Bu makale, GFP tabanlı floresan açıklar<em> In vivo</em> Homolog rekombinasyon ayrı ayrı ölçmek ve nonhomologous memeli hücrelerinde katılmadan sonunda testleri.
Abstract
DNA çift iplikli sonları büyük kaybı genetik bilgi ve hücre ölümüne yol açabilecek en tehlikeli DNA lezyonlar. Hücreler onarım DSBs katılmanın nonhomologous sonunda (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR): iki ana yollar kullanarak. NHEJ ve İK pertürbasyonlarının genellikle erken yaşlanma ve tümörogenez ile ilişkili, dolayısıyla her DSB onarım yolu ölçme nicel bir şekilde olması önemlidir. Laboratuvarımız NHEJ ve İK hassas ve kantitatif ölçümüne olanak floresan muhabiri yapıları geliştirmiştir. Yapıları DSBs indüksiyonu için nadir bir kesme-SCEI endonükleaz tanınması siteleri içeren bir mühendislik, GFP geninin dayanmaktadır. Ek bir ekson GFP geninin inaktive veya mutasyonlarla olduğu gibi başlangıç yapıları GFP negatif. NHEJ veya İK I-SCEI indüklenen sonlarının Başarılı onarım fonksiyonel GFP genini geri yükler. Flow sitometri sayılır GFP pozitif hücrelerin sayısı NHEJ kantitatif ölçü veya İK verimliliği sağlar.
Protocol
Bu protokol DSBs geçici ifade nadir bir kesim endonükleaz I-SCEI 3 in vivo olarak indüklenen 1,2 yapıları kromozomal olarak entegre muhabiri ile DNA DSB onarım analizi için bir yöntem tarif. Entegre test DSB kromozomal kapsamında onarım analiz avantaj sağlar. Ancak, bu protokol birincil hücreleri ile çalışırken sorunlu olabilir Pasajlanması uzun süreli hücre, gerektirir. Alternatif bir yaklaşım muhabiri yapıları I-SCEI veya HindIII endon?…
Discussion
Floresan NHEJ ve İK muhabiri deneyleri, in vivo olarak ayrı ayrı her bir DSB onarım yolu ölçmek için nicel bir yol sağlar. Deneyleri, FACS güvenilir 20.000 hücre 10 GFP + hücreleri tespit edebilen çok duyarlıdır. Testler GFP + hücreler görünümünü DSBs 2 indüksiyon sonrası dakika veya saat içinde tespit ederek "gerçek zamanlı" onarım olaylarını ölçmek için adapte olabilir. Ayrıca, GFP + hücrelerin analizi DSB onarım sonra farklı hücre döngüsü aşamasın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Orijinal GFP-Pem1 Dr Lei Li bir hediye oldu. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve Ellison Tıp Vakfı VG hibe tarafından desteklenen ve AS
Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (43), e2002, doi:10.3791/2002 (2010).