Primär Neuronal kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor

Summary

Denna video visar förberedelserna primära neuronala kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor. Utsikt över levande kulturer visar neurite utväxt och avbildning av kalcium nivåer med Fura-2.

Abstract

I denna video visar vi utarbetandet av primära neuronala kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor. Proceduren börjar med avlägsnandet av hjärnor från djur på 70-78 timmar efter puparium bildas. De isolerade hjärna visas efter kort inkubationstid på papain följts av flera tvättar i serum-fri tillväxt medium. Processen för mekaniska dissociation av varje hjärnan i ett 5 ul droppe media på ett täckglas illustreras. Den axoner och dendriter av post-mitotiska nervceller girade av nära Soma under dissociation men nervceller börja återskapa processer inom några timmar bordläggningen. Bilderna visar levande kulturer på 2 dagar. Nervceller fortsätta att utveckla processer under den första veckan i kulturen. Särskilda neuronala populationer kan identifieras i kulturen med hjälp av GAL4 linjer att köra vävnad specifikt uttryck av fluorescerande markörer som GFP eller offertförfrågan. Helcells inspelningar har visat på odlade nervceller bildar funktionella, spontant aktiva kolinerga och GABAergic synapser. En kort video segment illustrerar kalcium dynamiken i odlade nervceller med Fura-2 som en kalcium indikator färgämne för att övervaka spontana kalcium transienter och nikotin evoked potential kalcium i ett fat med odlade nervceller. Dessa PUPP-hjärnan kulturer är en användbar modell system där genetiska och farmakologiska verktyg kan användas för att identifiera endogena och exogena faktorer som påverkar bildningen och funktionen av centrala synapser.

Protocol

Förberedelser inför dagen i odling:

1. Gör steril dissekera lösning.
2. Gör sterila DMEM och hålla i 10 ml alikvoter vid 4 ° C i 2 veckor.
3. Gör sterila DDM2 kosttillskott och frysa i 50 eller 100 l alikvoter i 1 månad.
4. Gör Cona / laminin.
5. Coat täckglas.
   Tillval: Gör sterila CNBM och lagra frysta upp till 4 månader.

På dagen i odling

I. Förbered Enzyme Solution (ES) i laminärt flöde huva

1. Sätt 5 ml dissekera lösning (DS) i ett 15 ml centrifugrör.
2. Väg 0,8 mg L-cystein i ett 0,6 ml Eppendorf och tillsätt 150 l av DS. Pipettera upp och ner tills kristaller är borta.
3. Tillsätt 150 ml DS / Cysteine ​​att de 5 ml DS och blanda väl.
4. Tillsätt 50 E (enheter) av Papain.
5. Tillsätt 7 ml 0,1 N Na OH och blanda väl. Lösningen kommer att klara inom 30 min. när den aktiveras.
6. Filtrera enzym lösning med 0,2 mm sprutfilter i en steril 1,5 ml skruvlock mikrofugrör
   
   Papain: Vill 50 U i 5 ml DS. Varje parti är något annorlunda, så måste räkna ut hur mycket:
   37,3 mg / ml och 28,3 U / mg
   37,3 x 28,3 = 1055,59 E / ml (1000 ml)
   50 U = 47,4 ml
   

II. Gör DDM2 medier

På dagen för odling: Lägg till följande tillägg för att göra DDM2

Till 10 ml av DMEM lägga till tillägg, strax före odling:

1. 100μl Transferrin
2. 100μl Putrescine
3. 100μl Selen
4. 100μl Progesteron
5. 50μl Insulin
6. 10μl 20-hydroxyecdysone

Obs! Nog DDM2 för alla planerade kulturer (varje hjärna pläterade på en enda täckglas i ett enskilt 35 mm petriskål, 1,5 ms av media / kultur)

Steg III-VI kan vara en klar osterila lab bänk och ska fyllas i 45 minuter eller mindre.

III. Puppor Kollektion

1. Välj 10-15 puppor från sidorna av flaskan under en dissekera mikroskop.
2. Placera puppor i locket på en torr 35 mm petriskål.

Obs: Vi använder i allmänhet hjärnor från puppor mellan 55-78 timmar efter puparium bildning (APF). Det är något svårare att dissekera ut hjärnan från den yngre puppor sedan huvudet kapslarna har en tendens att kollapsa, samtidigt som den totala neurite utväxt är något lägre från de äldsta puppor. I Canton-S wildtype stam, dessa stadier erkänts av pigmenterade ögon som är ljusbrun till lätt rödaktig, med lite pigment någon annanstans.

IV. Halshuggning i dissekera mikroskop

1. Placera två droppar steril dissekera lösning i locket petriskål, bredvid puppor.
2. Försiktigt tag en puppa med fina tång i vänster hand och använder en 27 nål gauge spruta kopplad till en 1 cc spruta i högra för att ta bort nagelbanden i framändan av puppa.
3. Pressa puppa något med pincett och som chef dyker använda 27 gauge nål för att bryta nacken.
4. Med nålspetsen eller peang, överföring huvud droppe dissekera lösning.
5. Upprepa tills du har 10-15 huvudet i en enda droppe.

V. Borttagning av hjärnan från huvudet under dissekera mikroskop

1. I varje hand hålla en 1 cc spruta med en 27 gauge nål.
2. Använd dessa för att placera flugan huvudet i droppe dissekera lösning så snabel är vänd mot dig och den dorsala ytan av huvudet är norr.
3. Sätt in den vänstra nålen i snabel till stift huvudet ner och använda rätt nål för att göra ett snitt i höger öga som går från ventrala till dorsala ytan.
4. Sätt in den högra nålen nära kvar i regionen av snabel och sedan använda den vänstra nålen för att försiktigt pressa ned nagelbanden över vänstra ögat, skjuta hjärnan mot skåran i höger öga. Hjärnan ska dyka upp från springan till höger, relativt intakt, ofta med både optisk lobes bifogade stilla och ibland pigmenterade ögat vävnad också.
5. Tryck hjärnan på baksidan av nålen och överför till en droppe steril dissekera saltlösning i en ny steril, 35 mm petriskål.
6. Samla 10-15 hjärnor för varje genotyp.
   

VI. Borttagning av optiska loberna och enzym behandling

1. I varje hand hålla en 1 cc spruta med en 27 gauge och använda dessa för att samla alla hjärnor i ett litet område av droppe dissekera lösning
2. Använd sprutor som skärverktyg för att ta bort den optiska loberna från varje hjärnan så den vävnad som återstår för kultur är den centrala hjärnan regionen.
3. Använd en 20 l pipetman, inställd på 5 l, att överlåta samtliga hjärnan hos en enskild genotyp ett Eppendorf-rör innehållande 1 ml steril papain lösning.
4. Brains inkuberas i papain i 10-15 minuter på en rotator satt till 60 rpm.
5. Centrifugera vid 3000 rpm i 3 minuter.
   

Inne sterila laminärt flöde huva - alla steg där vävnad utsätts för luft bör göras i laminärt flöde huva för de återstående stegen.

VII. Tvätt

1. Ta bort enzym lösning och ersätta med steril dissekera lösning.
2. Centrifugera vid 3000 rpm i 3 minuter.
3. Tvätta med steril dissekera lösning totalt 3 gånger.
4. Ta bort dissekera saltlösning och ersätt med DDM2.
5. Centrifugera och tvätta totalt 2 gånger med DDM2.
6. Överför hjärnor och media till en steril 35 mm petriskål.
   

VIII. Trituration och plätering i dissekera mikroskop

1. Plats 5 ul av DDM2 i centrum av ett täckglas.
2. Överför en hjärna att denna droppe DDM2 med gul spets.
3. Under mikroskop, använder 27 gauge nålar för att tärna upp hjärnan i småbitar (bör ta <1 minut).
4. Enligt visuell vägledning, bryta spetsen av ett glas pipett som har dragit till en fin spets, så att större bitar kan lätt sugas in i spetsen på pipett och utvisades tillbaka in i mediet. Vi använder tuber munnen sug som kommer som standard med 100 l hematokrit kapillär glas.
   
   Obs: Se till att inte få bubblor i media och du kommer att behöva empiriskt bestämma den bästa storleken pipett att använda. Som är bra att du kan skilja hjärnan med vissa enskilda celler och fortfarande några stora klumpar, i cirka 30 sekunder / hjärnan. När man tittar på dessa på högre effekt, bör cirka 10-20% av nervceller har fortfarande några processer kvar och det kommer fortfarande att vara några stora klumpar. Om du tar avstånd för mycket, då alla celler kommer att vara rund och de kommer att ha lidit så stor skada att de inte kommer att överleva. Detta steg kräver övning och måste ske snabbt eftersom det finns en stor yta till volym ratio och osmolalitet och pH droppe DDM2 kan förändras snabbt. Vävnad ska placeras i CO ₂ inkubator så snabbt som möjligt.
   
   
5. Skriv på petriskål locket: "genotyp, datum och tid".
6. Sätt 35 mm petriskål i ett 100 mm petriskål (med våta kimwipe) och låt bosätta sig i CO _2-inkubator för 30 min.
7. Översvämma 35 mm skålen med 1,5 ml DDM2.
8. Håll kulturer i inkubatorn med 5% CO ₂ inkubator (23 ° C).
   
   OBS: Om du inte har tillgång till en avkylning CO ₂ inkubator, använd en standard däggdjur inkubator vävnadsodling och antingen lägga den i ett svalt rum och värm till 23 ° C, eller sätta i labbet, stänga av temp, och använda is i ett fack längst ner på inkubatorn att reglera temp runt omgivningen.
   

IX. Utfodring Celler

1. Dag 1 (nästa dag), tillsätt 0,5 ml CNBM/B27 (Konditionerat Media) för att göra 3:01 DDM2: CNBM/B27.
2. Dag 5 ersätta 1 ml av media för 03:01 DDM2: CNBM/B27.
3. Håll utfodring celler med 3:01 DDM2: CNBM/B27 var 4-5 dagar.
   
   Obs: kulturer kan odlas utan att den icke-neuronala betingade medier, men de nervceller verkar lite skörare och är svårare för användning i elektrofysiologi experiment.

Discussion

Nervceller skördas från hjärnan hos embryonala / postnatala gnagare kan odlas i primär cell kultur där de sträcker neurites och bildar funktionella synapsförbindelser. Metoder för beredning av dessa kulturer är väl etablerade och studier i gnagare neuronala kulturer har spelat en avgörande roll i att identifiera gener och miljöfaktorer är inblandade i regleringen av synaps bildning och funktion (Banker och Goslin, 1991). Medan insekt nervceller från en mängd olika arter kan också odlas i kultur, den enda insekt nervceller visat att bilda funktionella synapsförbindelser i kulturen är från Drosophila (Rohrbough et al, 2003). Neuroblaster skördas i mitten av gastrulastadium Drosophila embryon som odlats i definierade medier ger upphov till nervceller som är elektriskt retbara och bildar funktionella, interneuronal synapsförbindelser (O'Dowd, 1995; Lee och O'Dowd, 1999). Att identifiera faktorer som reglerar synaptiska form och funktion i nervceller kända för att vara inblandat i vuxen beteenden vi utvecklat tekniken illustreras i denna video för skörd och odling nervceller från hjärnan sent Drosophila (Su och O'Dowd, 2003). En av de viktigaste funktionerna i detta förfarande var att använda papain, istället för kollagenas eller andra starka enzymer som traditionellt används inom beredningen av insekter neuronala kulturer. Papain resulterar i dissocierade nervceller behålla korta axonal processer som överlever, återskapar neuritic processer och bildar funktionella interneuronal synapsförbindelser. Hela inspelningar i identifierade cellpopulationer, inklusive Kenyon svamp kroppens celler, visar att snabba excitatoriska synaptisk transmission i de kulturer förmedlas av nAChRs medan hämning medieras GABA-receptorer (Su och O'Dowd, 2003). Våra senaste elektronmikroskopiska analys visar att nervceller i synapserna kulturen form med strukturella drag som liknar både kemiska och elektriska synapserna i den vuxna hjärnan (Oh et al., 2007). Som framgår i videon, kulturer är också mottaglig för Fura-2 studier kalcium avbildning och vi har använt dessa för att undersöka de cellulära mekanismer som ligger bakom spontana och framkallade förändringar av intracellulära kalciumnivåer i identifierade cellpopulationer inklusive Kenyon celler och kolinerga neuron (Jiang et al, 2005;. Campusano et al, 2007).. Med det omfattande genetiska verktygslåda finns i Drosophila denna kultur-systemet ger ett mycket användbart verktyg för att identifiera inre och yttre regulatorer i centrala synaps struktur, funktion och plasticitet.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.