טכניקות הדמיה Ca ^{2 +} איתות זרע אנושי

Summary

Stimulus-עורר [Ca

Abstract

מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים עמוסה ניאון, Ca

Protocol

זרע מהזכרים פורייה ובריאה, עם ניתוח זרע נורמלית, מוכנים בדרך כלל כדלקמן הדמיה.

1. דגימות הזרע מאוחסנים על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות לא יותר מאשר 30. תאים מבודדים פלזמה הזרע על ידי לשחות לתוך פתרון בתוספת מלח מאוזנת של ארל (sEBSS: mm: 1.8 CaCl ₂ .2 H ₂ O, 5.37 KCl, 0.81 MgSO ₄ 0.7 H ₂ O, 26.2 NaHCO _3, 1.0 לאא ₂ PO _4. 2H ₂ O, 116.4 NaCl, 55.6 D-גלוקוז, 2.73 pyruvate Na, Na 41.8 לקטט) בתוספת 0.3% de-lipidated/fatty פחם חומצה חינם שבר V BSA (באיכות של BSA הוא קריטי עבור capacitation מוצלחת של הזרע). 1 מ"ל של sEBBS הוא pipetted לתוך כל סדרה של צינורות 5 מ"ל ו underlayered בעדינות עם 0.3 מ"ל של נוזל הזרע. לאחר הדגרה במשך שעה 1 (37 ° C; 6% CO ₂₎ מעל 0.7 מ"ל מוסרת בעדינות מהצינור כל ונקווה. 10 μl של השעיה הזרע הוא מדולל עם 90 μl של 1% (v / v) פורמלין כדי לשתק את התאים, אז זרע נספרים בתא Neubauer. צפיפות התאים בתרחיף הוא מותאם אז (עם sEBSS) עד 6 מיליון תאים / מ"ל.
2. המדגם נחלק אז צינורות רופף הכתיר וטופחו (37 ° C; 6% CO ₂₎ אל aliquots של μl 200 ב עבור 5-6 שעות כדי לאפשר capacitation.
3. Coverslips (22x50 מ"מ) בעבר שטופלו poly-D-ליזין. 10 μl של פתרון poly-D-ליזין (10% w / v) מוחל גם מספר טיפות קטנות למרכז coverslip. Poly-D-ליזין מותר אז לייבוש באוויר. זה יכול להיות על במה מחוממת צריכה להיות יבשה לחלוטין. Coverslip מצורף עם גריז ואקום סגורה, ייעודית, perfusable, פוליקרבונט הדמיה קאמרית (מידות 35 מ"מ x 20 מ"מ x 5 מ"מ; יכולת ≈ 180 μl). דומה לחדר וורנר פולי RC20-D-ליזין, coverslip מצופה מהווה את הבסיס של החדר כאשר תאים נתפסים על מיקרוסקופ הפוך בקוטר 12 מ"מ עגול coverslip צורות פני השטח העליון של החדר, המאפשר העברת אור.
4. אורגון גרין BAPTA1-AM (OGB) או סידן גרין 1-AM משמשים התאים תיוג. OGB מוכן ידי המסת ב DMSO. Pluronic חומצה F127 (חומר ניקוי) נכלל DMSO כדי למנוע "clumping" של צבע. זה יכול להיות מוכן במעבדה (100 Pluronic מ"ג 0.5 מ"ל DMSO), מיד לפני השימוש, או ניתן לרכוש מוכנה מראש. 20 μl מתווסף aliquot 50 מיקרוגרם של OGB (2.5 מ"ג / מ"ל). בקבוקון אז יכול להיות מאוחסן קפוא מופשר לשימוש מאוחר יותר.
5. לאחר capacitation של הזרע (5-6 שעות ב sEBBS, 37 ° C; 6% CO ₂₎ צינור נבחרה הדמיה 1.2 μl של פתרון OGB הוא הוסיף, נותן ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. הצינור הוא מודגרות מכן 40 דקות נוספות, לאחר ההשעיה תא מוזרק בעדינות לתוך הנמל יבוא של חדר הדמיה עם טיפ p1000 פיפטה (כחול). החדר ממוקם בצד coverslip חממה, poly-D-ליזין מצופה למטה, עבור 20 דקות. תאים נוטים לשחות לאורך פני השטח של התא ו תדבק אזור poly-D-ליזין מצופה.
6. החדר מותקן עכשיו על המיקרוסקופ, קשור למנגנון זלוף ו perfused דקות ב כ 0.5 מ"ל /. משאבת הרים הזנות מלוחים לתוך החדר ואת הצפת מנמל היציאה הוסר על ידי משאבה יניקה עם מלכודת. הכנה נשאר בחושך דקות לפחות 10 תוך התאים רופף לצבוע תאיים יוסרו על ידי טפטוף של החדר. יציבות טמפרטורה היא חשיבות מכרעת כי תנודות קטנות לא רק להשפיע על התא Ca ^{2 +} הומאוסטזיס, אך עשוי גם להשפיע על K _d של צבע. הניסויים מבוצעים בדרך כלל על 25 מעלות צלזיוס, מושגת על ידי שמירה על טמפרטורת החדר החשוך ברמה זו. מצאנו כי שמירה על טמפרטורת החדר ברמה הנדרשת מספק יציבות טמפרטורה גבוהה יותר מאשר שימוש להתמקד במה טמפרטורה מבוקרת או תנור חימום מבוקר תרמוסטטית על יבוא מלח.
7. תאים נתפסים תחת בניגוד שלב (40X או 60x הנפט טבילה) אובייקטיבי אזור הדמיה נבחרה. החלק של האזור poly-D-ליזין מצופה כי הוא סמוך לנמל כניסת עדיפה, שם זרימת מלוחים היא למינרית ועקבית. חשוב גם להשתמש אזור שבו צפיפות התאים מתאים (צפיפות יתר משפיע על איכות ושלמות של איסוף נתונים באמצעות האות מ תאים סמוכים) והיכן תאים מחוברים כראוי, אך פעילות flagellar ניכרת. תמונה בניגוד שלב נשמר. מיקרוסקופ הוא החליף אז למצב פלואורסצנטי (עירור 480 ננומטר, 540 ננומטר פליטה) וחשיפה הזמן מצטמצם למינימום הנדרש כדי לקבל תמונה ברורה הקרינה (בדרך כלל 5-20 מילישניות).
8. הניסוי אשר נכתבו על ידי הפעלת בזמן רכישת התמונה סדרה תוכנה (IQ). בדרך כלל תמונות נרכשים בבית הרץ 0.1 ואת התאורה מוגבל לתקופות הרכישה של התמונה רק באמצעות Softwaמחדש תריס מבוקר. הרבה יותר שיעורי רכישת תמונה ניתן להשתמש אך הקצבה חייבת להתבצע על בעיות של הלבנת דור של חפצים בשל נזק תמונה לתאים (ראה דיון). מנת המשכל (ורוב האחרים פלטפורמות תוכנה רכישת) יאפשר בזמן אמת גרפים של הקרינה במהלך הניסוי.
9. לאחר תקופת השליטה של מניפולציה 3-5 דקות משך מרכיבים מלוחים (כגון [Ca ^{2 +]} _o) ויישום של תרופות מושגת על ידי החלפת מלוחים בכותרת זלוף. זמן של תוספת של גירוי כל כך ציין זמן ההגעה בחדר הדמיה ניתן לחשב, מתן דיוק מספיק הערכה של התגובות איטי המתואר כאן (שנדגמו ב 0.1 הרץ). לקבלת תגובות מהירות יותר דיוק רב יותר ניתן להשיג על ידי הוספת גירויים ישירות לזרם מלוחים דרך נמל יבוא second כאמור RC20 וורנר קאמרית.
10. תמונות מנותחים מחובר באמצעות IQ. אזורי עניין (ROIs) נמשכים סביב כל תא (או חלק של התא) וגם שטח התא חינם נבחרה (עבור אוטומטית רקע חיסור על ידי התוכנה. הסדרה תמונה מסומנת ואז להסיר תאים אשר מתו או עברו התגובה acrosome ( אשר מופיע עליה גדולה המהירה הקרינה ואחריו הפסד של צבע cytoplasmic) במהלך הניסוי ואלה הראו תנועה מספיק כדי לגרום חפצים כאשר ניתחו כסדרה זמן.
11. סדרת זמן עוצמת הקרינה מתקבל אז ההחזר על ההשקעה עבור כל הנתונים הללו מנותחים מחובר ב-Excel. בתחילה הקרינה הוא מנורמל לערך אומר שהושגו במהלך תקופת הביקורת, באמצעות המשוואה R = _[(מנוחה FF) / F _שאר] x 100%, כאשר R הוא שינוי% ב הקרינה לעומת התקופה שליטה, F, היא עוצמת הקרינה בזמן t זמן _לנוח F הוא ממוצע של לפחות 30 קביעות של F שהושגו במהלך תקופת הביקורת.

נציג תוצאות

איור 1 מציג סדרה של תמונות מתוך ניסוי שבו תאים היו מגורה עם פרוגסטרון 3 מיקרומטר. השורה העליונה הסרט 1 להראות את התמונות הקרינה בקנה מידה אפור ואת המגים אותו מוצגים להלן (וגם בסרט 2) ב pseudocolor (בדיקת '16_colors שולחן "ב תמונה J), שבו" מגניב "הצבעים מצביעים על עוצמת פלורסנט נמוך "חמים" הצבעים מצביעים עוצמת הקרינה גבוהה. תאים ניתן לראות pseudocolor במהלך הניסוי, באמצעות טבלאות בדיקת רמת משכל, אלא באמצעות סולם אפור בדרך כלל יותר אינפורמטיבי להערכת. אם התאים היטב בתווית. הראשון שתי תמונות נאספו 0 s ו 100 s לאחר תחילת ההקלטה. הקרינה צריכה להיות יציבה נוטה להיות החזק ביותר באזור acrosomal הודעה והצוואר הזרע. הפרוגסטרון נכנס לחדר הדמיה בכ 175 s ו ^rd 3 ו -4 תמונות ^ה (180 וה 220 ים) מראה גידול מהיר [Ca ^{2 +] i} (הקרינה) שמקורם ראש האחוריים ובאזור הצוואר של התא. תמונות לאחר נמצאים 290, 360, 740, 990 ו - 1440 s, מראה את הדעיכה של הראשונית [Ca ^{2 +]} אני חולף ופיתוח של העלאת מתמשכת משני. איור 2 מראה הניתוח של גליונות אלקטרוניים, המרת ערכי הקרינה גלם ROI לכל הקרינה מנורמל (שינוי% ב הקרינה לעומת התקופה שליטה) איור 3 מראה זמן מנורמל מגרשים הקרינה במשך 3 תאים מראה "טיפוסי" התגובות פרוגסטרון 3 מיקרומטר.

באיור 1. נתונים דוגמה מתא מגורה עם פרוגסטרון. סדרה של תמונות הקרינה בקנה מידה אפור (בשורה העליונה) ו pseudocolor (בשורה התחתונה) מוצגים. נקודות זמן הם 0, 180, 220, 290, 360 ו 990s. 3 פרוגסטרון מיקרומטר נכנס לחדר הדמיה ב 175 s. ROIs מוצגים בלוח הראשון.

איור 2. ניתוח נתונים יחיד פלואורסצנטי תא ב-Excel. דמויות בשחור הם סדרה של נתונים בזמן הקרינה, מסודרים אנכית. דמויות אדום (להלן) הם נתונים מנורמל שהושגו באמצעות המשוואה נתון בטקסט. גרף מציג עלילה מנורמל הקרינה בזמן עבור 64 תא בניסוי הזה, אשר על גירוי, מראה עלייה של חולפות הקרינה ולאחריה עלייה סדרה איטית של תנודות קטנות.

איור 3. Fluorescence בזמן עקבות במשך 3 תאים בודדים, כפי שבאה לידי ביטוי השינוי% ביחס לשליטה ערך .. 3 פרוגסטרון מיקרומטר נוספה בזמן מסומן בחץ. מראה קו מקווקו אומר הקרינה שליטה.

Discussion

כאשר בוצעו בהצלחה, טכניקה זו מאפשרת הקלטה של ההפצה קינטיקה של ספונטניות המושרה Ca ^{2 +} אותות זרע אנושי. תגובות ניתן לקבל מספר גדול של תאים (עד 200) וזה חשוב כי זרע האדם יכול להראות הרבה וריאציה ספונטנית מגורה Ca ^{2 +} האותות שלהם. תיוג מוצלחת ואת ההישרדות של תאים במהלך ההקלטה הם תלויים במידה רבה על איכות המדגם. דגימות Poor לתת תיוג עניים, תגובות עניים תאים עלולים למות במהלך ההקלטה.

זרע אדם רגישים מאוד נזק תמונה ולכן אנו משתמשים בתאורה מינימלית הכרחי (גם עוצמת וזמן חשיפה) על מנת למקסם את הישרדות התא ולמזער חפצים בשל מוות של תאים. מצלמה רגישות גבוהה (המתיר שימוש תאורה בעוצמה נמוכה) הוא היתרון הגדול מאז המצלמה יאסוף את הקרינה חלשה. חזור מואר, EM-CCD מצלמות במיוחד מתאים היטב, אם כי יקר מאוד. LED תאורה (במקום להשתמש קסנון או מנורת כספית עם מסנן עירור גם משפר הישרדות התא (Nishigaki et al, 2006).

אנחנו לא משתמשים Fura-2, למרות היתרונות הברורים של הדמיה יחס מטרי, כי Fura מחייב עירור עם האור האולטרה סגול ובגלל זה הכרחי לקחת שתי תמונות עבור כל יחס. לקבלת נתונים המתקבלים עם אורך גל יחיד, צבעי האור הנראה, נורמליזציה של עוצמת הקרינה בעיקר מפצה על ההבדל בין טעינה לצבוע תאים, אך לא עבור הפצה לצבוע בתוך תא יחיד, ואת זה צריך לזכור. למרות צבעים אורך גל יחיד יכול, עקרונית, להיות מכויל, את הדיוק של הטכניקה היא עניים ואנחנו לא מנסים לעשות את זה.

בעוד הנתונים המתקבלים עם יחס Fura-2 (או יחס פליטת לצבוע הודו), גם ללא כיול, לתת ייצוג נאמן מקובלת של שינויים יחסית [Ca ^{2 +]} אני, את עוצמת הקרינה של צבעים אורך גל יחיד רחוק מלהיות ליניארי הקשורים [Ca ^{2 +]} i. על החלק השימושי ביותר של עקומת הרוויה הקשר עבור צבעים אורך גל יחיד בדרך כלל קירוב ל לוגריתמי. בשלב זה אנו משתמשים אורגון גרין BAPTA-1 (איור 4) כי הוא רגיש שינויים קטנים [Ca ^{2 +]} אני קרוב לרמה של מנוחה (5-10 ננומטר). כאשר [Ca ^{2 +]} אני עולה מעל 1 תגובות מיקרומטר יהיו תחת ייצוג במונחים של שינוי הקרינה ואת צבע יכול להרוות. אפשרות לשיפור של הטכניקה בלי להזדקק עירור UV היא להכפיל תאים לטעון עם צבע כגון Fluo-3 ו Fura אדום. שניהם יכולים להיות נרגש ב 488 nM אבל התגובות סימולטני שלהם שונים מאוד. הקלטה של פליטה ב 540 ו 650 nM מספק יחס אשר יכול לספק שיטה טובה יותר עבור ניטור מדויק של [Ca ^{2 +]} i (Haughland, 2002) עשויות לחול על זרע (Nisigaki et al, 2006).

איור 4. הקשר בין חינם [Ca ^{2 +]} (ננומטר) ועל פליטת הקרינה בשיא גל (525 ננומטר כ) עבור אורגון גרין BAPTA-1 ו אורגון גרין BAPTA-2. OGB1 נותן הקרינה גבוה יותר נח [Ca ^{2 +]} אבל מרווה ברמות נמוכות יותר, ולכן יש מגוון קטן יותר שמיש. נתונים עבור חלקות אלה נתקבלו בדיקות מולקולריות מדריך (Haughland, 2002).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low light level Camera	QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1	Invitrogen	06807
Imaging Software	Andor	IQ
Imaging Software	National Institutes of Health	Image J	Public domain software
LED illumination system	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)	Invitrogen	P3000MP