Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

Summary

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. Visto di culture live show crescita dei neuriti e l'imaging di livelli di calcio con Fura-2.

Abstract

In questo video, dimostriamo la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. La procedura inizia con la rimozione di cervelli di animali a 70-78 ore dopo la formazione puparium. I cervelli isolati sono mostrati dopo incubazione breve papaina seguito da numerosi lavaggi in mezzo privo di siero di crescita. Il processo di dissociazione meccanica di ogni cervello in un calo del 5 ul di media su un vetrino è illustrato. Gli assoni e dendriti del post-mitotico neuroni sono sheered in prossimità del soma durante dissociazione, ma i neuroni cominciano a rigenerare i processi in poche ore di placcatura. Immagini mostrano fermenti vivi a 2 giorni. I neuroni continuano a elaborare processi durante la prima settimana della cultura. Specifiche popolazioni di neuroni possono essere identificati in coltura utilizzando GAL4 linee per guidare l'espressione di marcatori specifici del tessuto fluorescente come GFP o RFP. Registrazioni di cellule intere hanno dimostrato l'neuroni coltivati ​​forma funzionale, sinapsi colinergica attiva spontaneamente e GABAergici. Un segmento breve video che illustra le dinamiche del calcio nei neuroni in coltura con Fura-2 come un colorante indicatore di calcio di monitorare transienti di calcio spontanea e nicotina risposte di calcio evocate in un piatto di neuroni in coltura. Queste culture cervello pupa sono un sistema modello utile in cui gli strumenti genetica e farmacologica può essere utilizzato per identificare i fattori intrinseci ed estrinseci che influenzano la formazione e la funzione delle sinapsi centrale.

Protocol

I preparativi prima del giorno di coltura:

1. Fai la soluzione sterile dissezione.
2. Rendere sterile DMEM e mantenere in aliquote da 10 ml a 4 ° C per 2 settimane.
3. Rendere sterile DDM2 integratori e congelare in 50 o aliquote di 100 microlitri per 1 mese.
4. Fai ConA / laminina.
5. Cappotto coprioggetto.
   Opzionale: Fai CNBM sterile e conservare congelati per un massimo di 4 mesi.

Il giorno di coltura

I. Preparare soluzione enzimatica (ES) in cappa a flusso laminare

1. Mettere 5 ml di soluzione di dissezione (DS) in una provetta da centrifuga da 15 ml.
2. Pesare 0,8 mg di L-cisteina in una Eppendorf 0,6 ml e aggiungere 150 ml di DS. Pipetta su e giù fino cristalli sono andati.
3. Aggiungere 150 ml di DS / Cisteina ai 5 ml DS e mescolare bene.
4. Aggiungere 50 U (unità) di papaina.
5. Aggiungere 7 ml di 0,1 N Na OH e mescolare bene. Soluzione sarà chiara entro 30 min. quando viene attivato.
6. Enzima soluzione filtro con filtro da 0,2 millimetri in una siringa sterile tubo a vite microcentrifuga 1,5 ml tappo
   
   Papaina: Volete 50 U in 5 ml DS. Ogni lotto è leggermente diverso, così bisogna calcolare quanto:
   37,3 mg / ml e 28,3 U / mg
   37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml)
   50 U = 47,4 ml
   

II. Fai DDM2 dei media

Del giorno di coltura: aggiungere i seguenti supplementi per rendere DDM2

A 10 ml di DMEM aggiungere supplementi, poco prima di coltura:

1. 100μl transferrina
2. 100μl Putrescine
3. 100μl Selenio
4. Progesterone 100μl
5. L'insulina 50μl
6. 10μl 20-hydroxyecdysone

Nota: abbastanza DDM2 per tutte le culture pianificata (ogni cervello placcato su un unico vetrino in una teglia da 35 millimetri individuale Petri, 1,5 ms di media / cultura)

Fase III-VI può essere a una panchina fatta di laboratorio non sterili e dovrebbe essere completato in 45 minuti o meno.

III. Pupe Collection

1. Seleziona 10-15 pupe da più parti di fiala sotto un microscopio da dissezione.
2. Pupe posto nel coperchio di un piatto mm secco 35 Petri.

Nota: In genere uso il cervello da pupe tra 55-78 ore dopo la formazione puparium (APF). E 'leggermente più difficile da sezionare il cervello dalle pupe più giovani dato che le capsule testa tendono a collassare, mentre il livello globale della crescita dei neuriti è leggermente inferiore dal più antiche pupe. Nel Canton-S ceppo tipo selvatico, queste fasi sono riconosciuti da occhi pigmentati che sono marrone chiaro al rossiccio leggermente, con poco pigmento altrove.

IV. Decapitazione sotto microscopio da dissezione

1. Mettere due gocce di soluzione sterile dissezione nel coperchio della piastra Petri, vicino a pupe.
2. Premere delicatamente una sola pupa con una pinza sottile nella mano sinistra e utilizzare un 27 ago della siringa attaccato ad una siringa da 1 cc nella mano destra per rimuovere la cuticola alla fine anteriore della pupa.
3. Spremere pupa leggermente con una pinza e come capo emerge utilizzare i 27 gauge a tagliare il collo.
4. Con la punta di un ago o la pinza, il trasferimento testa a goccia di dissezione soluzione.
5. Ripetere fino ad avere 10-15 teste in una sola goccia.

Rimozione V. del cervello dalla testa sotto microscopio da dissezione

1. In ogni mano mantenere una siringa da 1 cc con un ago da 27 gauge.
2. Usare questi per posizionare la testa vola nella goccia di soluzione in modo da sezionare la proboscide è rivolto verso l'alto e la superficie dorsale della testa è a nord.
3. Inserire l'ago a sinistra nella proboscide al pin la testa in giù e utilizzare l'ago diritto di presentare una fessura nell'occhio destro che va dal ventrale verso la superficie dorsale.
4. Inserire l'ago proprio vicino alla sinistra nella regione della proboscide e quindi utilizzare l'ago a sinistra per premere delicatamente la cuticola sopra l'occhio sinistro, spingendo il cervello verso la fessura nell'occhio destro. Il cervello deve uscire dalla fessura a destra, relativamente intatte, spesso con entrambe le ottiche lobes ancora attaccato e talvolta il tessuto oculare pigmentato pure.
5. Spingere il cervello sul retro del l'ago e trasferire a una goccia di soluzione salina sterile dissezione in una nuova sterile, 35 millimetri piatto di Petri.
6. Raccogliere 10-15 cervelli per ogni genotipo.
   

VI. Rimozione dei lobi ottici e trattamento enzimatico

1. In ogni mano mantenere una siringa da 1 cc con un ago da 27 gauge e utilizzare questi per raccogliere tutti i cervelli in una piccola area della goccia di soluzione di dissezione
2. Utilizzare siringhe, utensili da taglio per rimuovere i lobi ottici da ogni cervello in modo che il tessuto rimanente per la cultura è la regione centrale del cervello.
3. Usare un 20 l Pipetman, fissato al 5 microlitri, per trasferire tutti i cervelli di un singolo genotipo di una provetta Eppendorf contenente 1 ml di soluzione di papaina sterile.
4. Cervelli incubati in papaina per 10-15 minuti su un insieme dei rotatori a 60 giri.
5. Centrifugare a 3000 rpm per 3 minuti.
   

All'interno cappa sterile a flusso laminare - tutte le fasi in cui è esposto il tessuto all'aria dovrebbe essere fatto in cappa a flusso laminare per i passaggi rimanenti.

VII. Lavaggio

1. Rimuovere soluzione enzimatica e sostituire con soluzione sterile dissezione.
2. Centrifugare a 3000 rpm per 3 minuti.
3. Lavare con soluzione sterile dissezione per un totale di 3 volte.
4. Rimuovere salina sezionare e sostituire con DDM2.
5. Centrifuga e lavare un totale di 2 volte con DDM2.
6. Trasferimento di cervelli e mezzi di comunicazione a un piatto sterile 35 millimetri Petri.
   

VIII. Triturazione e placcatura in microscopio da dissezione

1. Mettere 5 ul di DDM2 al centro di un vetrino coprioggetto.
2. Trasferire 1 cervello per questo calo di DDM2 con una punta di giallo.
3. Sotto il microscopio, utilizzare aghi calibro 27 a dadi il cervello di in piccoli pezzi (dovrebbe prendere <1 minuto).
4. Sotto la guida visiva, rompere la punta di una pipetta di vetro che è stato tirato a punta fine in modo che i pezzi più grandi possono essere risucchiati delicatamente la punta della pipetta ed espulso di nuovo nel mezzo. Utilizziamo tubi di aspirazione bocca che sono forniti di serie con 100 microlitri di vetro ematocrito capillare.
   
   Nota: Fare attenzione a non avere le bolle nei media e sarà necessario determinare empiricamente la pipetta dimensione migliore da usare. Buoni consentono di dissociare il cervello con alcune singole cellule e ancora alcuni cespugli di grandi dimensioni, in circa 30 secondi / cerebrale. Quando si guarda a queste a maggior potenza, circa il 10-20% dei neuroni devono ancora alcuni processi rimanenti e ci saranno ancora alcuni grumi di grandi dimensioni. Se si dissociano troppo, allora tutte le cellule saranno rotondi e avranno subito danni così tanto che non sopravviverà. Questa fase richiede pratica e deve essere fatto in fretta perché c'è una grande superficie-volume e il rapporto osmolarità e pH della goccia di DDM2 possono cambiare rapidamente. Tessuto deve essere posto in CO ₂ incubatore nel più breve tempo possibile.
   
   
5. Scrivi sul coperchio capsula di Petri: "genotipo, data e ora".
6. Mettere il piatto 35 millimetri petri in una capsula di Petri mm 100 (con kimwipe bagnato) e lasciare riposare in CO ₂ incubatore per 30 min.
7. Inondare il piatto 35 mm con 1,5 ml di DDM2.
8. Mantenere le culture in incubatrice al 5% CO ₂ incubatore (23 ° C).
   
   Nota: se non si ha accesso ad un raffreddamento CO ₂ incubatore, utilizzare uno standard di mammifero tessuto cultura incubatore e sia messo in una stanza fresca e calore a 23 ° C, o mettere in laboratorio, spegnere temp, e l'uso ghiaccio in un cassetto nella parte inferiore del incubatore per regolare temperatura ambiente intorno.
   

IX. Le cellule di alimentazione

1. In occasione della Giornata 1 (giorno successivo), aggiungere 0,5 ml di CNBM/B27 (Media Condizionata) per rendere 03:01 DDM2: CNBM/B27.
2. Il 5 ° giorno sostituire 1 ml di media per DDM2 03:01: CNBM/B27.
3. Conservare le cellule di alimentazione con 3:1 DDM2: CNBM/B27 ogni 4-5 giorni.
   
   Nota: Le culture possono essere coltivate senza i media condizionata non neuronali, ma i neuroni sembrano un po 'più fragili e sono più difficili per l'uso negli esperimenti di elettrofisiologia.

Discussion

I neuroni raccolte dal cervello di roditori embrionale / postnatale possono essere coltivate in coltura cellulare primaria dove si estendono neuriti e la forma funzionale connessioni sinaptiche. Metodi per la preparazione di queste culture sono ben stabiliti e gli studi in colture neuronali roditori hanno svolto un ruolo fondamentale per identificare geni e fattori ambientali coinvolti nella regolazione della formazione di sinapsi e la funzione (Banker e Goslin, 1991). Mentre i neuroni degli insetti da una varietà di specie possono essere coltivate in coltura, i neuroni degli insetti solo dimostrato di forma funzionale connessioni sinaptiche in cultura sono da Drosophila (Rohrbough et al, 2003). Neuroblasti raccolte metà stadio gastrula embrioni di Drosophila coltivate in mezzi di comunicazione definito dar luogo a neuroni che sono elettricamente eccitabili e la forma funzionale, interneuronali connessioni sinaptiche (O'Dowd, 1995; Lee e O'Dowd, 1999). Per identificare i fattori che regolano la forma e la funzione sinaptica nei neuroni noti per essere coinvolti nella mediazione dei comportamenti adulti abbiamo sviluppato la tecnica illustrata in questo video per i neuroni raccolta e coltura da cervelli di fine stage Drosophila (Su e O'Dowd, 2003). Una delle caratteristiche principali di questa procedura era di usare la papaina, invece di collagenasi o di altri enzimi dura tradizionalmente utilizzata nella preparazione di insetti culture neuronali. Risultati papaina nei neuroni dissociati mantenendo breve assoni che sopravvivono, rigenerare i processi neuritiche, e la forma funzionale connessioni fra sinaptiche. Registrazioni tutto in popolazioni di cellule individuate, anche le cellule del corpo funghi Kenyon, mostrano che una rapida trasmissione dei sinaptica eccitatoria nelle culture è mediato da nAChR, mentre l'inibizione è mediata recettori GABA (Su e O'Dowd, 2003). La nostra recente analisi al microscopio elettronico dimostra che i neuroni in sinapsi forma cultura con caratteristiche strutturali che sono simili per entrambe le sostanze chimiche e sinapsi elettriche nel cervello adulto (Oh et al., 2007). Come illustrato nel video, le colture sono anche suscettibili di studi di calcio Fura-2 imaging e abbiamo usato questi per studiare i meccanismi cellulari alla base cambiamenti spontanea ed evocata nei livelli intracellulari di calcio in popolazioni di cellule identificate comprese le cellule Kenyon e neuroni colinergici (Jiang et al, 2005;. Campusano et al, 2007).. Con il kit ampio strumento genetiche disponibili in Drosophila questo sistema cultura rappresenta uno strumento molto utile per identificare regolatori intrinseci ed estrinseci della struttura delle sinapsi centrale, la funzione e plasticità.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.