Beredning av Drosophila S2 celler för ljusmikroskop

Summary

Drosophila Schneider (S2) celler är ett allt populärare system för upptäckt och funktionell analys av gener. Vårt mål är att beskriva några av de mikroskopiska tekniker som gör S2 celler såsom en allt viktigare experimentellt system.

Abstract

Det idealiska experimentella system skulle vara billig och lätt att underhålla, som lämpar sig för olika tekniker, och skulle stödjas av en omfattande litteratur och arvsmassa databas. Odlade Drosophila S2 celler, en produkt av skiljas 20-24 timmar gamla embryon ^1, har alla dessa egenskaper. Följaktligen S2 celler är mycket väl lämpad för analys av cellulära processer, inklusive upptäckten av gener som kodar för de molekylära komponenterna i processen eller mekanism av intresse. Funktionerna i S2 celler som är mest ansvariga för deras nytta är den lätthet med vilken de underhålls, deras utsökta känslighet för dubbel-strängat (DS) RNA-medierad interferens (RNAi), och deras spårbarhet för att fluorescensmikroskopi som antingen bor eller fast celler.

S2 celler kan odlas i en mängd olika medier, inklusive ett antal billiga, kommersiellt tillgänglig, fullt definierat, serum-fria medier ^2. Dessutom växer de optimalt och snabbt vid 21-24 ° C och kan odlas i en mängd olika behållare. Till skillnad från däggdjursceller, kräver S2 celler inte är en reglerad atmosfär, utan istället göra bra med vanlig luft och kan även hållas i slutna kärl.

Som komplement till enkel RNAi i S2 celler är förmågan att snabbt analysera experimentellt inducerad fenotyper av fas eller fluorescensmikroskopi av fasta eller levande celler. S2 celler växer i kultur som ett enda monolager men visa inte kontakt hämning. Istället celler tenderar att växa i kolonier i täta kulturer. Vid låga densitet, S2 kulturer som odlas på glas eller vävnadsodling behandlade plast är runda och löst bifogade. Däremot kan cytologi på S2 celler bli mycket bättre genom att få dem att platta i stor utsträckning av kort odling dem på en yta belagd med lectin, concanavalin A (Cona) ^3. S2 celler kan också vara stabilt transfererats med fluorescerande-märkta markörer för att märka strukturer och organeller av intresse i levande eller fasta celler. Därför är det vanliga scenariot för mikroskopisk analys av celler här: för det första S2 celler (som kan ha transgener uttrycka taggade markörer) behandlas med RNAi för att eliminera ett målprotein (s). RNAi behandlingstiden kan justeras för att möjliggöra för skillnader i protein omsättning kinetik och för att minimera cell trauma / dödsfall om målprotein är viktigt för lönsamheten. Vidare är de behandlade cellerna överföras till en maträtt som innehåller ett täckglas före belagda med Cona att få celler att sprida och tätt följa glaset. Slutligen celler avbildas med forskaren val av mikroskopi lägen. S2 celler är särskilt bra för studier som kräver längre visualisering av levande celler eftersom dessa celler hålla sig frisk i rumstemperatur och normal atmosfär.

Protocol

1. Förbereda S2 celler för mikroskopi

Schneider S2 celler från trypsinized sent embryon i Oregon R Drosophila. Schneiders ursprungliga kulturen bestod av en blandning av celltyperna, men de blev mer homogen med fortsatt passage ^1. De har beskrivits som makrofager-liknande (de är fagocytos) med hemocyte-liknande genuttryck. S2 celler kan erhållas från ATCC, DGRC eller Invitrogen.

A. Val av odlingsmedium

Ett antal medier har använts till kultur S2 celler. Ingen av de medier som anges nedan kräver en 5% CO ₂ atmosfär.

1. Schneider använde ursprungligen hennes definierat medium (Schneiders Drosophila medium) kompletterad med 10% värmeinaktiveras fetalt bovinserum (FBS). Samtidigt som FBS gör detta medium dyrare än serumfritt medier nämns nedan, har det relativt låg autofluorescens och så är ett bra val för epifluorescence mikroskopi av levande celler. Däremot innehåller den tillräckligt med metall för att stimulera en låg nivå av uttryck dessa transgener under kontroll av inducerbara metallothionein promotor (t.ex. gener subcloned i Invitrogen PMT vektor) och orsakar "läckande" uttryck av genen före induktion.
2. Flera serumfritt media är kommersiellt tillgängliga (t.ex. Sf900 II, HyClone SFX-insekter och insekt-Xpress). Dessa medier är relativt billiga, men oftast stimulera högre nivåer av uttryck när man använder metallotioneinbundet promotorn reglerade transgener jämfört med Schneiders medium. Dessutom är dessa medier ge betydande autofluorescens jämfört med Schneiders "medium / FBS (en viktig faktor när uppträder live mikroskopi cell fluorescens).
3. Alternativt kan antibiotika tillsättas medium, dessa är oftast penicillin G och streptomycin sulfat (50-100 enheter / ml och 50-100 mikrogram / ml slutliga koncentrationer, respektive). Dessutom kan anti-svamp reagens, amfotericin B, läggas till 250 ng / ml (slutlig koncentration).

B. Kultur villkor

S2 celler är lätt bibehållas under normala lab temperatur-och atmosfär. När avbildning lever S2 celler för utökad gånger, de främsta orsakerna till celldöd är uttorkning och foto-toxicitet. Dehydrering är lätt förhindras genom att hålla tillräckliga medel i skålen på mikroskopet. Photo-toxicitet är en svårare problem som kräver att minimera cellernas kumulativa exponeringen för hög intensitet, hög energi ljus medan avbildning tillräckligt ofta för att fånga intressanta evenemang med tillräcklig rumslig och tidsmässig upplösning.

1. S2 celler som växer på vävnadsodling plast är i allmänhet runda och löst anhängare. Sammanflytande celler växer som en tät cellslager och därefter i allt högre grad kommer fler celler lyfta av och växa i suspension. För mikroskopi av både fasta och levande celler är imaging mycket bättre om cellerna induceras att platta på locket halka. Detta trick är beskrivs nedan (2. A. 2.).

2. Mikroskopi av S2 celler

A. Levande celler mikroskopi

Vi använder omvänt mikroskop för att visualisera leva S2 celler pläterade på glasbottnade rätter. Den glasbottnade rätter som beskrivs nedan kommer att hålla cellerna i ett tillstånd som liknar deras normala odling tillstånd, och tillåter också att levande celler som skall undersökas genom mikroskopi-grade glas.

1. Beredning av glas-bottom rätter
   
   Komponenter:
   1. Sylgard 184 silikonelastomer kit
      Detta är limmet att fästa täckglas till disken. Satsen har två delar, harts baskomponenten och härdare, som blandas i en 10:1 (harts: härdare) viktförhållande strax före användning.
      För att förbereda bas / härdare blandning:
      1. Väg upp cirka 5 g av massan till en plast väger båt. Notera vikten av kåda.
      2. Beräkna hur mycket härdare behövs genom att multiplicera harts vikt med 0,1. Lägg till denna mängd härdare i samma väger båten med en ny överföring pipett.
      3. Rör om att blanda komponenterna. Oroa dig inte om bubblor som visas, de kommer att sakta försvinna.
      4. Limmet är nu klar. Den har en honung konsistens och kommer att användas i minst en timme. 5,5 g lim är tillräckligt för att göra cirka 75 rätter, men det beror på hur snål du är när du använder lim.
   2. Plast 35mm petriskålar
      Vi använder inte celler rätter kultur klass eftersom vi är bara intresserade av att ha celler fäster vid glaset botten (och inte plast) - så i stället använder vi billigare, vanliga petriskålar. Vissa mikroskop stadier har cirkulära klämmor 35mm rätter, om du har detta, vara säker på att disken passar klämman. Överraskande nog inte alla 35mm rätter har samma ytterdiameter.
   3. Skyddsglas
      Välj täckglas passar ditt mikroskop och behov. Allt från dyra specialitet glas med fotoetsas nät (t.ex. Electron Sciences Mikroskopi, 23x23 mm runda, inrutade, nej. 2, kat. Nej. 72.264-23) till mycket billigare bulk skyddsglas (t.ex. VWR, 22x22 mm i kvadrat glas , nej. 1,5, kunde katt. nej. 48.366-227) användas. Varning: Glaset ska vara något större (minst ca 1 mm) än hålet som du gör i petriskål, och måste också vara mindre än diametern på skålen. Om du tänker köpa kvadrat glas, se till att glaset helt och hållet kommer att täcka (och sträcker sig lite utanför) det cirkulära hålet, men kommer inte att nå sidorna av skålen. Om du föredrar att rengöra din skyddsglas, gör det innan limma dem till disken.
   4. Borrmaskin
      Vi använder en hand borrmaskin med variabel hastighet och ett lås-on knappen för kontinuerlig användning. Borrning rätter är mycket lättare med en borr press, men småskalig produktion av glas-bottom rätter inte motiverar köp av en borr press.
   5. Borr
      Använd en ¾ tums lite spade borrmaskin (en spade lite avbildas på denna sida: http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit). Naturligtvis bestämmer diametern på lite diametern på hålet i botten på skålen.
   6. Konisk slip borr
      Använd ett koniskt formad slipning bit med ett grovt grus och en diameter ungefär lika mycket som spaden lite. När alla hål har borrats, använd denna bit till Bur bort plasten fragment vid kanten av hålet som projektet från botten av skålen. Plast fragment på utsidan ansiktet av skålen kommer att undvika att den täckande glaset från att sitta tätt mot skålen. Oroa dig inte för små plastbitar sticker upp i skålen inredning: de kommer inte att påverka täcker glas eller cellerna.
   7. Frigolitlåda med tjocka väggar
      Detta används som borrning ytan. Täck en yttre sidan av frigolitlåda med remsor av tätningsband (vi använder 1,5 tum Scotch tätning), förseglingstejpen minimerar läckage av bitar av frigolit under borrningen.
   
   Montering
   1. Placera den nedre halvan av en 35 mm petriskål på frigolitlåda är tejpade yta, placera skålen så det är dess nedersta sidan är mot frigolitlåda. Håll sidorna av skålen ordentligt, borra ett hål genom skålen. Varning: Din fingrar som håller skålen kommer att vara en bråkdel av en tum från en roterande borr. Detta är naturligtvis farlig. Sluta borra om skålen börjar snurra. Om du har en borr press och / eller ett smart sätt att hålla skålen fast, använda dem. Vi har aldrig haft en olycka, men gör vad du måste göra denna procedur säker.
   2. Efter borrning alla dina rätter, släta utsidan kanten på hålen med slipning borr. Vi lägger kraften borra på sin sida, med lite utstickande ut över kanten på disken. Borren hålls på plats genom att placera något tungt, men smidig på det (vi använder en tung väska plikt plast som innehåller 10 kg sand). Använd lock-on-knappen för att hålla borren kontinuerligt löpande, och sedan släta fälgar av alla dina rätter genom att hålla varje rätt och flytta den mot mala lite för att släta ut den grova kanten av det nya hålet.
   3. Lägg alla skålen bottnar i en stor bägare och skölj dem flera gånger med destillerat vatten för att ta bort små, lösa bitar av plast eller frigolit (som flyter). Efteråt låg skålen bottnar att torka.
   4. När disken är torr, förbereda din Sylgard 184 lim. Applicera en liten krets av lim runt det borrade hålet på utsidan av varje maträtt. Inte mycket lim behövs, i själva verket kommer att för mycket lim att göra en enda röra. Placera ett skyddsglas över hålet, i kontakt med lim. Locket glaset ska sitta mot skålen mjukt och jämnt. Om limmet inte var perfekt ut runt hålet, då det kan finnas små luckor där limmet saknas mellan täckglaset och fat botten. Initialt oroa dig inte om dessa brister, oftast lim kommer krypa in i dessa luckor att fylla dem.
   5. Efter limning på alla skyddsglas, gå tillbaka och kontrollera rätter för luckor som inte har stängts av lim. Vid varje lucka, applicera en liten klick lim på kanten av täckglaset nära klyftan, limmet kommer veken i gapet.
   6. Ställ in disken åt sidan, botten uppåt för att torka. Detta kan ta en dag eller mer i rumstemperatur, men du kan öka Härdningshastighet genom att sätta disken i en varm kuvös.
   7. Om du behöver steril rätter, satte skålen bottnar och lock i en vävnadsodling huva och spred ut dem. Lägg inte locket på skålen bottnar. Istället slår de bitar så att deras inre ytor är svåractly mot UV-lampa. Slå på sterilisering UV-ljus i minst 45 min. Om du planerar att Cona päls disken (se nedan), Sterilisera inte disken förrän de är belagda.
   8. Disken är nu klar för användning.
2. Använda concanavalin A
   Den lectin, concanavalin A (Cona), konstaterades att stimulera S2 celler för att platta till mot en yta belagd med Cona ^3. När S2 celler är seedade på täckglas belagd med Cona, sprids de och blir utmärkta exemplar för mikroskopi.
   1. För att Cona päls vanligt täckglas, sprida rengöras täckglas ovanpå en bit Parafilm tejpade ner till en bänk. Plats 10 μLs av en 0,5 mg / ml lösning av Cona (i sterilt vatten) på ytan av varje täcka halka, och sedan sprida materialet över hela toppen av locket halka. Efter torkning, förvara täckglas i en ren och torr behållare. Den belagt glas kan steriliseras med UV-ljus i en vävnad kultur huva.
   2. För att Cona päls glasbottnade rätter, på samma sätt sprids 10 μLs av Cona lösning på den övre sidan (dvs locket som vetter mot sida) av glaset. Efter torkning kan disken steriliseras enligt ovan. Cona-belagda rätter eller täckglas förvaras i rumstemperatur och kan användas månader efter beredning.
3. Imaging
   1. Försiktigt resuspendera RNAi-behandlade S2 celler och överföra dem till en Cona-belagd, glas-botten maträtt innehållande 2 ml av mediet. Friska celler som kontaktar Cona-belagda täckglas kommer att följa tätt till det och börja sprida sig. Denna process bör bli uppenbara med ca 15 min, och bör vara klar med 45 min till 1 tim. Observera att bifogade celler inte kan utföra cytokines på grund av deras snäva infästning i Cona-belagda ytan och blir polyploida tiden. Celler seedade i Cona-belagda rätter kommer att vara friska under längre perioder, men kommer inte förökar sig i dessa rätter.
   2. Efter att cellerna har bifogat, kan mediet bytas om det gamla mediet är autofluorescent. Detta kanske inte är nödvändigt för studier med konfokala eller deconvolution mikroskop eller brett fält mikroskop med små djup-of-field mål.
   3. Eftersom S2 celler är friska i rumstemperatur / normal atmosfär, då inga särskilda villkor eller utrustning som behövs när cellerna är på mikroskopet. Vi tar ofta långa tidsintervaller filmer av levande S2 celler. I praktiken är runtime av dessa experiment begränsas av de vanliga problemen med fotoblekning och fototoxicitet.

B. Fast cell mikroskopi

1. Glas-botten rätter kontra vanligt täckglas: En av dessa kan användas vid fastställandet celler. När man använder vanlig täckglas, placera en enda Cona-belagd täcka glida in en enskild 35mm skålen (som inte behöver vara vävnadsodling kvalitet), tillsätt 2 ml av media, och sedan överföra RNAi-behandlade celler i skålen. Efter celler har fäst locket glida, ta bort mediet, kort tvätta cellerna med en lämplig buffert (PBS fungerar bra), och lägg till fixeringsmedel (se nedan) till skålen. Därefter kan locket glida bort från skålen och bearbetas vidare, till exempel genom immunfärgning.
2. Fästanordning: En rad olika metoder har använts för att fixa S2 celler. Den bästa Fixeringsmetod avgörs av hur väl ett fixativ bevarar drag av intresse, utan att förstöras eller förlora epitoper eller taggade proteiner. Vissa procedurer kräver en extraktionen innan fixeringen för att avslöja epitoper av vissa proteiner som finns i täta och kompakta strukturer. Eftersom S2 cellen litteraturen är ganska omfattande, är det oftast möjligt att hitta en publicerad metod för att optimalt fixa din S2 cellstruktur av intresse.
   1. Metanol är ett vanligt fixativ. Den metanol ska vara kall (minst -20 ° C) och vattenfri (kan molekylära filter [typ 3A] läggas till metanol till abstrakta vatten). Vi chill om 300 ml av vattenfri metanol i en täckt 1L glasbägare i en explosionssäker 20 ° C frys. När metanol är kall, ta bort den från frysen, snabbt bort mediet från glaset botten skålen (eller fat som innehåller en cover slip), och sedan snabbt doppa skålen ner i metanol och lämna den där. Bägaren av metanol håller normalt ett tiotal rätter. Arbeta snabbt och gå tillbaka bägaren (som innehåller rätter) i frysen så snart som möjligt. Fixering är klar i 10-15 min. Efteråt, ta bort disken från bägaren, häller ut alla metanol kvar i dem, och återfuktar dem genom att lägga till PBS / 0,1% Triton X-100. De är nu redo för standard färgning förfaranden.
   2. Formaldehyd är en annan vanlig fixativ. Vi använder 10% formaldehyd i buffert (PBS är acceptabelt, men använd bufferten mest lämplig för dina behov). Vi använder denna relativt hög koncentration av formaldehyd eftersom S2 cellerBristen cytoplasmiska mellanliggande trådar som annars skulle bidra till att upprätthålla cellmorfologin och organisation under fixering processen.
   3. Häll av fixativ i ett avfall bägare och tvätta fast cellerna med tre korta tvättar av PBST (PBS + 0,1% TritonX-100).
   4. Lägg sedan till 1 ml blockerande lösningen till cellerna i 15 minuter. Vi använder rutinmässigt 5% normala get serum i PBST.
   5. Häll av den blockerande lösningen och tillsätt primära antikroppen (spätts i blockerande lösning) direkt på cellerna. 100 l av antikropp lösning bör helt täcka cellerna. Sätt Petri locket tillbaka på skålen för att förhindra avdunstning av antikroppen lösningen. Låt antikroppen inkubera med cellerna i 30 minuter i rumstemperatur.
   6. Ta bort antikroppar lösningen och utföra tre PBST tvättar. Använd en överföringsmetod pipett för att lägga till 2 ml av PBST till skålen. Vänta 5 minuter mellan varje tvätt (du behöver inte snurra skålen).
   7. Häll av den sista tvättningen och tillsätt 100 l av sekundär antikropp (spätts i blockerande lösning) direkt på cellerna. Sätt Petri locket tillbaka på skålen för att förhindra avdunstning av antikroppen lösningen. Låt antikroppen inkubera med cellerna i 30 minuter i rumstemperatur.
   8. Ta bort den sekundära antikroppen och utföra tre 5 minuter tvättar med PBST. Efter dumpningen den sista tvättningen, tillsätt några droppar av din monteringsmedel val direkt på cellerna. Vi använder 0,1 miljoner propylgallat upplöst i en lösning av glycerol: PBS (9:1) och förvaras vid 20 ° C. Byt Petri locket och förvara skålen i mörk miljö.

3. Begränsningar / problem

Som med alla experimentella system, det finns begränsningar för användningen av S2 celler. Först odlade S2 celler uppvisar normalt en låg mitotiskt index (ca 1% i serum-fria medier), medan mitotiska indexen för många transformerade däggdjursceller cellinjer är så mycket som 10 gånger högre. Därför för studier av mitotiska fenotyper, S2 cellodlingar kräver en längre sökning för att hitta lämpligt-iscensatt celler. För det andra, för studier cellcykeln, läkemedelsbehandling är mycket effektiva på att arrestera S2 celler under vissa faser cellcykeln. Däremot föreningar som har reversibla cell-cykeln arrestera effekter i odlade däggdjursceller inte lätt wash-out i S2 celler. Således har protokoll för synkronisering förökar S2 celler inte fastställts. Tredje, S2 celler är inte flyttfåglar inte heller visa epiteliala egenskaper.

4. Förväntade resultat

Den största försäljningsargument för S2 celler är deras nytta som modellsystem. De är särskilt användbara för att bedöma cellulära funktioner i din protein av intresse: S2 celler behandlas med RNAi använda dsRNA som är lätt (och relativt billigt) syntetiseras i labbet, och de tjänar bra för levande cell analys och för immunofluorescens av fast celler . Dessutom är en viktig fördel till S2 celler den lätthet med vilken de kan upprätthållas i labbet, med hjälp av relativt billig serumfritt medium och ingen vävnadsodling inkubator.

Ett typiskt experiment skulle innebära bordläggning S2 celler i en lämplig vävnadsodling behållare (säg, en 6 eller 96 brunnar), lägga hemlagad dsRNA till brunnarna och sedan behålla de kulturer som de riktade proteiner successivt utarmas av RNAi. Beroende på målet proteinerna utarmat, får cellerna visar en morfologisk och / eller beteendeförändringar som resultat av målprotein knock-down. Den tid som krävs för att minska uttrycket målprotein till ett minimum är specifikt för protein och bör bestämmas av Western blotting.

Normalt S2 celler följer inte tätt till plast eller glas, och detta skulle innebära ett problem för experiment kräver mikroskopisk undersökning av behandlade cellerna. Däremot kan S2 celler förmås att platta utsträckning genom att helt enkelt bordläggning dem på en yta belagd med lectin, concanavalin A (Cona). Inom en timme bordläggning på Cona har de flesta celler som förlorat sina rundade utseende som en följd av spridning i stor utsträckning på Cona ytan (figur 1). Cellerna är nu klara för vidare bearbetning (t.ex. genom fixering och immunfärgning) eller mikroskopiska observationer av levande celler.

S2 celler kan också transfekterade (med hjälp av olika kemiska reagenser eller elektroporation) till antingen övergående uttrycka en exogen gen eller stabilt införliva gen i arvsmassan (vilket skapar en cellinje som upprätthåller exogena genen genom upprepade divisioner). Transfections kan tjäna många syften, som t.ex. uttryck av fluorescerande taggade proteiner som markerar strukturer av intresse i fasta eller levande celler (figur 2), eller som används som bete i in vivo-pull-down eller immunoprecipitation experiment, etc.

Analysmetoden beror på couRSE, på biologiska frågor som behandlas i försöket. En vanlig metod för analys av RNAi-behandlade S2 celler immunofluorescens av fast celler (Figur 3). Till exempel är immunofluorescens används normalt med genomet hela skärmar Drosophila gen bibliotek för att snabbt identifiera proteiner med intressanta aktiviteter in vivo. Analysen kan göras noggrannare genom att samtidigt bryter ned flera mål proteiner i S2 celler för att undersöka den potentiella funktionella samspelet mellan målproteiner. Och analysen kan utsträckas till levande celler, att observera effekten av RNAi på dynamiska processer. Återigen S2 celler är särskilt väl lämpad för denna typ av analys eftersom de kan pläterade på Cona-belagt glas-bottom rätter och visualiseras för många timmar på ett inverterat mikroskop utan behov av en klimatkammare.

Figur 1. Faskontrast bilder (20x förstoring) av S2 celler efter bordläggning på ett concanavalin A-belagt glas-bottom skålen. Siffrorna anger minuter efter bordläggning. Observera att cellerna blir fasen mörkt när de platta på den belagda täckglas. Cell plattas framgår av 15 min (pilar) och är i huvudsak komplett med 60 min. Högra panelen: förstorad bild av bifogade celler, deras utökade och tillplattad marginaler syns tydligt (pilspets). Skala bar (för de fyra vänstra panelerna), 20 ìm.

Figur 2. S2 celler övergående transfekterade med en fusion konstruktion bestående av nucleophosmin (en markör för kärnan) smält till fluoroforen, EGFP (grön). Dessa celler var klädd på ett Cona-belagt glas botten maträtt, och sedan avbildade med DIC och epifluorescence. Skala Bar, 15 ìm.

. Figur 3 Fasta S2 celler immunostained för PLP (grön, en centriole markör), mikrotubuli (röd), och Hoechst-färgade (blå) för kromosomer. Innan fixering och immunfärgning var cellerna utsätts för en 4-dagars behandling med antingen kontroll RNAi eller RNAi för att slå ner NCD, en kinesin-liknande protein som främjar spindel pol "fokusera" ^4. Notera utspärrade spindeln polerna och oorganiserad spindlar i cellerna behandlas med NCD RNAi. Skala bar, 2,5 ìm.

Discussion

För cellbiologi området, skulle ett idealiskt system vara billig att underhålla, lätt att manipulera, och kan bli föremål för en mängd olika tekniker. Drosophila S2 celler uppfyller dessa krav, och så de har snabbt blivit det system med valet för ett växande antal celler biologi labb.

Vi har presenterat en kort översikt av de metoder för att förbereda S2 celler för mikroskopi. En anmärkningsvärd kraft av S2 celler är att de växer bra i normal atmosfär och rumstemperatur, därför kan de kvar på mikroskop för längre perioder utan något särskilt underhåll. Trots att de i allmänhet något som är rund och löst vidhäftande under normala odling förhållanden kan S2 celler förmås att utförligt platta för avbildning. S2 celler odlade på glasbottnade rätter som har pre-belagda med concanavalin A kommer att fästa och sprids tunt på locket glida, vilket gör dem utmärkta mikroskopi exemplar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S2 cells	ATCC	CRL-1963	http://www.atcc.org/
S2 cells	DGRC	stock number 6	https://dgrc.cgb.indiana.edu/
S2 cells	Invitrogen	R690-07
Sf900 II	Invitrogen	10902-096	serum-free medium
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30278	serum-free medium
Insect-Xpress	BioWhittaker	12-730	serum-free medium
Schneider’s S2 medium	Invitrogen	11720-034	Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium.
Fetal bovine serum	Invitrogen	10438026	heat inactivated
100x antibiotic solution	MP Biomedicals	91674049	contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL)
Concanavalin A	MP Biomedicals	195283
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	32% solution
Methanol	Mallinckrodt Baker Inc.	9049	anhydrous, ACS grade
Molecular sieves	Acros Organics	19724	type 3A