glas, en dit zou een probleem vormen voor experimenten waarbij de microscopisch onderzoek van behandelde cellen. Echter, S2 cellen worden geïnduceerd om op grote schaal af te vlakken door simpelweg plating ze op een oppervlak bedekt met de lectine, Concanavaline A (ConA). Binnen een uur in de platen op ConA, hebben de meeste cellen verloren hun ronde uiterlijk als gevolg van verspreiding op grote schaal op de ConA oppervlak (figuur 1). De cellen zijn nu klaar voor verdere verwerking (bijvoorbeeld door fixatie en immunokleuring) of microscopische observatie van levende cellen.

S2 cellen kunnen ook worden getransfecteerd (met behulp van een verscheidenheid van chemische reagentia of elektroporatie) ofwel tijdelijk geven van een exogene gen of aan het gen stabiel integreren in het genoom (dus het creëren van een cellijn die de exogene gen door middel van herhaalde divisies onderhoudt). Transfecties kan dienen vele doeleinden, zoals de uitdrukking van de fluorescent gelabelde eiwitten dat merk structuren van de interesse in vaste of levende cellen (Figuur 2), of die worden gebruikt als aas in de in vivo pull-down of immunoprecipitatie experimenten, etc.

De methode van analyse is afhankelijk van couRSE, over de biologische vraag wordt aangepakt door het experiment. Een veel voorkomende methode voor de analyse van RNAi-behandelde cellen S2 is immunofluorescentie van vaste cellen (figuur 3). Bijvoorbeeld, wordt meestal gebruikt met immunofluorescentie genoom-brede schermen van Drosophila genbanken snel kan identificeren eiwitten met interessante activiteiten in vivo. De analyse kan worden gemaakt uitgebreider door gelijktijdig meerdere putten doelwit eiwitten in S2 cellen om de mogelijke functionele interacties tussen het doelwit proteïnen te onderzoeken. En de analyse kan worden uitgebreid tot cellen te leven, om het effect van RNAi op de dynamische processen te observeren. Nogmaals, S2-cellen zijn bijzonder goed geschikt voor dit type van analyse, omdat ze kunnen uitgeplaat op ConA-gecoate glazen bodem gerechten en gevisualiseerd voor vele uren op een omgekeerde microscoop zonder de noodzaak van een milieu-kamer.

Figuur 1. Fase contrastrijke beelden (20x vergroting) van S2 cellen na uitplaten op een Concanavaline A-gecoat glas-onderste schaal. De cijfers geven de minuten na de beplating. Merk op dat de cellen fase donker als ze plat op het gecoate dekglas. Cel afvlakking is duidelijk door de 15 min (pijlen) en is in wezen compleet met 60 minuten. Rechts panel: Vergrote afbeelding van aangesloten cellen, hun uitgebreid en afgeplatte marges zijn duidelijk zichtbaar (pijlpunt). Schaal bar (voor de vier linker panelen), 20 micrometer.

Figuur 2. S2-cellen tijdelijk getransfecteerd met een fusieconstruct bestaande uit nucleophosmin (een marker voor de kern) gefuseerd aan de fluorofoor, eGFP (groen). Deze cellen werden uitgeplaat op een ConA-gecoat glas bodem schotel, en vervolgens belicht met DIC en epifluorescentie. Schaalbalk, 15 pm.

. Figuur 3 Vaste S2 cellen immunostained voor PLP (groen, een centriole marker), microtubuli (rood), en Hoechst-gekleurd (blauw) voor de chromosomen. Voor fixatie en immunokleuring, werden de cellen blootgesteld aan een 4-daagse behandeling met ofwel controle RNAi of RNAi naar knock-down NCD, een kinesine-achtig eiwit dat spindel pole "concentreren" ⁴ promoot. Let op de spindel polen en ongeorganiseerd spindels gespreid in de cellen behandeld met NCD RNAi. Schaalbalk, 2,5 micrometer.

Discussion

Voor de celbiologie veld, zou een ideaal systeem goedkoop te onderhouden, gemakkelijk te manipuleren, en vatbaar voor een verscheidenheid aan technieken. Drosophila S2 cellen voldoen aan deze eisen, en dus ze hebben het systeem van de keuze snel te worden voor een groeiend aantal van de cel biologie labs.

We hebben presenteerde een kort overzicht van de methoden om S2 cellen voor te bereiden op microscopie. Een opmerkelijk hoofde van S2 cellen is het feit dat ze goed groeien in een normale atmosfeer en kamertemperatuur, daarom kunnen ze links op de microscoop voor langere tijd zonder speciale onderhoud. Hoewel ze over het algemeen zijn wat afgerond en losjes aanhanger onder normale teeltomstandigheden, kan S2 cellen worden geïnduceerd om op grote schaal af te vlakken voor de beeldvorming. S2 cellen gekweekt op glas-bodem gerechten die pre-coated geweest met Concanavaline A zullen hechten en een versnippering op de cover slip, waardoor ze een uitstekende microscopie exemplaren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S2 cells	ATCC	CRL-1963	http://www.atcc.org/
S2 cells	DGRC	stock number 6	https://dgrc.cgb.indiana.edu/
S2 cells	Invitrogen	R690-07
Sf900 II	Invitrogen	10902-096	serum-free medium
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30278	serum-free medium
Insect-Xpress	BioWhittaker	12-730	serum-free medium
Schneider’s S2 medium	Invitrogen	11720-034	Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium.
Fetal bovine serum	Invitrogen	10438026	heat inactivated
100x antibiotic solution	MP Biomedicals	91674049	contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL)
Concanavalin A	MP Biomedicals	195283
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	32% solution
Methanol	Mallinckrodt Baker Inc.	9049	anhydrous, ACS grade
Molecular sieves	Acros Organics	19724	type 3A