Summary
ड्रोसोफिला श्नाइडर कोशिकाओं (S2) और जीन की खोज और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक तेजी से लोकप्रिय प्रणाली है. हमारा लक्ष्य को सूक्ष्म तकनीक है कि इस तरह के एक तेजी से महत्वपूर्ण प्रायोगिक प्रणाली S2 कोशिकाओं को बनाने के कुछ का वर्णन है.
Protocol
1. माइक्रोस्कोपी के लिए S2 कोशिकाओं की तैयारी
श्नाइडर S2 कोशिकाओं ओरेगन आर ड्रोसोफिला के trypsinized देर से भ्रूण से प्राप्त किए गए . श्नाइडर मूल संस्कृति सेल प्रकार का एक मिश्रण के शामिल है, लेकिन जारी रखा 1 बीतने के साथ और अधिक सजातीय बन गया. वे बृहतभक्षककोशिका की तरह hemocyte तरह के जीन की अभिव्यक्ति के साथ (वे phagocytic हैं) के रूप में वर्णित किया गया है. S2 कोशिकाओं ATCC, DGRC, या Invitrogen से प्राप्त किया जा सकता है.
मध्यम विकास के ए चयन
मीडिया के एक नंबर संस्कृति S2 कोशिकाओं को इस्तेमाल किया गया है. मीडिया से कोई भी नीचे उल्लेख किया है एक 5% सीओ 2 वातावरण की आवश्यकता होती है.
- श्नाइडर मूल का इस्तेमाल किया उसे परिभाषित मध्यम (श्नाइडर ड्रोसोफिला मध्यम) 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक. जबकि FBS इस माध्यम सीरम मुक्त नीचे उल्लेख किया मीडिया की तुलना में अधिक महंगा बना देता है, यह अपेक्षाकृत कम autofluorescence है और इसलिए जीवित कोशिकाओं के epifluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए एक अच्छा विकल्प है. हालांकि, यह पर्याप्त धातु शामिल inducible metallothionein प्रमोटर (जैसे, Invitrogen PMT वेक्टर में subcloned जीन) के नियंत्रण के तहत उन transgenes की अभिव्यक्ति का एक निम्न स्तर को प्रोत्साहित, प्रेरण पहले जीन के "टपका हुआ" अभिव्यक्ति के कारण नहीं करता है.
- कई सीरम मुक्त मीडिया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, Sf900 द्वितीय, SFX कीट HyClone, और कीट - Xpress). ये मीडिया अपेक्षाकृत सस्ती हैं, लेकिन आम तौर पर अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्रोत्साहित जब metallothionein प्रमोटर विनियमित transgenes है Schneider माध्यम के रूप में की तुलना में. इसके अलावा, इन मीडिया 'Schneiders मध्यम / FBS (एक महत्वपूर्ण विचार जब जीना सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन) की तुलना में महत्वपूर्ण autofluorescence उत्पादन.
- वैकल्पिक रूप से, एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से जोड़ा जा सकता है; ये आम तौर पर कर रहे हैं पेनिसिलिन जी और स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट (5-10 इकाइयों / एमएल और 50-100 μg / एमएल अंतिम सांद्रता, क्रमशः). इसके अलावा, विरोधी कवक अभिकर्मक, amphotericin बी, 250 एनजी / एमएल (अंतिम एकाग्रता) करने के लिए जोड़ा जा सकता है.
बी संस्कृति की स्थिति
S2 कोशिकाओं को आसानी से सामान्य प्रयोगशाला तापमान और वातावरण शर्तों के तहत रखा जाता है. जब इमेजिंग बढ़ाया बार के लिए S2 कोशिकाओं रहते हैं, कोशिका मृत्यु का प्राथमिक कारण निर्जलीकरण और फोटो विषाक्तता हैं. निर्जलीकरण आसानी से खुर्दबीन पर डिश में पर्याप्त मध्यम रखने से रोका है. फोटो विषाक्तता एक पेचीदा मामला समस्या यह है कि 'कोशिकाओं उच्च तीव्रता, उच्च ऊर्जा प्रकाश के लिए संचयी जोखिम कम करने की आवश्यकता है जबकि इमेजिंग अक्सर पर्याप्त स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ दिलचस्प घटनाओं पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त है.
- S2 टिशू कल्चर प्लास्टिक पर बढ़ कोशिकाओं आम तौर पर गोल कर रहे हैं और शिथिल पक्षपाती है. मिला हुआ कोशिकाओं को एक घने monolayer के रूप में विकसित और तो, तेजी से, अधिक कक्षों से उठा और निलंबन में बढ़ने. दोनों तय की और जीवित कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी के लिए, इमेजिंग बहुत अगर कोशिकाओं को कवर पर्ची पर समतल करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं सुधार हुआ है. इस चाल से नीचे वर्णित है (2 2 ए).
2. S2 कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी
ए लाइव सेल माइक्रोस्कोपी
हम उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए रहते S2 गिलास नीचे बर्तन पर मढ़वाया कोशिकाओं कल्पना हैं. गिलास नीचे नीचे वर्णित व्यंजन कोशिकाओं को एक बहुत उनके सामान्य संवर्धन हालत करने के लिए इसी तरह की हालत में रखने, और भी माइक्रोस्कोपी - ग्रेड गिलास के माध्यम से जीवित कोशिकाओं की जांच करने की अनुमति देता है.
- गिलास नीचे व्यंजनों की तैयारी
अवयव:- Sylgard 184 सिलिकॉन elastomer किट
इस व्यंजन को कवर फिसल जाता है संलग्न गोंद है. बस का उपयोग करने से पहले वजन अनुपात: किट एक दो भागों, राल बेस घटक और इलाज के एजेंट, कि एक 10:1 (इलाज एजेंट राल) में मिश्रित कर रहे हैं.
एजेंट / राल इलाज मिश्रण तैयार करने के लिए:- एक प्लास्टिक में मोटे तौर पर राल के 5 ग्राम वजन नाव तौलना. राल के वजन पर ध्यान दें.
- गणना कितना इलाज एजेंट 0.1 द्वारा राल वजन गुणा करके की जरूरत है. एक ही वजन एक नई हस्तांतरण pipet का उपयोग कर नाव को इलाज के एजेंट की इस राशि जोड़ें.
- अच्छी तरह से घटकों का मिश्रण हिलाओ. बुलबुले कि दिखाई के बारे में चिंता मत करो, वे धीरे धीरे गायब हो जाएगा.
- गोंद अब तैयार है. यह शहद की तरह एक निरंतरता है और कम से कम एक घंटे के लिए प्रयोग करने योग्य हो जाएगा. गोंद का 5.5 छ मोटे तौर पर 75 व्यंजन बनाने के लिए पर्याप्त है, लेकिन इस पर निर्भर करता है कैसे कंजूस आप कर रहे हैं जब आप गोंद लागू है.
- प्लास्टिक 35 मिमी पेट्री डिश
हम सेल संस्कृति ग्रेड व्यंजन का उपयोग नहीं है क्योंकि हम केवल कोशिकाओं गिलास नीचे (और नहीं प्लास्टिक) के लिए देते हैं में रुचि रखते हैं तो बजाय हम सस्ता, मानक पेट्री डिश का उपयोग. कुछ खुर्दबीन चरणों परिपत्र से 35 पकड़ clampsमिमी व्यंजन, अगर आप इस है, यकीन है कि अपने बर्तन दबाना फिट होगा. हैरानी की बात है, एक ही बाहरी व्यास नहीं है सभी 35 मिमी व्यंजन. - कांच कवर
अपने खुर्दबीन और जरूरतों के लिए उपयुक्त कवर फिसल जाता है चुनें. तस्वीर-etched ग्रिड (जैसे, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान, 23x23 मिमी परिपत्र, gridded, नहीं. 2, बिल्ली 72264-23 नहीं.) के साथ महंगी विशेषता ग्लास से बहुत सस्ता थोक कांच कवर (उदाहरण के लिए, VWR, 22x22 मिमी वर्ग कांच के लिए कुछ भी , नहीं, 1.5, बिल्ली नहीं. 48366-227) का इस्तेमाल किया जा सकता है. सावधानी: गिलास थोड़ा बड़ा हो सकता है (कम से कम 1mm के बारे में) छेद है कि आप पेट्री डिश में कर देगा की तुलना में होना चाहिए, और भी पकवान के व्यास से छोटी होनी चाहिए. यदि आप वर्ग में कांच खरीदने का इरादा है, यकीन है कि गिलास को कवर पूरी तरह से (और एक छोटे से परे का विस्तार) परिपत्र छेद हो सकता है, लेकिन पकवान के पक्ष तक पहुंच नहीं होगा. यदि आप अपने कवर कांच साफ करना पसंद करते हैं, उन्हें बर्तन को gluing से पहले ऐसा करते हैं. - पावर ड्रिल
हम चर गति और निरंतर उपयोग के लिए एक लॉक पर बटन के साथ एक हाथ ड्रिल का उपयोग करें. ड्रिलिंग व्यंजन बहुत एक ड्रिल प्रेस के साथ आसान है, लेकिन गिलास नीचे व्यंजनों के छोटे पैमाने पर उत्पादन एक ड्रिल प्रेस की खरीद का औचित्य साबित नहीं करता है. - ड्रिल बिट
एक ¾ इंच कुदाल ड्रिल बिट (: http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit एक कुदाल बिट इस वेबपेज पर चित्र है) का उपयोग करें. बेशक, बिट के व्यास डिश के तल में छेद व्यास निर्धारित करता है. - गावदुम के रूप पीसने ड्रिल बिट
एक मोटे धैर्य और कुदाल बिट के रूप में उसी के बारे में में एक व्यास के साथ एक conically आकार पीस बिट का उपयोग करें. आखिर छेद drilled किया गया है, इस बिट का उपयोग करने के लिए परियोजना है कि डिश के तल से छेद के किनारे पर दूर प्लास्टिक के टुकड़े बर. पकवान के बाहर चेहरे पर प्लास्टिक के टुकड़े से कवर गिलास पकवान के खिलाफ फ्लश बैठे को रोकने जाएगा. छोटे प्लास्टिक पकवान इंटीरियर में चिपके हुए टुकड़े के बारे में चिंता मत करो: वे कवर गिलास या कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करेगा. - स्टायरोफोम मोटी दीवारों के साथ बॉक्स
यह ड्रिलिंग सतह के रूप में प्रयोग किया जाता है. कवर एक स्टायरोफोम सील टेप के स्ट्रिप्स के साथ बॉक्स के बाहर की ओर (हम 1.5 इंच स्कॉच सील टेप का उपयोग), सील टेप स्टायरोफोम जबकि ड्रिलिंग बिट के भागने minimizes.
सभा- जगह पकवान इतना है कि इसके नीचे की ओर स्टायरोफोम बॉक्स के खिलाफ है, स्टायरोफोम बॉक्स टेप सतह पर एक 35 मिमी पेट्री डिश के नीचे आधा रखें. जबकि मजबूती पकवान के पक्ष पकड़े, डिश के माध्यम से एक छेद ड्रिल. चेतावनी: आपकी उंगलियों पकवान धारण एक rotating ड्रिल बिट से एक इंच का एक अंश हो जाएगा. जाहिर है, यह खतरनाक है. ड्रिलिंग अगर पकवान स्पिन शुरू होता है बंद करो. यदि आप एक ड्रिल प्रेस और / या एक चालाक रास्ता मजबूती पकवान पकड़ है, उन का उपयोग करें. हम एक दुर्घटना कभी नहीं था, है, लेकिन जो भी आप इस प्रक्रिया को सुरक्षित बनाने की जरूरत है.
- आपके सभी व्यंजनों की ड्रिलिंग के बाद, पीसने ड्रिल बिट का उपयोग करने छेद के बाहर रिम चिकनी. हम अपने पक्ष पर के साथ शक्ति ड्रिल बिट काउंटर के किनारे पर बाहर पेश जगह है. ड्रिल जगह में इस पर भारी कुछ लेकिन लचीला रखने के द्वारा आयोजित किया जाता है (हम एक भारी शुल्क प्लास्टिक रेत के 10kg युक्त बैग का उपयोग करें). ड्रिल लगातार चालू रखने के लॉक ऑन बटन का प्रयोग करें, और तब प्रत्येक पकवान पकड़ और यह पीस बिट के खिलाफ जाने के लिए नए छेद से दूर किसी न किसी किनारे चिकनी द्वारा अपने सभी व्यंजनों की rims के चिकनी.
- एक बड़े बीकर में सभी पकवान नीचे रखो और उन्हें आसुत जल के साथ प्लास्टिक या स्टायरोफोम के छोटे, ढीले टुकड़े (जो फ्लोट जाएगा) को हटाने के लिए कई बार कुल्ला. बाद में, पकवान बाहर नीचे के लिए सूखी करना.
- जब व्यंजन सूख रहे हैं, अपने Sylgard 184 गोंद तैयार करते हैं. प्रत्येक पकवान की बाहर की सतह पर drilled छेद के चारों ओर एक गोंद का एक छोटा वृत्त लागू करें. बहुत ज्यादा नहीं गोंद की जरूरत है, वास्तव में, बहुत अधिक गोंद एक गड़बड़ कर देगा. छेद पर एक कांच कवर, गोंद के साथ संपर्क में रखें. कवर गिलास पकवान के खिलाफ आसानी से और समान रूप से बैठना चाहिए. यदि गोंद पूरी तरह से छेद के चारों ओर वितरित नहीं किया गया था, तो वहाँ छोटे अंतराल जहां गोंद कवर ग्लास और पकवान नीचे के बीच याद आ रही है हो सकता है. शुरू में इन कमियों के बारे में चिंता मत करो, आमतौर पर गोंद इन अंतराल में रेंगना करने के लिए उन्हें भरने.
- कवर कांच के सभी पर gluing के बाद, वापस जाओ और अंतराल के लिए व्यंजन है कि गोंद द्वारा नहीं बंद कर दिया है की जाँच करें. किसी भी अंतराल में, अंतराल के निकट कवर कांच के किनारे करने के लिए गोंद का एक छोटा सा थपका लागू, गोंद अंतराल में बाती होगा.
- व्यंजन अलग सेट, नीचे की ओर, शुष्क. यह कमरे के तापमान पर एक या अधिक दिन ले सकते हैं, लेकिन आप एक गर्म इनक्यूबेटर में बर्तन डाल द्वारा इलाज की दर में वृद्धि कर सकते हैं.
- यदि आप बाँझ व्यंजन की जरूरत है, एक ऊतक संस्कृति हुड में पकवान पैंदा और lids डाल और उन्हें बाहर फैला. पकवान पैंदा पर lids मत डालो. इसके बजाय, टुकड़े तो बारी है कि उनके भीतर सतहों सख्त हैंctly यूवी बल्ब का सामना करना पड़ रहा है. कम से कम 45 मिनट के लिए स्टरलाइज़ यूवी प्रकाश पर मुड़ें. यदि आप ConA कोट व्यंजन (नीचे देखें) के लिए योजना, व्यंजन के बाद वे लेपित हैं जब तक नहीं बाँझ.
- व्यंजन अब कर रहे हैं उपयोग के लिए तैयार हैं.
- Sylgard 184 सिलिकॉन elastomer किट
- एक concanavalin का उपयोग
लेक्टिन, concanavalin एक (ConA), S2 कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए एक 3 ConA के साथ लेपित सतह के खिलाफ समतल पाया गया था. जब S2 कोशिकाओं कवर ConA साथ लेपित निकल जाता है पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, वे फैल और माइक्रोस्कोपी के लिए उत्कृष्ट नमूनों बन.- ConA कोट सादे कवर फिसल जाता है फैल, Parafilm का एक टुकड़ा के शीर्ष पर साफ कवर फिसल जाता है नीचे एक बेंच शीर्ष टेप. प्लेस ConA के 0.5 मिलीग्राम / एमएल समाधान (बाँझ पानी में) प्रत्येक कवर पर्ची की सतह पर, और फिर 10 μLs सामग्री कवर पर्ची के पूरे शीर्ष पर फैल गया. सूखने के बाद, एक साफ, सूखे कंटेनर में कवर फिसल जाता है की दुकान. लेपित गिलास एक टिशू कल्चर हुड में यूवी प्रकाश के साथ निष्फल हो सकते हैं.
- ConA कोट गिलास नीचे बर्तन करने के लिए, इसी तरह कांच के ऊपरी पक्ष पर ConA समाधान के 10 μLs (यानी, ढक्कन - पक्ष का सामना करना पड़) फैल. सूखने के बाद, बर्तन निष्फल हो ऊपर वर्णित के रूप में कर सकते हैं. ConA लेपित व्यंजन या coverslips कमरे के तापमान पर संग्रहित कर रहे हैं और महीने तैयारी के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है.
- इमेजिंग
- धीरे आरएनएआई इलाज S2 कोशिकाओं resuspend और उन्हें एक ConA लेपित गिलास नीचे MLS के 2 मध्यम युक्त डिश को हस्तांतरण. स्वस्थ कोशिकाओं है कि ConA लेपित कवर पर्ची संपर्क कसकर यह करने के लिए पालन करना और प्रसार करने के लिए शुरू हो जाएगा. इस प्रक्रिया के बारे में 15 मिनट से स्पष्ट हो जाते हैं, जाना चाहिए और 45 मिनट से 1 घंटे के द्वारा पूरा किया जाना चाहिए. नोट करें कि संलग्न कोशिकाओं cytokinesis उनके तंग लगाव के कारण नहीं ConA - लेपित सतह के लिए और प्रदर्शन कर सकते हैं समय के साथ polyploid हो जाएगा. ConA - लेपित व्यंजन में वरीयता प्राप्त कक्ष विस्तारित अवधि के लिए स्वस्थ रहते हैं, लेकिन इन व्यंजनों में नहीं पैदा होगा.
- बाद कोशिकाओं संलग्न है, मध्यम अगर पुरानी मध्यम autofluorescent है विमर्श किया जा सकता है. यह छोटे गहराई के क्षेत्र उद्देश्यों के साथ confocal या deconvolution सूक्ष्मदर्शी या व्यापक क्षेत्र सूक्ष्मदर्शी का उपयोग अध्ययन के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है.
- चूंकि S2 कोशिकाओं कमरे के तापमान / सामान्य वातावरण में स्वस्थ हैं तो कोई विशेष स्थितियों या उपकरण की जरूरत है जब कोशिकाओं को खुर्दबीन पर हैं. हम अक्सर रहते S2 कोशिकाओं के लंबे समय चूक फिल्मों ले. अभ्यास में, इन प्रयोगों के क्रम photobleaching और phototoxicity की सामान्य समस्याओं के द्वारा सीमित है.
बी फिक्स्ड सेल माइक्रोस्कोपी
- नीचे ग्लास व्यंजन बनाम सादे कवर फिसल जाता है: इनमें से या तो जब कोशिकाओं फिक्सिंग इस्तेमाल किया जा सकता है. जब सादे कवर फिसल जाता है का उपयोग करते हुए, एक व्यक्ति 35 मिमी पकवान (जो टिशू कल्चर ग्रेड होने की जरूरत नहीं) में एक एकल ConA लेपित कवर पर्ची जगह करने के लिए, मीडिया के 2 MLS जोड़ने के लिए, और फिर डिश में आरएनएआई इलाज कोशिकाओं को हस्तांतरण. बाद कोशिकाओं कवर पर्ची करने के लिए संलग्न है, मध्यम निकालने के लिए, संक्षेप में एक उपयुक्त बफर (पीबीएस अच्छी तरह से काम करता है) के साथ कोशिकाओं को धोने, और पकवान लगानेवाला (नीचे देखें) जोड़ने. बाद में, कवर पर्ची पकवान से हटाया जा सकता है और आगे immunostaining द्वारा उदाहरण के लिए, संसाधित.
- फिक्सेशन तरीकों की एक किस्म S2 कोशिकाओं को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. epitopes या टैग प्रोटीन को नष्ट या खोने के बिना, सबसे अच्छा निर्धारण विधि द्वारा निर्धारित किया जाएगा अच्छी तरह से कैसे एक लगानेवाला ब्याज की सुविधाओं को बरकरार रखता है. कुछ प्रक्रियाओं निर्धारण से पहले एक निष्कर्षण कदम की आवश्यकता है क्रम में कुछ घने या कॉम्पैक्ट संरचनाओं में स्थित प्रोटीन के epitopes बेनकाब. चूंकि S2 सेल साहित्य काफी व्यापक है, यह आमतौर पर प्रकाशित एक विधि के लिए बेहतर अपने हित के S2 कोशिका संरचना को ठीक करने के लिए संभव है.
- मेथनॉल एक आम लगानेवाला है. मेथनॉल ठंड (-20 कम से कम डिग्री सेल्सियस) और चाहिए निर्जल (आणविक sieves [प्रकार 3A] सार पानी के लिए मेथनॉल किया जा सकता है). हम एक विस्फोट के सबूत 20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक कवर 1L कांच बीकर में 300 निर्जल मेथनॉल के MLS के बारे में सर्द. जब मेथनॉल ठंडा है, इसे ठंडे बस्ते से निकालने के लिए, जल्दी से गिलास नीचे डिश (या एक कवर पकवान युक्त पर्ची) से मध्यम हटायें, और फिर तेजी से उतर पकवान मेथनॉल में नीचे और वहाँ छोड़ दें. मेथनॉल के बीकर आमतौर पर के बारे में एक दर्जन से अधिक व्यंजनों रखती है. जल्दी से काम और फ्रीजर के लिए बीकर (व्यंजन युक्त) के रूप में जल्द से जल्द वापस. फिक्सेशन 10-15 मिनट में पूरा हो गया है. बाद में, बीकर से बर्तन निकालने के लिए, किसी भी उन में शेष मेथनॉल डालना, और उन्हें पीबीएस 0.1% / X-100 ट्राइटन जोड़कर rehydrate. वे अब कर रहे हैं मानक धुंधला प्रक्रियाओं के लिए तैयार है.
- Formaldehyde एक आम लगानेवाला है. हम बफर में 10% formaldehyde (पीबीएस स्वीकार्य है, लेकिन सबसे अपनी आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त बफर का उपयोग करें) का उपयोग करें. हम formaldehyde के इस अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता है क्योंकि S2 कोशिकाओं का उपयोगcytoplasmic मध्यवर्ती filaments जो अन्यथा सेल और निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान आकारिकी संगठन बनाए रखने में मदद की कमी है.
- बर्बादी बीकर में लगानेवाला डालो और PBST के तीन संक्षिप्त washes के साथ तय की कोशिकाओं को धोने (पीबीएस 0.1% + TritonX-100).
- अगले 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को अवरुद्ध समाधान के 1ml जोड़ें. हम नियमित रूप से PBST में 5% की सामान्य बकरी सीरम का उपयोग करें.
- बंद अवरुद्ध समाधान डालो और कोशिकाओं पर सीधे प्राथमिक एंटीबॉडी (समाधान अवरुद्ध में पतला) जोड़ने. एंटीबॉडी समाधान के 100 μl पूरी तरह से कोशिकाओं को कवर किया जाना चाहिए. डिश पर वापस पेट्री ढक्कन प्लेस एंटीबॉडी समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ एंटीबॉडी सेते चलो.
- एंटीबॉडी समाधान निकालें और तीन PBST washes के प्रदर्शन. एक हस्तांतरण pipet प्रयोग पकवान PBST के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए. प्रत्येक धोने (पकवान ज़ुल्फ़ करने की जरूरत नहीं) के बीच 5 मिनट रुको.
- पिछले धो डालो और कोशिकाओं पर सीधे माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μl (समाधान अवरुद्ध में पतला) जोड़ने. डिश पर वापस पेट्री ढक्कन प्लेस एंटीबॉडी समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ एंटीबॉडी सेते चलो.
- माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और PBST के साथ तीन 5 मिनट washes के प्रदर्शन. पिछले धोने डंपिंग के बाद, कोशिकाओं पर सीधे अपनी पसंद के बढ़ते मीडिया की कुछ बूँदें जोड़ें. पीबीएस (09:01) और 20 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस: हम 0.1 एम propyl ग्लिसरॉल का एक समाधान में भंग gallate का उपयोग करें पेट्री ढक्कन बदलें और अंधेरा वातावरण में पकवान की दुकान.
3. सीमाओं समस्याओं /
किसी भी प्रायोगिक प्रणाली के साथ के रूप में, वहाँ S2 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सीमाएं हैं. सबसे पहले, सुसंस्कृत S2 कोशिकाओं आम तौर पर एक कम mitotic सूचकांक (सीरम मुक्त मीडिया में लगभग 1%) प्रदर्शन, जबकि कई तब्दील स्तनधारी सेल लाइनों के लिए mitotic सूचकांक के रूप में ज्यादा के रूप में 10 गुना अधिक हैं. इसलिए, mitotic phenotypes के अध्ययन के लिए, S2 सेल संस्कृतियों उचित मंचन कोशिकाओं को खोजने के लिए एक लंबी खोज की आवश्यकता होती है. दूसरा, कोशिका चक्र के अध्ययन के लिए, दवा उपचार विशिष्ट कोशिका चक्र के चरणों के दौरान S2 कोशिकाओं को गिरफ्तार करने में बहुत प्रभावी रहे हैं. हालांकि, सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में पलटवाँ सेल चक्र गिरफ्तार प्रभाव है यौगिकों कि आसानी से S2 कोशिकाओं में नहीं वार्शआउट करते हैं. इस प्रकार, proliferating S2 कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रोटोकॉल स्थापित नहीं किया गया है. तीसरा, S2 कोशिकाओं प्रवासी है और न ही नहीं कर रहे हैं कि वे उपकला विशेषताओं को प्रदर्शित.
4. अपेक्षित परिणाम
S2 कोशिकाओं के लिए सबसे बड़ी बिक्री बिंदु एक मॉडल प्रणाली के रूप में अपनी उपयोगिता है. वे अपने हित के प्रोटीन के सेलुलर कार्यों का आकलन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं: S2 कोशिकाओं आरएनएआई का उपयोग dsRNA है कि आसानी से (और अपेक्षाकृत सस्ते में) प्रयोगशाला में संश्लेषित द्वारा इलाज कर रहे हैं, और वे रहते सेल विश्लेषण के लिए और तय कोशिकाओं के immunofluorescence के लिए अच्छी तरह से सेवा . इसके अलावा, S2 कोशिकाओं को एक महत्वपूर्ण लाभ आसानी जिसके साथ वे प्रयोगशाला में बनाए रखा जा सकता है, अपेक्षाकृत सस्ती सीरम मुक्त मध्यम और कोई टिशू कल्चर इनक्यूबेटर का उपयोग है.
एक ठेठ प्रयोग एक उपयुक्त टिशू कल्चर कंटेनर में S2 कोशिकाओं चढ़ाना (कहना, एक 6 या 96 में अच्छी तरह से थाली), कुओं के लिए घर बनाया dsRNA जोड़ने, और फिर संस्कृतियों को बनाए रखने के रूप में लक्षित प्रोटीन को धीरे - धीरे आरएनएआई द्वारा समाप्त हो रहे हैं शामिल होगा. समाप्त किया जा रहा लक्ष्य प्रोटीन पर निर्भर करता है, कोशिकाओं लक्ष्य प्रोटीन नीचे दस्तक का एक परिणाम के के रूप में एक morphological और / या व्यवहार परिवर्तन दिखा सकते हैं. समय के लिए एक न्यूनतम करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति को कम करने के लिए आवश्यक प्रोटीन के लिए विशिष्ट है और पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए.
आम तौर पर S2 कोशिकाओं को कसकर प्लास्टिक या ग्लास करने के लिए पालन नहीं करते हैं, और इस इलाज किया कोशिकाओं का सूक्ष्म परीक्षण की आवश्यकता प्रयोगों के लिए एक समस्या खड़ी होगी. हालांकि, S2 कोशिकाओं बस उन्हें एक लेक्टिन, concanavalin एक (ConA) के साथ लेपित सतह पर चढ़ाना द्वारा बड़े पैमाने पर समतल करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है. ConA पर चढ़ाना के एक घंटे के भीतर, सबसे कोशिकाओं ConA सतह (चित्रा 1) पर बड़े पैमाने पर प्रसार का एक परिणाम के रूप में में उनके गोल उपस्थिति खो दिया है. कोशिकाओं को अब कर रहे हैं आगे (उदाहरण के लिए, निर्धारण और immunostaining द्वारा) प्रसंस्करण या जीवित कोशिकाओं का सूक्ष्म अवलोकन के लिए तैयार है.
S2 कोशिकाओं को भी (रासायनिक अभिकर्मकों या electroporation की एक किस्म का उपयोग) ट्रांसफ़ेक्ट जा सकता है या तो transiently exogenous जीन व्यक्त या stably जीनोम (इस प्रकार एक सेल लाइन है कि दोहराया प्रभागों के माध्यम से exogenous जीन का कहना बनाने) में जीन शामिल. Transfections fluorescently टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति है कि निश्चित या जी कोशिकाओं (चित्रा 2), या उस में रुचि के निशान संरचनाओं चारे के रूप में पुल से नीचे vivo में immunoprecipitation या प्रयोगों, आदि में उपयोग किया जाता है की तरह, कई प्रयोजनों की सेवा कर सकते हैं
cou के विश्लेषण की विधि निर्भर करता है,rse, जैविक प्रयोग के द्वारा संबोधित किया जा रहा सवाल पर. आरएनएआई इलाज S2 कोशिकाओं के विश्लेषण का एक आम तरीका तय कोशिकाओं (चित्रा 3) के immunofluorescence है. उदाहरण के लिए, immunofluorescence ड्रोसोफिला जीन पुस्तकालयों के जीनोम चौड़ा स्क्रीन के साथ आम तौर पर प्रयोग किया जाता है करने के लिए तेजी से vivo में दिलचस्प गतिविधियों के साथ प्रोटीन की पहचान. विश्लेषण एक साथ S2 कोशिकाओं में एकाधिक लक्ष्य प्रोटीन घट क्रम में लक्ष्य प्रोटीन के बीच संभावित कार्यात्मक बातचीत की जांच करके और अधिक व्यापक बनाया जा सकता है. और विश्लेषण कोशिकाओं रहते हैं, के लिए गतिशील प्रक्रियाओं पर आरएनएआई प्रभाव का पालन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. फिर, S2 कोशिकाओं विश्लेषण के इस प्रकार के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि वे ConA लेपित गिलास नीचे बर्तन पर चढ़ाया और एक पर्यावरण कक्ष की आवश्यकता के बिना एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कई घंटे के लिए कल्पना कर सकते हैं.
चित्रा 1 चरण concanavalin एक लेपित ग्लास नीचे पकवान पर चढ़ाना के बाद S2 कोशिकाओं के विपरीत छवियाँ (20x बढ़ाई है). . संख्या चढ़ाना के बाद मिनट का संकेत मिलता है. ध्यान दें कि कोशिकाओं को अंधेरे चरण बन के रूप में वे लेपित कवर पर्ची पर समतल. सपाट सेल 15 मिनट (तीर) द्वारा स्पष्ट है और 60 मिनट से अनिवार्य रूप से पूरा हो गया है. राइट पैनल: संलग्न कक्षों की छवि आवर्धक, उनके बढ़ाया और चपटा हाशिये स्पष्ट रूप से दिखाई (arrowhead) हैं. स्केल पट्टी (चार बाईं पैनल के लिए), 20 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2. S2 transiently एक संलयन (नाभिक के लिए एक मार्कर) nucleophosmin fluorophore करने के लिए इनकार, EGFP (हरा) के निर्वाचकगण के निर्माण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं. इन कोशिकाओं को ConA लेपित गिलास तली पकवान पर चढ़ाया गया, और फिर डीआईसी और epifluorescence के साथ imaged. स्केल बार, 15 सुक्ष्ममापी.
. चित्रा 3 फिक्स्ड S2 कोशिकाओं (हरा, एक Centriole मार्कर) पीएलपी के लिए immunostained, सूक्ष्मनलिकाएं (लाल), और गुणसूत्रों के लिए Hoechst से सना हुआ (नीला) . निर्धारण और immunostaining इससे पहले, कोशिकाओं नियंत्रण आरएनएआई या आरएनएआई दस्तक नीचे NCD, एक kinesin की तरह प्रोटीन है कि 4 "ध्यान केंद्रित" धुरी पोल को बढ़ावा के साथ एक 4 दिन उपचार के अधीन थे. ध्यान दें NCD आरएनएआई के साथ इलाज किया कोशिकाओं में धुरी डंडे और बेतरतीब spindles splayed. स्केल बार, 2.5 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए एक आदर्श व्यवस्था बनाए रखने के लिए सस्ती हो, हेरफेर करने के लिए आसान होता है, और तकनीक की एक किस्म करने के लिए उत्तरदायी ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं इन आवश्यकताओं को संतुष्ट है, और तो वे तेजी से सेल के एक बढ़ती संख्या के लिए पसंद की प्रणाली बन जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं.
हम तरीकों की एक संक्षिप्त सिंहावलोकन माइक्रोस्कोपी के लिए S2 कोशिकाओं तैयार प्रस्तुत किया है. S2 कोशिकाओं की एक उल्लेखनीय पुण्य तथ्य यह है कि वे सामान्य माहौल और कमरे के तापमान में अच्छी तरह से विकसित है, इसलिए वे किसी विशेष रखरखाव आवश्यकताओं के बिना विस्तारित अवधि के लिए माइक्रोस्कोप पर छोड़ा जा सकता. हालांकि वे आम तौर पर कुछ हद तक गोल कर रहे हैं और शिथिल सामान्य संवर्धन की शर्तों के तहत अनुयायी, S2 कोशिकाओं इमेजिंग के लिए बड़े पैमाने पर समतल करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है. S2 कोशिकाओं गिलास नीचे व्यंजन है कि पूर्व में लिपटे concanavalin देते हैं और एक बारीकी फैल कवर पर्ची पर, उन्हें उत्कृष्ट माइक्रोस्कोपी नमूनों बनाने के साथ किया गया है पर सभ्य है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान p30 CA23074, अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान 74-001-31 अनुदान, और Univ द्वारा समर्थित किया गया. एरिजोना सैनिक बीजाणु (NCI / एनआईएच CA9506O).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | |
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30278 | serum-free medium |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution |
| Methanol | Mallinckrodt Baker Inc. | 9049 | anhydrous, ACS grade |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
