の準備ショウジョウバエ S2細胞

Summary

ショウジョウバエシュナイダー（S2）細胞は、遺伝子の発見と機能解析のためのますます普及システムです。私たちの目標は、このような重要性を増し、実験システムS2細胞を作る顕微鏡技術のいくつかを説明することです。

Abstract

理想的な実験系では、さまざまな技法に従順維持するために、安価で簡単になる、と広範な文献とゲノム配列のデータベースでサポートされる。培養ショウジョウバエ S2細胞を、引き離さ20〜24時間齢の胚¹の製品は、すべてのこれらの特性を有する。そのため、S2細胞は非常に分子プロセスのコンポーネントまたは関心のメカニズムをコードする遺伝子の発見を含む細胞プロセスの分析に適しています。それらのユーティリティのほとんどの責任があるS2細胞の特徴は、二本鎖（ds）RNAを介した干渉（RNAi）、および蛍光顕微鏡への従順さ、ライブまたは固定のどちらかのように彼らの絶妙な感度、それらが維持されると使いやすさです細胞。

S2細胞は、安価な、市販の、完全に定義されて、無血清培地²の数を含め、様々なメディアに成長させることができる。さらに、彼らは21〜24℃で最適にかつ迅速に成長し、コンテナの様々な培養することができる。哺乳動物細胞とは異なり、S2細胞は安定化の雰囲気を必要としませんが、代わりに通常の空気とよく行い、さらに密閉フラスコに維持することができる。

S2細胞にRNAi実験のしやすさを補完するのが容易に相または固定またはライブの細胞の蛍光顕微鏡で実験的に誘発された表現型を解析する機能です。 S2細胞は、単一の単層として培養中で成長が接触阻害を表示しません。その代わりに、細胞が密集培養物中のコロニーに成長する傾向がある。低密度で、S2の文化は、ラウンドと、ゆるやかに接続されているガラスまたは組織培養用プラスチック上に成長。しかし、S2細胞の細胞診は非常にレクチン、コンカナバリン^A（ConA）3を塗布した面に一時的に培養することにより、広くフラット化して、それらを誘導することによって改善することができます。 S2細胞はまた、安定してライブまたは固定化細胞への関心のラベルの構造や細胞小器官への蛍光タグ付きマーカーをトランスフェクトすることができます。したがって、細胞の顕微鏡分析のための通常のシナリオはこうです：まず、S2細胞は（タグ付きマーカーを発現する導入遺伝子を保有することができます）標的タンパク質（s）を除去するためにRNAiにより扱われます。 RNAi処理時間は、蛋白質の違いは、速度オーバーターンと標的蛋白質が存続にとって重要である場合、セルの外傷/死を最小限に抑えるためにできるように調整することができます。次に、処理した細胞を分散させる細胞を誘導し、しっかりとガラスに付着する錯那でプレコーティングカバースリップを含む皿に移しています。最後に、細胞を顕微鏡モードの研究者の選択方式で撮像する。これらの細胞は通常の室温、大気中で健康を維持するので、S2細胞は生細胞の拡張された可視化を必要とする研究に特に適しています。

Protocol

1。顕微鏡用のS2細胞を準備する

シュナイダーS2細胞は、オレゴン州R ショウジョウバエのトリプシン処理後期胚に由来した。シュナイダーのオリジナルの文化は、細胞型の混合物からなるが継続的な経過¹で、より均一になる。彼らは、血球のような遺伝子発現と（彼らは食である）マクロファージ様として記載されている。 S2細胞は、ATCC、DGRC、またはInvitrogen社から入手することができます。

増殖培地のA.の選択

メディアの数は、培養S2細胞に使用されている。メディアはいずれも5％CO ₂雰囲気を必要とする以下に記載しない。

1. シュナイダーは、もともと10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を添加した彼女定義された培地（シュナイダーのショウジョウバエの培地）を使用。 FBSは、下記の無血清培地よりも、この媒体はより高価になる一方で、それは相対的に低い自家蛍光を持っていますので、生細胞の落射蛍光顕微鏡に適しています。しかし、それは誘導の前に遺伝子の"漏れ"の発現を引き起こし、誘導性メタロチオネインプロモーター（例えば、Invitrogen社の光電子増倍管のベクターにサブクローニングした遺伝子）の制御下で、それらの導入遺伝子の発現の低レベルを刺激するのに十分な金属が含まれていますか。
2. いくつかの無血清培地（例えば、Sf900 II、HyClone SFX -昆虫、および昆虫- Xpressの）市販されている。これらのメディアは比較的安価ですが、メタロチオネインプロモーター調節など、シュナイダーの培地に比べて導入遺伝子を使用する際に通常の式のより高いレベルを刺激する。さらに、これらのメディアはシュナイダー"ミディアム/ FBS（生細胞蛍光顕微鏡を行う重要な考慮事項）に比べて大幅な自己蛍光を生じる。
3. に応じて、抗生物質を培地に添加することができるが、これらは通常、ペニシリンGおよびストレプトマイシン硫酸（50〜100単位/ mL、50〜μg/ mLの最終濃度は、それぞれ）です。また、抗真菌剤、アムホテリシンBは、250 ng / mLの（最終濃度）を追加することができます。

B.培養条件

S2細胞は容易に通常の実験室の温度と雰囲気の条件下に維持されています。イメージングは​​、拡張回S2細胞を生きるときに、細胞死の主な原因は、脱水や写真毒性です。脱水は、簡単に顕微鏡上皿に十分なメディアを保つことによって阻止される。光毒性は十分な空間分解能と時間分解能で面白いイベントをキャプチャするために十分な頻度で撮影しながら高輝度、高エネルギーの光への細胞の累積曝露を最小限に抑える必要がある厄介な問題です。

1. 組織培養プラスチック上に成長S2細胞は一般的に丸められ、緩く付着している。コンフルエント細胞が密単層として成長してから、ますます、より多くの細胞が持ち上げ、サスペンションに大きくなります。細胞はカバースリップの上に平らに誘導されている場合は、両方の固定と生細胞の顕微鏡観察のため、画像が大幅に改善されています。このトリックは、以下に説明されています（2。A. 2）。

2。 S2細胞の顕微鏡

A.ライブセル顕微鏡

私たちは、グラスボトムディッシュに播種ライブS2細胞を可視化する倒立顕微鏡を使用してください。ガラスボトムディッシュには、以下で説明、通常の培養条件に非常に類似の条件で細胞を保持し、また、生きた細胞を顕微鏡グレードのガラス越しに確認することができます。

1. ガラスボトムディッシュの準備
   
   コンポーネント：
   1. Sylgard 184シリコーンエラストマーキット
      これは皿にカバースリップを添付する接着剤です。使用直前に重量比：キットには、10:1（硬化剤樹脂）に混合される2つの部品、樹脂基材の成分と硬化剤を、持っています。
      樹脂/硬化剤の混合物を準備するには：
      1. ボートの重量を量るプラスチックに樹脂の約5 gを秤量。樹脂の重量に注意してください。
      2. 硬化剤は0.1で樹脂の重量を乗じて必要とされるどのくらいの計算。新しい転送ピペットを使用して、同じ重さのボートに硬化剤のこの量を追加。
      3. 徹底的に成分を混合してかき混ぜる。現れる気泡は気にしないでください、彼らは徐々に消えてしまいます。
      4. 接着剤の準備が整いました。それは蜂蜜のような一貫性を有し、少なくとも1時間使用可能になります。接着剤の5.5グラムは、約75皿を作るのに十分ですが、これは接着剤を適用するときにはどのようにけちに依存します。
   2. プラスチック製の35ミリメートルのペトリ皿
      その代わりに我々は安く、標準のペトリ皿を使用する - 我々は唯一の細胞は、ガラスの底（とではないプラスチック）にアタッチすることに興味を持っているので、我々は細胞培養グレードの皿を使用しないでください。いくつかの顕微鏡のステージは35を保持するために円形のクランプを持っているmmディッシュでは、これを持っている場合、お皿がクランプに適合することを確認してください。驚いたことに、すべての35ミリメートルの料理は同じ外径を持っていない。
   3. カバーガラス
      あなたの顕微鏡とニーズへの適切なカバースリップを選択してください。はるかに安いバルクのカバーガラス（例えば、VWR、22x22 mm角のガラスに、フォトエッチンググリッド（例えば、電子顕微鏡の科学、円形の23x23ミリメートル、グリッド、ない2、カタログ番号72264から23）で、高価な特殊ガラスから何も、ない。1.5、カタログ番号48366から227）を使用することができる。注意：ガラスは、ペトリ皿の中で行う予定穴よりも（少なくとも約1mm）より少し大きくなる必要があり、また皿の直径よりも小さくする必要があります。あなたが正方形のガラスを購入する場合、ガラスが完全に（と少し超えて拡張する）円形の穴をカバーしますが、皿の両側に到達しないことを確認してください。あなたのカバーガラスをきれいにしたい場合は、皿に接着して前に行ってください。
   4. パワードリル
      我々は、可変速度と連続的な使用のためのロックオンボタンでハンドドリルを使用。掘削の料理は、ドリルプレスではるかに簡単ですが、ガラスボトムディッシュの小規模生産では、ドリルプレスの購入を正当化するものではない。
   5. ドリルビット
      ¾インチスペードのドリルビットを（：http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bitスペードビットはこのウェブページに描かれている）を使用してください。もちろん、ビットの直径は、皿の底に穴の直径を決定します。
   6. 円錐形の研削ドリルビット
      粗いグリットとスペードビットと同じ直径約円錐状の研削ビットを使用してください。すべての穴がドリルされた後、皿の底からプロジェクトその穴の縁にあるプラスチックの断片を離れていが、このビットを使用してください。皿の外側面上にプラスチックの破片が料理にぴったり座ってからカバーガラスを防止します。皿の内部にまでこだわり、小さなプラスチック片を心配しないでください：彼らは、カバーガラスやセルには影響しません。
   7. 厚い壁と発泡スチロールの箱
      これは、掘削面として使用されます。シーリングテープ（我々は1.5インチスコッチシールテープを使用）のストリップで発泡スチロールの箱の一つ外側をカバーする、シールテープは、発泡スチロールながら掘削のビットの脱出を最小限に抑えます。
   
   アセンブリ
   1. 発泡スチロールの箱のテープ表面で35mmペトリ皿の下半分を置く、場所をので、その下側の料理は、発泡スチロールの箱に反している。しっかりと皿の両側を押しながら、皿穴をドリル。注意：皿を持ってあなたの指が回転するドリルビットから1インチの分数になります。当然、これは危険です。皿が回転し始める場合掘削を停止します。ドリルプレス及び/またはしっかりと皿を保持するために巧妙な方法がある場合は、それらを使用してください。私たちは、事故がなかったが、この手順を安全にするために必要なことを行ってくださいことがありません。
   2. あなたの料理のすべてを掘削した後、研削ドリルビットを使用して穴の外リムを滑らかに。我々は、ビットがカウンタの端から突出して、その側に電動ドリルを置く。ドリルは、（我々は砂の10キロを含む頑丈なビニール袋を使用）その上に重いものが柔軟に配置することによって固定されています。ドリルは連続して稼働を維持するためにロックオンボタンを使用して、それぞれの皿を保持し、新しい穴の粗いエッジを離れて滑らかに研削ビットに対してそれを動かすことによって、すべての皿の縁を滑らかに。
   3. 大きなビーカー内のすべての皿の底に置き、（フロートれる）プラスチックや発泡スチロールの小さな、緩い部分を削除するには、蒸留水で数回すすいでください。その後、乾燥するために皿の底をレイアウト。
   4. 皿が乾燥しているときに、あなたのSylgard 184接着剤を準備する。各皿の外側表面上に開けた穴の周囲に接着剤の小さな円を適用します。あまり接着剤が必要とされる、実際には、あまりにも多くの接着剤は、混乱を行います。接着剤に接触して、穴にカバーガラスを置きます。カバーガラスは、スムーズかつ均等に皿に抗議してください。接着剤が完全に穴の周りに分布されていない場合は、接着剤は、カバーガラスと皿の底の間に欠落している小さなギャップがあるかもしれません。当初はこれらのギャップを心配しないでください。通常接着剤は、それらを埋めるために、これらのギャップにクリープになります。
   5. カバーガラスのすべての上に接着した後、戻って、接着剤で閉じられていない隙間のための料理を確認してください。どんなギャップで、ギャップの近くにカバーガラスの端に接着剤の小さい軽打を適用し、接着剤は隙間に導火線になります。
   6. 乾燥する、、さておき底側を皿を設定します。これは、室温で一日以上かかることはできますが、温かいインキュベーターで皿を置くことによって硬化速度を向上させることができます。
   7. もし滅菌料理が必要な場合は、組織培養フードの皿の底と蓋を置き、それらを分散。皿の底に蓋を置かないでください。代わりに、彼らの内面が恐ろしいとなるようにピースを回しctly UV電球に直面して。少なくとも45分間殺菌するUVランプをオンにします。あなたが錯那コートディッシュ（下記参照）を計画している場合は、それらが被覆されるまで料理を滅菌しないでください。
   8. 料理は、使用する準備は完了です。
2. コンカナバリン使用
   レクチン、コンカナバリンAは（コナ）、コナ³で被覆された表面に対して平らにS2細胞を刺激することがわかった。 S2細胞はコナでコーティングしたカバースリップ上に播種されている場合、それらは普及し、顕微鏡のための優秀な標本となる。
   1. 錯那コートプレーンカバースリップに、ベンチの上にダウンテープパラフィルム片の上にきれいにカバースリップを広げる。場所は、10各カバースリップの表面上に錯那0.5 mg / mLの溶液（滅菌水で）のμLsし、カバースリップの上部全体にわたって材料を広げる。乾燥後、清潔で乾燥した容器にカバースリップを格納します。コー​​ティングされたガラスは、組織培養フードにUV光で滅菌することができる。
   2. 錯那コートガラスボトムディッシュに、同様にガラスの（すなわち、蓋に面した側）上部に錯那溶液10μLsを広げる。乾燥後、皿は、上述したように殺菌することができる。錯那コーティングされた皿やカバーガラスは、室温で保存され、調製後数ヶ月使用することができます。
3. イメージング
   1. 静かにRNAiを処理したS2細胞を再懸濁し、培地の2 MLSを含むコナ-コーティング、ガラスボトムディッシュに移す。錯那コーティングしたカバースリップに連絡して健康な細胞は、それにしっかりと付着して広がって開始されます。このプロセスは、約15分で明らかになるはず、と45分〜1時間で完了する必要があります。添付された細胞はコナでコーティングされた表面にともなってタイトな添付ファイルへの細胞質分裂を行うことができないと時間をかけて倍数体になることに注意してください。錯那 - コートディッシュに播種した細胞は、長期間健康なままですが、これらの皿で増殖しません。
   2. 細胞が接続したら、古い培地は自家蛍光の場合は、培地を交換することができます。これは小さい深さ - の - フィールドの目標に焦点またはデコンボリューション顕微鏡や広視野顕微鏡を用いた研究のために必要な場合があります。
   3. S2細胞は室温/通常の大気中での健康なので細胞が顕微鏡上にある場合は、特別な条件や設備は必要ありません。私たちはしばしば生S2細胞の長時間タイムラプスムービーを取る。実際には、これらの実験の実行時は、退色や光毒性の通常の問題によって制限されます。

B.固定細胞の顕微鏡

1. ガラスボトムディッシュ対プレーンカバースリップ：細胞を固定する際にこれらのいずれかを使用することができます。プレーンカバースリップを使用する場合は、1つのコナでコーティングされた個々の35mmディッシュ（どの組織培養グレードである必要はありません）にカバースリップを置き、皿にRNAiを処理した細胞を転送してメディアの2 MLSを追加し、。セルの後に簡単に適切なバッファー（PBSがうまくいく）で細胞を洗浄し、シャーレに固定液（下記参照）を追加し、培地を除去、カバースリップに連結しておく。免疫染色により、例えば、その後、カバースリップは、皿から削除することができ、さらに処理。
2. 固定：様々な方法がS2細胞を固定するために使用されている。最高の固定法は、固定液は、エピトープまたはタグ付きタンパク質を破壊したり失うことなく、関心の機能を維持する方法もによって決定されます。一部の手順は、密またはコンパクトな構造にあるいくつかのタンパク質のエピトープを露出させるために固定する前に抽出工程を必要とする。 S2細胞の文献がかなり広範囲なので、それが最適に興味のあるS2細胞の構造を修正するために公表された方法を見つけることは通常可能です。
   1. メタノールは一般的な固定液です。メタノールは寒いはずです（少なくとも-20℃）と無水（モレキュラーシーブ[タイプ3A]は抽象的な水へのメタノールに追加することができます）。防爆構造20℃の冷凍庫で覆われた1Lのガラスビーカーに無水メタノール300ml MLSについての我々は寒さ。メタノールが冷たいとき、すぐにグラスボトムディッシュ（またはカバースリップを含む皿）から培地を除去し、その後急速にメタノールに皿を下に沈めると、そこにそれを残す。、冷凍庫から取り出しますメタノールのビーカーは、通常十数皿を保持しています。素早く作業し、できるだけ早く冷凍庫にビーカーを（皿を含む）を返します。固定は10〜15分で完了です。その後、それらに残っているメタノールを注ぎ、ビーカーから料理を削除し、PBS / 0.1％トリトンX - 100を追加することによって、それらを再水和する。彼らは今標準的な染色の手順については、準備が整いました。
   2. ホルムアルデヒドは、別の一般的な固定液である。我々は、バッファ内の10％のホルムアルデヒドを（PBSが許容されるが、あなたのニーズに最も適切なバッファを使用）を使用します。我々は、ホルムアルデヒドのこの比較的高濃度のためS2細胞を使用そうでない場合は固定の過程で細胞の形態や組織を維持するために役立つだろう細胞質中間径フィラメントを欠いている。
   3. 廃棄物のビーカーに固定液を捨て、PBSTの三の簡単な洗浄（PBS + 0.1％TritonX - 100）で固定された細胞を洗う。
   4. 次に、15分間細胞にブロッキング溶液を1ml加える。我々は日常的にPBSTで5％正常ヤギ血清を使用してください。
   5. ブロッキング溶液を捨て、直接細胞に一次抗体（ブロッキング溶液で希釈）に追加します。抗体溶液を100μlの細胞を完全にカバーする必要があります。抗体溶液の蒸発を防ぐために戻って皿にペトリの蓋を置きます。抗体は、室温で30分間細胞とインキュベートしてみましょう。
   6. 抗体溶液を除去三PBSTで洗浄を行います。皿にPBST液2 mlを追加するには、転送ピペットを使用してください。各洗浄（スワール料理をする必要はない）の間に5分間待ちます。
   7. 最後の洗浄を捨て、直接細胞に二次抗体を100μlを（ブロッキング溶液で希釈）に追加します。抗体溶液の蒸発を防ぐために戻って皿にペトリの蓋を置きます。抗体は、室温で30分間細胞とインキュベートしてみましょう。
   8. 二次抗体を削除し、PBSTで3 5分間の洗浄を行います。最後の洗浄をダンプした後、直接細胞に選択のあなたのマウントメディアの数滴を追加します。 PBS（9:1）、20℃で保存：私たちは、グリセロールの溶液に溶解0.1 M没食子酸プロピルを使用してくださいペトリの蓋を交換して、暗い環境で料理を保存する。

3。制限/問題点

どんな実験システムと同様に、S2細胞の使用に制限があります。多くの形質転換哺乳動物細胞株のための有糸分裂指数はも10倍高いのに対し、最初に、培養S2細胞は一般的に、低分裂指数（無血清培地で約1％）を示す。したがって、有糸分裂の表現型の研究のために、S2細胞培養は、適切に、段階的な細胞を見つけるために長い探索が必要です。第二に、細胞周期の研究のために、薬物治療は、特定の細胞周期のフェーズでS2の細胞を阻止する非常に効果的です。しかし、培養哺乳動物細胞における可逆細胞周期逮捕作用を有する化合物は、簡単にS2細胞にウォッシュアウトされません。従って、増殖S2細胞を同期するためのプロトコルが確立されていない。第三に、S2細胞が渡り鳥ではなく、また彼らは、上皮性の特性を表示しません。

4。予想される結果

S2細胞のための最大のセールスポイントは、モデル系としてのユーティリティです。 S2細胞を実験室で合成容易であるdsRNAを（そして比較的安価）を使用してRNAiによって扱われ、彼らは生細胞の解析のために、固定細胞の免疫蛍光のための十分機能しています：彼らは目的タンパク質の細胞機能を評価するのに特に有用である。さらに、S2細胞への主な利点は、比較的安価な無血清培地と無組織培養インキュベーターを用いて、それらは実験室で維持することができる容易さです。

典型的な実験では、井戸にホームメイドのdsRNAを添加し、標的タンパク質が徐々にRNAiにより枯渇しているとして、その後の文化を維持し、適切な組織培養容器（例えば、6または96ウェルプレート）にS2細胞を播種伴うだろう。枯渇している標的タンパク質に応じて、細胞は、標的タンパク質ノックダウンの結果として形態学的および/または行動の変化が表示されることがあります。最小に標的タンパク質の発現を減少させるために必要な時間は、タンパク質に固有のもので、ウェスタンブロット法により決定されるべきである。

通常、S2細胞は、プラスチックやガラスにしっかりと付着していない、とこれは、処理された細胞の顕微鏡検査を必要とする実験問題になると考えられる。しかし、S2細胞は単にレクチン、コンカナバリンA（ConA）でコーティングされた表面上にめっきによって広く平坦化するように誘導することができます。錯那めっきの時間内に、ほとんどの細胞は錯那の表面（図1）を広範囲に拡散の結果として、その丸みを帯びた外観を失っている。細胞は現在、さらに処理（例えば、固定および免疫染色による）または生細胞の顕微鏡観察のための準備が整いました。

S2細胞はまた、いずれの一過性外因性遺伝子を発現したり、安定的にゲノム（したがって、繰り返し分裂を介して外来遺伝子を保持する細胞株を作成する）に遺伝子を組み込むために（化学試薬やエレクトロポレーションのさまざまな方法を使って）トランスフェクションすることができる。トランスフェクションはin vivoでの餌として使用されるマークの固定またはライブセルへの関心の構造（図2）、または、プルダウンいる蛍光標識タンパク質の発現と同様に、多くの目的を果たすか、免疫沈降実験などができる

分析の方法は、カップから、依存してRSE、実験によって解決されている生物学的な質問で。 RNAiを処理したS2細胞の分析の一般的な方法は、固定細胞（図3）の免疫蛍光です。例えば、免疫は通常、急速にin vivoでの興味深い活動をもつタンパク質を識別するために、 ショウジョウバエの遺伝子ライブラリーのゲノムワイドスクリーンで使用されます。分析は、同時に、標的タンパク質との間の潜在的な機能的相互作用を調べるために、S2細胞で複数の標的蛋白質を破壊する事で、より複雑な行うことができます。と分析は、動的なプロセスへのRNAiの効果を観察するために、細胞を生きて拡張することができます。彼らは錯那コーティングしたガラスボトムディッシュに播種し、環境室を必要とせずに倒立顕微鏡上に多くの時間を視覚化できるため、再び、S2細胞は、特にこのタイプの分析に適しています。

図1。コンカナバリンAでコーティングされたガラスボトムディッシュ上にプレーティング後のS2細胞の位相コントラスト画像（20倍拡大）。数字は、めっき後の分を示している。彼らはコーティングされたカバースリップの上平坦として細胞は暗期になることに注意してください。フラット化細胞は、15分（矢印）が明らかであると60分で本質的に完了です。右のパネル：接着細胞の拡大像は、その延長と平坦化されたマージンは、（矢じり）はっきりと見える。スケールバー（4個の左のパネル用）、20μmである。

一時的に融合がクレオ（核のマーカー）蛍光体に融合された、EGFP（緑色）から成るコンストラクトをトランスフェクション図2。S2細胞。これらの細胞は、コナでコーティングされたガラス底皿に播種し、DICと落射蛍光で撮像した。スケールバー、15μmの。

図3固定S2細胞では、PLP（緑、中心小体のマーカー）を免疫染色、微小管（赤）、および染色体（青）ヘキスト染色。固定と免疫染色の前に、細胞は^、NCD、4"焦点"紡錘体極を促進するキネシン様タンパク質をノックダウンする制御RNAiまたはRNAiのいずれかと4日間の治療を行った。 ncdのRNAi実験で処理した細胞では紡錘体極と無秩序なスピンドルをスプレイに注意してください。スケールバー、2.5ミクロン。

Discussion

細胞生物学の分野では、理想的なシステムは、維持するために安価な操作が容易、とのさまざまな技術に従順であろう。 ショウジョウバエ S2細胞がこれらの要件を満たすので、それらは急速に細胞の増加のために最適なシステムとなっている生物学研究所。

我々は、顕微鏡観察のためにS2細胞を準備する方法の概要を提示している。 S2細胞の顕著な美徳は、通常の大気中、室温でよく育つという事実であるため、彼らは特別なメンテナンスの必要なく、延長後の期間の顕微鏡に残さできます。それらは一般的にやや丸みを帯びた、通常の培養条件の下で緩く付着しているにもかかわらず、S2細胞が広範囲にイメージングのために平らに誘導することができる。コンカナバリンでプレコーティングしたガラスボトムディッシュ上で培養したS2細胞は、それらの優れた顕微鏡の標本作り、カバーガラス上に添付し、薄く広がっていく。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S2 cells	ATCC	CRL-1963	http://www.atcc.org/
S2 cells	DGRC	stock number 6	https://dgrc.cgb.indiana.edu/
S2 cells	Invitrogen	R690-07
Sf900 II	Invitrogen	10902-096	serum-free medium
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30278	serum-free medium
Insect-Xpress	BioWhittaker	12-730	serum-free medium
Schneider’s S2 medium	Invitrogen	11720-034	Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium.
Fetal bovine serum	Invitrogen	10438026	heat inactivated
100x antibiotic solution	MP Biomedicals	91674049	contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL)
Concanavalin A	MP Biomedicals	195283
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	32% solution
Methanol	Mallinckrodt Baker Inc.	9049	anhydrous, ACS grade
Molecular sieves	Acros Organics	19724	type 3A