В этой статье описывается GFP основе флуоресценции<em> В естественных условиях</em> Анализы, что отдельно количественно гомологичной рекомбинации и негомологичных конце вступление в клетках млекопитающих.
Abstract
ДНК двухцепочечной разрывы самых опасных повреждений ДНК, что может привести к массовой гибели генетической информации и гибели клеток. Клетки ремонт ДР с использованием двух основных путей: негомологичных конце соединения (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR). Возмущения NHEJ и HR часто связаны с преждевременным старением и опухолей, поэтому важно иметь количественный способ измерения каждого пути DSB ремонта. Наша лаборатория разработала флуоресцентный конструкций репортеру, что позволит чувствительной и количественного измерения NHEJ и HR. Конструкции на основе генной инженерии GFP содержащие сайты узнавания для редких резки I-SCEI эндонуклеазы для индукции ДР. Начиная конструкции GFP отрицательным, как ген GFP инактивируется дополнительные экзона, либо мутаций. Успешный ремонт I-SCEI вызванные перерывами на NHEJ или HR восстанавливает функциональный ген GFP. Число GFP-положительных клеток рассчитывали с помощью проточной цитометрии обеспечивает количественную меру NHEJ или HR-эффективности.
Protocol
В этом протоколе описываются метод анализа ДНК, ремонт DSB с хромосомным интегрированной репортер конструкций 1,2, где ДР индуцируются в естественных условиях на переходные выражения редких эндонуклеазы резки I-SCEI 3. Интегрированный анализ дает преимущество анализа DSB ре…
Discussion
Флуоресцентные NHEJ и анализы HR репортер обеспечить количественный способ измерения отдельно каждого пути DSB ремонт в естественных условиях. Тесты очень чувствительны, как FACS может надежно обнаружить 10 клеток GFP + в 20000 клеток. Анализы могут быть адаптированы для измерения ремонт со?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Оригинальные GFP-Pem1 был подарок от доктора Лэй Ли. Эта работа была поддержана грантами NIH и Эллисон Медицинский фонд В. Г. и А. С.
Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (43), e2002, doi:10.3791/2002 (2010).