Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

Summary

Drosophila Schneider (S2), le cellule sono un sistema sempre più popolare per la scoperta e l'analisi funzionale dei geni. Il nostro obiettivo è quello di descrivere alcune delle tecniche microscopiche, che le cellule S2 ad un sistema sempre più importante sperimentale.

Abstract

Il sistema sperimentale ideale sarebbe economico e facile da mantenere, suscettibile di una varietà di tecniche, e sarebbe sostenuto da una vasta letteratura e la sequenza del genoma del database. Colture di cellule di Drosophila S2, il prodotto di dissociato 20-24 ore embrioni vecchio ^1, in possesso di tutte queste caratteristiche. Di conseguenza, le cellule S2 sono estremamente adatti per l'analisi dei processi cellulari, tra cui la scoperta dei geni che codificano per i componenti molecolari del processo o meccanismo di interesse. Le caratteristiche delle cellule S2 che sono più responsabili per la loro utilità è la facilità con cui vengono gestiti, la loro squisita sensibilità a doppio filamento (ds) RNA-mediata interference (RNAi), e la loro trattabilità di microscopia a fluorescenza come sia vivo o fissa cellule.

S2 cellule possono essere coltivate in una varietà di supporti, tra cui un certo numero di basso costo, disponibili in commercio, completamente definito, privo di siero dei media ^2. Inoltre, crescono in modo ottimale e rapido a 21-24 ° C e può essere coltivato in una varietà di contenitori. A differenza delle cellule dei mammiferi, le cellule S2 non richiedono un ambiente regolamentato, ma invece fare bene con l'aria normale e può anche essere mantenuto in contenitori sigillati.

Completando la facilità di RNAi in cellule S2 è la capacità di analizzare facilmente fenotipi sperimentalmente indotta dalla fase o microscopia a fluorescenza di cellule fisse o dal vivo. Cellule S2 crescere in cultura come un monostrato unico, ma non vengono visualizzati inibizione da contatto. Al contrario, le cellule tendono a crescere in colonie nelle culture dense. A bassa densità, le culture S2 cresciuti su vetro o dei tessuti trattati con la cultura di plastica sono rotonde e vagamente-attached. Tuttavia, la citologia delle cellule S2 può essere notevolmente migliorata inducendoli ad appiattire estensivamente da colture brevemente su una superficie ricoperta con la lectina, concanavalina A (ConA) ^3. Cellule S2 può anche essere stabilmente transfettate con marcatori fluorescenti-tag alle strutture etichetta o organelli di interesse in cellule vive o fissi. Pertanto, lo scenario consueto per l'analisi microscopica delle cellule è questa: primo, le cellule S2 (che può possedere transgeni di esprimere marcatori tag) sono trattati con RNAi per eliminare una proteina bersaglio (s). Tempo di trattamento RNAi può essere regolata per tener conto delle differenze di proteine ​​turn-over cinetica e di ridurre al minimo il trauma cellulare / morte se la proteina bersaglio è importante per la vitalità. Successivamente, le cellule trattate vengono trasferiti in un piatto contenente un coprioggetto preverniciato con Ancona per indurre le cellule a diffondere e strettamente aderire al vetro. Infine, le cellule sono ripreso con la scelta del ricercatore di modalità di microscopia. Cellule S2 sono particolarmente buoni per gli studi che richiedono la visualizzazione estesa di cellule vive da quando queste cellule rimanere in buona salute a temperatura ambiente e l'atmosfera normale.

Protocol

1. Preparazione cellule S2 per microscopia

Schneider cellule S2 sono stati ricavati da embrioni trypsinized fine di Oregon R Drosophila. Cultura originale Schneider consisteva in una miscela di tipi di cellule, ma è diventato più omogeneo con il passaggio continuo ^1. Sono stati descritti come macrofagi come (sono fagocitarie) con hemocyte-come l'espressione genica. Cellule S2 può essere ottenuto dalla ATCC, DGRC, o Invitrogen.

A. Selezione del mezzo di crescita

Un certo numero di mezzi di comunicazione sono stati usati per le cellule cultura S2. Nessuno dei mezzi di comunicazione di seguito indicate richiedono un 5% di CO ₂ nell'atmosfera.

1. Schneider originariamente usato il suo terreno specifico (medio Drosophila Schneider) integrato con il 10% di siero siero fetale bovino (FBS). Mentre FBS rende questo mezzo più costoso del siero senza mezzi di cui sotto, ha autofluorescenza relativamente bassa ed è quindi una buona scelta per l'epifluorescenza di cellule vive. Tuttavia, non contiene metalli sufficiente per stimolare un basso livello di espressione di tali transgeni sotto il controllo del promotore inducibile metallotioneina (ad esempio, i geni subcloned in vettoriale PMT Invitrogen), causando l'espressione "leaky" del gene della prima dell'induzione.
2. Diversi mezzi di comunicazione senza siero sono disponibili in commercio (ad esempio, Sf900 II, Hyclone SFX insetti e insetti-Xpress). Questi terreni sono relativamente poco costoso ma di solito stimolare maggiori livelli di espressione quando si usa metallotioneina promotore regolato transgeni rispetto alla media di Schneider. Inoltre, questi media producono autofluorescenza significativo rispetto al medio Schneiders '/ FBS (una considerazione importante quando si eseguono dal vivo microscopia a fluorescenza cellulare).
3. Opzionalmente, gli antibiotici possono essere aggiunti al mezzo, queste sono di solito penicillina G e solfato di streptomicina (50-100 unità / ml e 50-100 mg / ml concentrazioni finali, rispettivamente). Inoltre, l'anti-fungine reagente, amfotericina B, può essere aggiunto a 250 ng / mL (concentrazione finale).

B. Cultura condizioni

Cellule S2 sono facili da mantenere in condizioni di temperatura e le condizioni normali di laboratorio atmosfera. Quando l'imaging dal vivo le cellule S2 per tempi più lunghi, le cause primarie di morte cellulare sono la disidratazione e la foto-tossicità. La disidratazione è facilmente prevenuti mantenendo medie sufficiente nel piatto del microscopio. Foto-tossicità è un problema più complicato che richiede al minimo l'esposizione cumulativa delle cellule 'ad alta intensità, ad alta energia luce mentre l'imaging una frequenza tale da catturare eventi interessanti con un'adeguata risoluzione spaziale e temporale.

1. Cellule S2 crescente plastica tessuto culturale sono generalmente arrotondate e vagamente aderente. Cellule confluenti crescere come un monostrato denso e poi, sempre più, di più cellule decollare e crescere in sospensione. Per microscopia di entrambe le cellule fisse e dal vivo, l'immagine è notevolmente migliorata se le cellule sono indotte ad appiattirsi sul vetrino. Questo trucco è descritto di seguito (2. A. 2.).

2. Microscopia di cellule S2

A. microscopia cellulare dal vivo

Noi utilizziamo microscopi invertiti per visualizzare dal vivo le cellule S2 placcato sul fondo di vetro piatti. Il fondo di vetro piatti descritti di seguito non mancherà di tenere le cellule in una condizione molto simile alla loro condizione normale coltura, e permette anche di cellule vive da esaminare mediante microscopia-grade di vetro.

1. Preparazione di piatti con fondo di vetro
   
   Componenti:
   1. Sylgard 184 kit di silicone elastomero
      Questa è la colla per fissare il coperchio scivola ai piatti. Il kit ha un due parti, il componente di base di resina e il catalizzatore, che si mescolano in un (resina: induritore) 10:1 peso al momento dell'uso.
      Per preparare la resina / curare miscela agente:
      1. Pesare circa 5 g della resina in una plastica pesa barca. Nota il peso della resina.
      2. Calcolare la quantità di indurente è necessario moltiplicando il peso di resina di 0,1. Aggiungere questa quantità di catalizzatore allo stesso pesare barca usando una pipetta di trasferimento.
      3. Mescolare per mescolare completamente i componenti. Non preoccuparti per le bolle che compaiono, ma lentamente spariranno.
      4. La colla è pronta. Ha una consistenza simile al miele e sarà utilizzabile per almeno un'ora. 5,5 g di colla è abbastanza per fare circa 75 piatti, ma questo dipende da come siete avari quando si applica la colla.
   2. Plastica 35 millimetri Petri
      Non usiamo cellulari piatti di qualità della cultura perché siamo solo interessati ad avere cellule attaccare sul fondo di vetro (e non la plastica) - così invece usiamo più economico, piatti standard Petri. Alcune fasi microscopio hanno pinze circolare per sostenere 35piatti mm, se si dispone di questo, essere sicuri che i vostri piatti si inserisce il morsetto. Sorprendentemente, non tutti i piatti 35 millimetri avere lo stesso diametro esterno.
   3. Copertura in vetro
      Scegli scivola copertura appropriata al microscopio e bisogni. Nulla da vetri speciali costosi con foto-inciso griglie (ad esempio, Scienze Microscopia Elettronica, mm 23x23 circolare, griglia, no. 2, cat. No. 72264-23) al vetro di massa molto più economico di copertura (ad esempio, VWR, 22x22 mm vetro quadrato , no. 1.5, cat. no. 48366-227) potrebbe essere utilizzato. Attenzione: il bicchiere deve essere leggermente più grande (almeno circa 1mm) rispetto al buco che si farà nella scatola di Petri, e deve anche essere inferiore al diametro del piatto. Se avete intenzione di acquistare vetro quadrato, essere sicuri che il vetro si coprono completamente (ed estendere un po 'oltre), il foro circolare, ma non raggiunge i lati del piatto. Se si preferisce pulire il vetro di copertura, farlo prima di incollarli ai piatti.
   4. Trapano elettrico
      Noi utilizziamo un trapano a mano con velocità variabile e di un blocco sul pulsante per uso continuo. Piatti di perforazione è molto più semplice con un trapano a colonna, ma la produzione su piccola scala del fondo di vetro piatti non giustifica l'acquisto di un trapano a colonna.
   5. Punta
      Utilizzare un ¾ di pollice punta vanga (un po 'vanga è raffigurato su questa pagina web: http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit). Naturalmente, il diametro del bit determina il diametro del foro sul fondo del piatto.
   6. Conica punta di rettifica
      Utilizzare una conica a forma di bit macinazione con una grana grossa e un diametro di circa lo stesso del bit vanga. Dopo che tutti i fori sono stati praticati, utilizzare questo bit per fresa via frammenti di plastica sul bordo del foro progetto che dal fondo del piatto. Frammenti di plastica sulla superficie esterna del piatto impedirà il vetro di copertura dalla posizione seduta a filo contro il piatto. Non preoccupatevi di piccoli pezzi di plastica che spuntavano nell'interno del piatto: non influenzerà la copertura in vetro o le cellule.
   7. Scatola di polistirolo con pareti spesse
      Questo viene utilizzato come la superficie di foratura. Coprire una parte esterna della scatola di polistirolo con strisce di nastro adesivo (usiamo 1,5 pollici nastro adesivo Scotch), il nastro sigillante riduce al minimo la fuoriuscita di pezzetti di polistirolo durante la perforazione.
   
   Montaggio
   1. Posizionare la metà inferiore di un piatto 35 millimetri Petri sulla superficie registrata la casella di polistirolo, posizionare il piatto in modo che il suo lato inferiore è contro la scatola di polistirolo. Mentre tenendolo per i lati del piatto con fermezza, praticare un foro attraverso il piatto. Attenzione: Le tue dita tenendo il piatto sarà una frazione di pollice da una punta da trapano rotante. Naturalmente, questo è pericoloso. Smettere di foratura se il piatto comincia a girare. Se si dispone di un trapano a colonna e / o un modo intelligente per tenere il piatto con fermezza, li utilizzano. Non abbiamo mai avuto un incidente, ma fare tutto ciò che dovete fare questa procedura sicura.
   2. Dopo la foratura di tutti i vostri piatti, lisci il bordo esterno dei fori con la punta del trapano rettifica. Abbiamo posto il trapano elettrico su un fianco, con il bit proietta fuori dal bordo del contatore. Il trapano è tenuto in posizione mettendo qualcosa di pesante ma flessibile su di esso (usiamo un pesante sacchetto di plastica contenente 10 kg dovere di sabbia). Utilizzare il lock-on pulsante per tenere il trapano continuamente in esecuzione, quindi liscia i cerchi di tutti i vostri piatti tenendo ogni piatto e in movimento contro il bit di macinazione in modo da attenuare il bordo di massima del nuovo foro.
   3. Mettere tutte le parti inferiori piatto in un grande bicchiere e sciacquare più volte con acqua distillata per rimuovere i piccoli, pezzetti di plastica o polistirolo (che galleggiano). In seguito, giaceva il fondo piatto ad asciugare.
   4. Quando i piatti sono a secco, preparare il Sylgard 184 colla. Applicare una piccola cerchia di colla attorno al foro sulla superficie esterna di ogni piatto. Colla non molto è necessario, infatti, colla troppo faranno un pasticcio. Posizionare un vetro di copertura sul foro, a contatto con la colla. Il vetro di copertura dovrebbe sedersi contro il piatto senza intoppi e in modo uniforme. Se la colla non era perfettamente distribuito attorno al buco, poi ci potrebbero essere dei piccoli spazi in cui collante è mancante tra il vetro di copertura e fondo piatto. Inizialmente non preoccuparti di queste lacune, di solito la colla si insinuerà in queste lacune per riempirle.
   5. Dopo l'incollaggio su tutti i vetro di copertura, tornare indietro e controllare i piatti di lacune che non sono state chiuse con colla. In ogni lacuna, applicare una goccia di colla sul bordo del vetro di copertura presso il divario, la colla si stoppino nella fessura.
   6. Impostare i piatti a parte, lato basso verso l'alto, ad asciugare. Questo può richiedere uno o più giorni a temperatura ambiente, ma è possibile aumentare la velocità di polimerizzazione mettendo i piatti in un ambiente caldo incubatore.
   7. Se avete bisogno di piatti sterile, mettere il fondo piatto e coperchi in una cappa colture di tessuti e diffondere fuori. Non mettere il coperchio sul fondo piatto. Invece, ruotare i pezzi in modo che le loro superfici interne sono terribilictly di fronte alla lampada UV. Accendere la luce UV di sterilizzazione per almeno 45 min. Se si prevede di rivestire ConA i piatti (vedi sotto), non sterilizzare i piatti fino a dopo che sono rivestite.
   8. I piatti sono ora pronti per l'uso.
2. Utilizzando concanavalina A
   La lectina, concanavalina A (ConA), è stato trovato per stimolare le cellule S2 ad appiattirsi contro una superficie rivestita con ConA ^3. Quando le cellule S2 sono seminate su vetrini coprioggetto rivestiti con Cona, si diffondono e diventano campioni eccellenti per microscopia.
   1. Per ConA scivola coprire cappotto pianura, diffondere la coprioggetto pulito sulla cima di un pezzo di nastro adesivo Parafilm fino a un banco. Introdurre 10 μLs di un mg / 0,5 ml soluzione di Cona (in acqua sterile) sulla superficie di ogni vetrino, e poi distribuire il materiale su tutta la parte superiore della ricevuta di copertura. Dopo l'essiccazione, conservare il coperchio scivola in un contenitore pulito e asciutto. Il vetro rivestito può essere sterilizzato con la luce UV in una cappa di coltura di tessuti.
   2. Per rivestire ConA con fondo di vetro piatti, allo stesso modo 10 μLs diffusione della soluzione ConA sul lato superiore (ad esempio, coperchio rivolto a lato) del vetro. Dopo l'essiccazione, i piatti possono essere sterilizzate come sopra descritto. ConA rivestite piatti o coprioggetto sono conservati a temperatura ambiente e possono essere usati mesi dopo la preparazione.
3. Imaging
   1. Risospendere delicatamente le cellule trattate con RNAi S2 e trasferirli a Cona rivestite, con fondo di vetro piatto contenente 2 ml di medium. Cellule sane che contattare il ConA rivestite vetrino aderisce saldamente ad essa e iniziare a diffondersi. Questo processo dovrebbe manifestarsi di circa 15 minuti, e dovrebbe essere completata entro 45 minuti a 1 ora. Si noti che le cellule allegato non è possibile eseguire citocinesi a causa del loro attaccamento stretto alla ConA superficie rivestita e diventerà poliploidi nel tempo. Cellule seminate in ConA rivestite piatti rimarrà sano per lunghi periodi, ma non proliferare in questi piatti.
   2. Dopo che le cellule hanno attaccato, il mezzo può essere scambiata se il mezzo è vecchio autofluorescenti. Questo potrebbe non essere necessario per studi che utilizzano microscopi confocale o deconvoluzione o grande campo microscopi con piccole profondità di campo degli obiettivi.
   3. Dato che le cellule S2 sono in buona salute a temperatura ambiente / atmosfera normale, allora nessun condizioni speciali o attrezzature sono necessarie quando le cellule sono sul microscopio. Spesso ci vuole molto time-lapse film dal vivo di cellule S2. In pratica, il runtime di questi esperimenti è limitata dalla soliti problemi di photobleaching e fototossicità.

B. microscopio delle cellule fisso

1. Fondo di vetro piatti vs coprioggetto semplice: Entrambi questi programmi possono essere utilizzati in sede di fissazione delle cellule. Quando si utilizza scivola copertura piana, posto un unico ConA rivestita vetrino in un piatto individuale 35mm (che non ha bisogno di essere cultura di qualità del tessuto), aggiungere 2 ml di media, e poi trasferire le cellule RNAi trattati nel piatto. Dopo che le cellule hanno attaccato al vetrino, rimuovere il mezzo, brevemente lavare le cellule con un tampone appropriato (PBS funziona bene), e aggiungere il fissativo (vedi sotto) al piatto. In seguito, la polizza di copertura può essere rimossa dal piatto ed elaborati ulteriormente, ad esempio, mediante immunocolorazione.
2. Fissazione: Una varietà di metodi sono stati usati per fissare le cellule S2. Il miglior metodo di fissazione sarà determinato da quanto bene un fissativo conserva le caratteristiche di interesse, senza distruggere o perdere epitopi o proteine ​​tag. Alcune procedure richiedono una fase di estrazione prima fissazione per esporre gli epitopi di alcune proteine ​​situate in strutture dense e compatte. Dal momento che la letteratura cellule S2 è abbastanza estesa, di solito è possibile trovare un metodo pubblicato per risolvere in modo ottimale la struttura delle cellule S2 di interesse.
   1. Il metanolo è un fissativo comune. Il metanolo deve essere freddo (almeno -20 ° C) e anidro (setacci molecolari [3A tipo] può essere aggiunto al metanolo in acqua astratto). Noi freddo circa 300 ml di metanolo anidro in un bicchiere di vetro coperto 1L in una prova di esplosione congelatore 20 ° C. Quando il metanolo è freddo, togliere dal freezer, rapidamente rimuovere il supporto dal fondo di vetro piatto (o un piatto contenente un foglio di copertina), e poi rapidamente il piatto tuffo giù nel metanolo e lasciarlo lì. Il bicchiere di metanolo tiene di solito circa una dozzina di piatti. Lavorare velocemente e restituire il bicchiere (contenente i piatti) al congelatore nel più breve tempo possibile. Fissazione è completa in 10-15 minuti. In seguito, togliere i piatti dal bicchiere, versare qualsiasi metanolo residuo in esse, e reidratare loro con l'aggiunta di PBS / 0,1% Triton X-100. Ora sono pronto per le procedure di colorazione standard.
   2. La formaldeide è un altro fissativo comune. Noi usiamo il 10% di formaldeide in tampone (PBS è accettabile, ma utilizzare il buffer più adeguate alle proprie esigenze). Usiamo questa concentrazione relativamente alta di formaldeide perché le cellule S2mancanza citoplasmatici filamenti intermedi che altrimenti aiutare a mantenere la morfologia cellulare e organizzazione durante il processo di fissazione.
   3. Eliminare il fissativo in un becher da rifiuti e lavare le cellule fissate con tre lavaggi brevi PBST (PBS + 0,1% TritonX-100).
   4. Successivamente, aggiungere 1 ml di soluzione per bloccare le cellule per 15 minuti. Noi abitualmente uso 5% di siero normale di capra in PBST.
   5. Eliminare la soluzione di saturazione e aggiungere l'anticorpo primario (diluito in soluzione di blocco) direttamente sul cellulare. 100 l di soluzione di anticorpi deve coprire completamente le cellule. Mettere il coperchio Petri torna sul piatto per evitare l'evaporazione della soluzione di anticorpi. Lasciate che il incubare anticorpi con le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere la soluzione di anticorpi ed effettuare tre lavaggi PBST. Utilizzare una pipetta di trasferimento di aggiungere 2 ml di PBST al piatto. Attendere 5 minuti tra ogni lavaggio (non è necessario agitare il piatto).
   7. Eliminare l'ultimo lavaggio e aggiungere 100 ml di anticorpo secondario (diluito in soluzione di blocco) direttamente sul cellulare. Mettere il coperchio Petri torna sul piatto per evitare l'evaporazione della soluzione di anticorpi. Lasciate che il incubare anticorpi con le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente.
   8. Rimuovere l'anticorpo secondario e di eseguire tre minuti con 5 lavaggi PBST. Dopo l'ultimo lavaggio di dumping, aggiungere alcune gocce del supporto di montaggio a scelta direttamente sul cellulare. Noi usiamo 0,1 M gallato propile sciolto in una soluzione di glicerolo: PBS (9:1) e conservato a 20 ° C. Sostituire il coperchio Petri e conservare il piatto in un ambiente buio.

3. Limitazioni / problemi

Come per qualsiasi sistema sperimentale, ci sono delle limitazioni per l'uso di cellule S2. In primo luogo, una coltura di cellule S2 tipicamente presentano un basso indice mitotico (circa l'1% nel siero privo di media), mentre gli indici mitotico per molte linee cellulari di mammiferi sono trasformati fino a 10 volte più alta. Pertanto, per gli studi di fenotipi mitotico, colture di cellule S2 richiedono una ricerca più tempo per trovare le cellule opportunamente messa in scena. In secondo luogo, per lo studio del ciclo cellulare, trattamenti farmacologici sono molto efficaci ad arrestare le cellule S2 durante le fasi specifiche del ciclo cellulare. Tuttavia, composti che hanno reversibile del ciclo cellulare effetti arrestando in colture di cellule di mammifero non facilmente washout in cellule S2. Così, i protocolli per la sincronizzazione delle cellule proliferanti S2 non sono state stabilite. In terzo luogo, le cellule S2 non sono migratori né presentare caratteristiche epiteliali.

4. Risultati attesi

Il punto più venduto per le cellule S2 è la loro utilità come sistema modello. Sono particolarmente utili per valutare le funzioni cellulari della vostra proteina di interesse: cellule S2 sono trattati da dsRNA RNAi utilizzando che è facilmente (e relativamente a buon mercato), sintetizzati in laboratorio, e servono anche per l'analisi di cellule vive e di immunofluorescenza di cellule fissate . Inoltre, un vantaggio chiave per le cellule S2 è la facilità con cui possono essere mantenute in laboratorio, utilizzando relativamente poco costoso mezzo privo di siero e nessun tessuto cultura incubatrice.

Un tipico esperimento comporterebbe placcatura cellule S2 in un apposito contenitore coltura dei tessuti (ad esempio, un 6 o 96 pozzetti), aggiungendo fatti in casa dsRNA ai pozzi, e quindi mantenere le culture come bersaglio le proteine ​​vengono gradualmente esaurite da RNAi. A seconda delle proteine ​​bersaglio stanno esaurendo, le cellule possono mostrare un cambiamento morfologico e / o comportamentali a causa della proteina bersaglio knock-down. Il tempo necessario per ridurre l'espressione della proteina bersaglio al minimo è specifico per la proteina e deve essere determinato mediante Western blotting.

Normalmente le cellule S2 non aderiscono strettamente alla plastica o vetro, e questo potrebbe rappresentare un problema per gli esperimenti che richiedono l'esame al microscopio delle cellule trattate. Tuttavia, le cellule S2 può essere indotto a spianare estensivamente da semplicemente placcatura su una superficie ricoperta con la lectina, concanavalina A (ConA). Entro un'ora dalla placcatura in Cona, la maggior parte delle cellule hanno perso il loro aspetto arrotondato come risultato di diffondere ampiamente sulla superficie Cona (Figura 1). Le cellule sono ora pronti per ulteriori elaborazioni (per esempio, la fissazione e immunostaining) o l'osservazione microscopica di cellule vive.

S2 cellule possono anche essere transfettate (utilizzando una varietà di reagenti chimici o elettroporazione) a uno transitoriamente esprimere un gene esogeno o di incorporare stabilmente il gene nel genoma (creando così una linea cellulare che mantiene il gene esogeno attraverso ripetute divisioni). Trasfezioni può servire a molti scopi, come espressione di proteine ​​fluorescenti tag segno che le strutture di interesse fisso o in cellule vive (Figura 2), o che sono utilizzati come esca in esperimenti in vivo di pull-down o immunoprecipitazione, ecc

Il metodo di analisi dipende, couRSE, sulla questione biologica quali si indirizza l'esperimento. Un metodo comune di analisi di RNAi cellule trattate con S2 è immunofluorescenza di cellule fissa (Figura 3). Per esempio, immunofluorescenza è tipicamente usato con genoma schermi di librerie gene Drosophila per identificare rapidamente le proteine ​​con attività interessanti in vivo. L'analisi può essere fatta più elaborata contemporaneamente riducono proteine ​​bersaglio più in cellule S2 al fine di esaminare le potenziali interazioni funzionali tra le proteine ​​bersaglio. E l'analisi può essere estesa a cellule vive, per osservare l'effetto di RNAi sui processi dinamici. Anche in questo caso, le cellule S2 sono particolarmente adatte per questo tipo di analisi perché possono placcati in ConA rivestite il fondo di vetro piatti e visualizzati per molte ore su un microscopio invertito senza la necessità di una camera climatica.

Figura 1. Immagini a contrasto di fase (20x) di cellule S2 dopo placcatura su un A-rivestito concanavalina con fondo di vetro piatto. I numeri indicano i minuti dopo la placcatura. Si noti che le cellule diventano fase scuro come si appiattiscono sulla bolla di copertina patinata. Appiattimento delle cellule è evidente da 15 minuti (frecce) ed è sostanzialmente completo da 60 min. Pannello di destra: l'immagine ingrandita di cellule allegata; i loro margini estesi e appiattito sono chiaramente visibili (punta di freccia). Scala grafica (per i quattro pannelli a sinistra), 20 micron.

Cellule Figura 2. S2 transitoriamente transfettate con una fusione costruzione composto da nucleophosmin (un marker per il nucleo) fuso con il fluoroforo, eGFP (verde). Queste cellule sono state placcate in un ConA rivestite il fondo di vetro piatto, e poi ripreso con DIC e epifluorescenza. Scala grafica, 15 micron.

. Figura 3 celle fisso S2 immunostained per PLP (verde, un marker centriolo), microtubuli (rosso), e Hoechst-macchiato (blu) per i cromosomi. Prima di fissazione e immunostaining, le cellule sono state sottoposte a un giorno 4-trattamento con RNAi di controllo o RNAi per knock-down malattie croniche, un chinesina-come proteina che promuove la pole del mandrino "fuoco" ^4. Si noti la strombato poli del fuso e disorganizzato mandrini nelle cellule trattate con malattie croniche RNAi. Scala grafica, 2,5 micron.

Discussion

Per il settore della biologia cellulare, un sistema ideale dovrebbe essere poco costoso da mantenere, facile da manipolare, e suscettibili di una varietà di tecniche. Cellule di Drosophila S2 soddisfare questi requisiti, e quindi hanno rapidamente diventato il sistema di scelta per un numero crescente di cellulari laboratori di biologia.

Abbiamo presentato una breve panoramica dei metodi per preparare le cellule S2 per microscopia. Una virtù notevole di cellule S2 è il fatto che crescono bene in atmosfera normale e temperatura ambiente, quindi, possono lasciato sul microscopio per lunghi periodi senza necessità di manutenzione particolare. Anche se sono in genere leggermente arrotondata e vagamente aderente coltura in condizioni normali, le cellule S2 possono essere indotte ad appiattire estensivamente per l'imaging. Cellule S2 coltivati ​​su fondo di vetro piatti che sono stati pre-rivestito con concanavalina A legheranno e diffondere sottilmente sul vetrino, rendendole esemplari microscopia eccellente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S2 cells	ATCC	CRL-1963	http://www.atcc.org/
S2 cells	DGRC	stock number 6	https://dgrc.cgb.indiana.edu/
S2 cells	Invitrogen	R690-07
Sf900 II	Invitrogen	10902-096	serum-free medium
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30278	serum-free medium
Insect-Xpress	BioWhittaker	12-730	serum-free medium
Schneider’s S2 medium	Invitrogen	11720-034	Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium.
Fetal bovine serum	Invitrogen	10438026	heat inactivated
100x antibiotic solution	MP Biomedicals	91674049	contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL)
Concanavalin A	MP Biomedicals	195283
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	32% solution
Methanol	Mallinckrodt Baker Inc.	9049	anhydrous, ACS grade
Molecular sieves	Acros Organics	19724	type 3A