Summary
Este artigo descreve GFP baseada em fluorescência
Abstract
DNA dupla fita-breaks são as lesões mais perigosas DNA que podem levar à perda maciça de informações genéticas e morte celular. Células LAP reparar usando duas vias principais: nonhomologous final juntar (NHEJ) e recombinação homóloga (HR). Perturbações de NHEJ e HR são frequentemente associados com o envelhecimento prematuro e tumorigênese, por isso é importante ter uma forma quantitativa de medir cada via de reparo DSB. Nosso laboratório desenvolveu constrói repórter fluorescentes que permitem a medição sensível e quantitativa de NHEJ e RH. As construções são baseadas em um gene GFP engenharia contendo sítios de reconhecimento para uma rara corte endonuclease I-SCEI para a indução de LAP. As construções de partida são GFP negativo como o gene GFP é inativado por um exon adicional, ou por mutações. Reparo com sucesso dos intervalos I-SCEI induzida por NHEJ ou HR restaura o gene GFP funcional. O número de células GFP positivas contadas por citometria de fluxo fornece uma medida quantitativa de eficiência ou NHEJ HR.
Protocol
Neste protocolo, descrevemos o método para análise de DNA de reparo DSB com o repórter cromossomicamente integrada constrói 1,2 LAP onde são induzidos in vivo pela expressão transitória uma endonuclease corte rara I-SCEI 3. O ensaio integrado oferece a vantagem de analisar reparação DSB no contexto cromossômicas. No entanto, este protocolo requer célula passaging prolongada, que pode ser problemático quando se trabalha com pilhas.
Uma abordagem alternativa é um ensaio extracromossómicos onde constrói repórter são digeridos in vitro com o I-SCEI ou endonucleases HindIII e então transfectado em células de DNA linear. O protocolo do ensaio exctrachromosomal 4 é semelhante ao ensaio descrito abaixo integrada com as seguintes modificações. Para o ensaio extracromossómicos omitir a integração de construções de repórter e, em vez co-transfecção as células com 0,5 mg de NHEJ plasmídeo repórter linearizada in vitro com o I-SCEI ou HindIII e 0,1 mcg de pDsRed2-N1 como controle de transfecção. Para o ensaio de RH co-transfecção duas repórter HR mg plasmídeo linearizado com I-SCEI ou HindIII e 0,1 mg pDsRed2-N1. Analisar as células por FACS três dias após a transfecção. O ensaio extracromossómicos permite a análise do DSB reparo em isolados primários, evitando extensa passaging celular e facilitando a análise de linhas de células múltiplas.
1. Constrói repórter NHEJ e HR
A cassete repórter NHEJ 5 contém um gene GFP com uma engenharia 3 kb intron do gene Pem1 (GFP-Pem1). O intron Pem1 contém um exon adenoviral flanqueado por seqüências de reconhecimento de HindIII e I-SCEI endonucleases (Figura 1a) para a indução de LAP. Os sites de I-SCEI estão em posição invertida. I-SCEI tem uma seqüência de reconhecimento nonpalindromic, portanto, dois sites invertida gerar termina DNA incompatíveis (Figura 1c). DNA incompatíveis termina melhor imitar o LAP que ocorrem naturalmente. A cassete NHEJ intacta é GFP negativo como o exon adenoviral perturba o ORF GFP. Após a indução de LAP pelo I-SCEI, o exon adenoviral é removido e NHEJ restaura a função do gene GFP (Figura 2). A característica original deste repórter NHEJ é que ele pode detectar um amplo espectro de eventos NHEJ desde o intron pode tolerar exclusões e inserções.
A cassete repórter HR 1 (Figura 1b) também é baseado no GFP-Pem1. Na cassete de RH, o primeiro exon do GFP-Pem1 contém uma deleção 22 bp combinado com a inserção de três sítios de restrição, I-SceI/HindIII/I-SceI. A supressão garante que GFP não pode ser reconstituído por um evento NHEJ. Os dois I-SCEI sites estão em posição invertida, de modo que I-SCEI deixa a digestão termina incompatíveis (Figura 1c). A primeira cópia de GFP-Pem1 é seguido por um exon promoter-less/ATG-less primeiro e intron de GFP-Pem1. A construção está intacta GFP-negativos. Após a indução de uma DSB pelo I-SCEI digestão do gene GFP funcional é reconstituído pela conversão intramolecular ou intermolecular gene entre as duas cópias mutantes do exon GFP-Pem1 primeiro. Desde a segunda cópia do gene GFP está faltando o códon ATG primeiro e segundo éxon, atravessando ou fita única de recozimento não irá restaurar a atividade GFP. Este projeto permite a detecção exclusiva de conversão de gene, que é o caminho HR predominantes em células de mamíferos (Figura 3).
2. Integração do Reporter Constrói no genoma
- Fazer uma preparação de alta qualidade de NHEJ ou repórter HR plasmídeo. Para melhores resultados use Qiagen Endo Kit grátis. Medir a concentração de plasmídeo e pureza, absorvência a 260/280 nm.
- Linearizar 10 mg do plasmídeo repórter por digestão com 50 U de NheI em 50 ul (volume total da reação) por 6 horas em 37 ° C incubadora (não use o bloco seco, para evitar a evaporação). Purificar DNA a partir da solução digestão com Qiagen QiaexII Kit, DNA eluir em 20 l de 10 mM Tris-HCl pH 8.0. Medir a concentração de DNA e pureza, absorvência a 260/280 nm. Normalmente, você vai perder 20-30% de DNA durante a depuração. Confirme o rendimento ea digestão, executando uma pequena alíquota (2 mL) em um gel, junto com um repórter undigested construir. A construção repórter purificada linearizado pode ser armazenado a 20 ° C.
- Em preparação para a transfecção, as células para trazer a melhor condição de crescimento. Se a partir de um frasco frozen, dividir as células duas vezes antes de transfecção. Se a partir de uma placa de células confluentes, dividi-las uma vez.
- Crescer as células a confluência de 70-80% (geralmente dois dias, se banhado 5x10 mm Placa de 5 cells/100, por fibroblastos humanos normais). É fundamental para a melhor eficiência de transfecção para trazer as células em crescimento logarítmica. Cultura crescendo ativamente contém células em fase M (visto como células arredondadas ligado à superfície).
- Transfect as células usando recomendações Amaxa fabricante seguintes Nucleofector é. Para fibroblastos uso NHDF solução e U20 programa. Para a transfecção, a colheita das células a partir de duas placas de 100 mm (~ 2x10 6 células). É fundamental não para mais de trypsinize as células. Parar tripsinização assim como 80% das células separado do prato. Ressuspender as células em solução NHDF. Células são sensíveis a solução NHDF, portanto, minimizar o tempo de incubação e misture delicadamente as células. Transfecção as células com 0,5 mg de construir repórter linearizada. Estas condições de transfecção, quando usado com normais resultado fibroblastos humanos na integração de uma única cópia de um repórter de construção para a maioria dos integrantes.
- Selecione as células com construções repórter cromossomicamente integrado por adição de 1 mg / mL geneticin (G418) 24h após a transfecção. Continue seleção para dia 10/07.
- Escolha as colônias G418 resistente (você pode escolher colônias individuais ou piscina clones resistentes). Expandir a cultura para cerca de cinco placas de 100 mm. Congelamento de três placas para uso futuro e ampliar outras duas placas com o número de células desejado (geralmente dez placas 100 mm são suficientes para cinco transfections).
- Quando as células atingem confluência de 70-80% (dois dias após o plaqueamento 5x10 5 células por 100 mm para chapa de fibroblastos), as células estão prontas para serem transfectadas com I-SCEI expressar plasmídeo.
3. Indução de ORL por expressão transitória de I-SCEI endonuclease
- Transfectar ~ 2x10 6 células (duas placas) da cultura logaritmicamente em crescimento, com uma mistura de 5 g I-SCEI expressar plasmídeo e 0,1 mg pDsRed2-N1 (Clontech) como um controle de eficiência de transfecção usando Amaxa Nucleofector (use NHDF solução e U20 programa para fibroblastos ).
- Ao mesmo tempo, preparar três controles de calibração para FACS por trasfecting ~ 2x10 6 células com (i) 5 mg EGFP-expressando plasmídeo, (ii) 5 mg pDsRed2-N1, (iii) 5 mg de um controle de plasmídeo que não expressa uma proteína fluorescente (estamos usando um plasmídeo HPRT minigene).
- Cultivar as células por quatro dias para dar tempo suficiente para a expressão da GFP e proteínas DsRed.
- (Opcional) Três dias após a transfecção verificar a eficiência da transfecção e expressão da GFP e proteínas fluorescentes DsRed por microscópio invertido com filtros para detecção de GFP e DsRed.
4. Análise da GFP + + e Células DsRed por citometria de fluxo
- Quatro dias após transfecção colheita I-SCEI células transfectadas e as células controle. Ressuspender as células em 500 mL de PBS e transferir células para os tubos FACS. Nesta fase é fundamental para colher todas as células e têm células de forma arredondada. Para conseguir isso, é recomendado o uso de um maior tempo de tripsinização ou uma forte tripsina. Confirmar que 99% das células são separadas do prato e ter forma redonda, observando as células ao microscópio. Manter as células no gelo protegido da luz (tampa balde de gelo com papel alumínio). É possível armazenar as células no gelo por algumas horas. Para obter os melhores resultados analisar as células imediatamente após a colheita.
- Calibrar FACS com GFP, DsRed, e os controles negativos. Ajuste de tensão e compensação de cor de modo a incluir todas as células fluorescentes na análise (Figura 4). Tenha em mente que a intensidade de fluorescência das amostras experimental será menor que a dos controles.
- I-analisar SCEI transfectadas células por FACS. Contamos pelo menos 20.000 células para cada tratamento. Para evitar a interferência potencial entre GFP e de fluorescência DsRed é recomendado para manter o percentual de GFP + ou + DsRed células abaixo de 25%. Se o percentual de + DsRed ou células GFP + é maior reduzir a quantidade de pDsRed2-N1 ou I-SCEI plasmídeo. Em nossos experimentos que só precisava ajustar a quantidade de pDsRed2-N1 do plasmídeo, mas não do plasmídeo I-SCEI.
- A porcentagem de células GFP + corresponde à eficiência do reparo de DNA DSB eo percentual de células + DsRed indica a eficiência de transfecção. Calcular a eficiência relativa de reparo de DNA DSB como a razão de células GFP + + para as células DsRed.
- As junções final reparado pode ser seqüenciadas para testar a precisão de reparação. O repórter constrói conter E.coli origem de replicação e genes de resistência a canamicina (Figura 1). Isto permite resgatar as construções através da digestão do DNA genômico com enzima EcoRI, recircularization e transformação em células competentes E. coli. Os plasmídeos resgatados são então analisados por digestão de restrição e seqüenciamento.
5. Resultados representante
Resultados típicos da FACS transfections e controle de NHEJ e experiências de RH são mostrados nas Figuras 4 e 5. Intensidade de fluorescência e do número de células fluorescentes será menor nas células transfectadas I-SCEI contendo integrated NHEJ e constrói HR (Figura 5) em comparação com os controles (Figura 4), devido à diferença no número de cópias de GFP e constrói DsRed nestas células. Cada célula no experimento contém apenas uma cópia do constructo repórter integrado, eventos de reparo, portanto, bem sucedido vai reconstituir o gene GFP em uma fração das células. Transfecção com 0,1 mg pDsRed2-N1 em fibroblastos humanos oferece cerca de 1 cópia do plasmídeo por célula.
A eficiência do NHEJ e HR é calculado como uma proporção de GFP + / + DsRed células. NHEJ é um processo mais eficiente que o HR em células humanas 2. Em fibroblastos humanos a eficiência NHEJ é tipicamente 0,6-1,3, e eficiência de RH é 0,05-0,3. Desde eficiência DSB é medido como uma relação de GFP + / + DsRed células variações na mistura de I-SCEI e DsRed2-N1 plasmídeos podem afetar o resultado. A qualidade plasmídeo também podem afetar os resultados, alterando a eficiência de transfecção. Portanto, para obter medidas consistentes, é importante usar a mesma mistura plasmídeo dentro de um experimento. Além disso, a eficiência de reparo DSB é afetada pelo tipo de célula, a fase do ciclo celular, e da localização cromossômica das construções integradas.
Figura 1. Reporter construções para a análise de DNA de reparação por DSB NHEJ (A) e HR (B). (C) DNA incompatíveis termina gerada por digestão de dois invertido I-SCEI locais SD, splice doadores; SA, splice aceitador; praças, locais de poliadenilação; Neo / Kana, única ORF controlado por dois promotores:. SV40 resistência a neomicina conferir em mamíferos células, e β-lactamase resistência kanamicyn conferir em E. coli; Ori, E. Origem coli pUC de replicação.
Figura 2. Reporter construir para a análise de NHEJ Neste construir o gene GFP está inativo;. Porém após a indução de um NHEJ DSB e bem sucedida a construção torna-se GFP +. Mostrado abaixo é um produto de reparação de este repórter por NHEJ.
Figura 3. Reporter construir para a análise de RH pela conversão gene. Upon indução da LAP pelo I-SCEI, HR pelo gene de conversão (GC) reconstitui um gene GFP ativo. Mostrados abaixo são produtos de reparação deste repórter pelas vias de reparo de DNA: GC, crossing-over (X-over), único fio de recozimento (SSA), e NHEJ. X-over produto de reparação é mostrado para recombinação intramolecular, recombinação exramolecular vai dar o mesmo produto, mas localizado em um cromossomo. Genes que expressam a proteína GFP ativa (GFP +) são indicados pela cor verde.
Figura 4. Calibração dos parâmetros para análise FACS. (A) Os fibroblastos transfectados com o plasmídeo pHPRT, usado como controle negativo para excluir as células auto fluorescente. (B) fibroblastos transfectados com pEGFP plasmídeo, usado para definir a propagação de células GFP + (área verde). (C) Os fibroblastos transfectados com pDsRed2-N1 do plasmídeo, usado para definir a propagação de células + DsRed (área vermelha).
Figura 5. Resultados típicos da análise de NHEJ (A) e HR (B) em fibroblastos humanos normais com construções repórter cromossomicamente integrado.
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Discussion
O NHEJ fluorescentes e ensaios repórter HR fornecem uma maneira quantitativos para medir separadamente cada via de reparo DSB in vivo. Os ensaios são muito sensíveis, como FACS pode detectar 10 células GFP + de 20.000 células. Os ensaios podem ser adaptados para medir eventos de reparo em "tempo real" através da detecção do aparecimento de células GFP + em minutos ou horas após a indução de LAP 2. Além disso, a análise de células GFP + não depende de proliferação celular adicional, permitindo o reparo DSB a ser analisado em diferentes estágios do ciclo celular após o tratamento com várias drogas que a divisão celular prisão 6. Isto proporciona uma vantagem importante sobre construções repórter baseada sobre a reconstituição de um marcador selecionável.
O processo NHEJ é intrinsecamente suscetível a erros gerando vários pequenos rearranjos nas junções termina. A propriedade exclusiva de nosso repórter NHEJ é que os eventos de reparo ocorrer dentro de um intron, que tolera deleções e inserções, permitindo assim a detecção de um amplo espectro de eventos NHEJ. A construção de RH é baseado no mesmo gene GFP modificado como o NHEJ construir permitindo a análise comparativa de NHEJ e RH. O uso de fluorescentes NHEJ e ensaios HR irá facilitar os estudos de reparo DSB mamíferos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O original GFP-Pem1 foi um presente do Dr. Li Lei. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da Ellison Medical Foundation para VG e AS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Round bottom tubes | BD Biosciences | 352058 | FACS tubes |
References
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- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
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