Summary
Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte Fluoreszenz-
Abstract
DNA-Doppelstrangbrüche sind die gefährlichsten DNA-Läsionen, die zu einem massiven Verlust an genetischer Information und Zelltod führen kann. Zellen zu reparieren DSBs mit zwei Hauptwege: homologe Ende (NHEJ) und homologe Rekombination (HR). Störungen der NHEJ und HR sind oft mit vorzeitiger Alterung und Tumorgenese verbunden, daher ist es wichtig, eine quantitative Methode zur Messung der einzelnen DSB-Reparatur-Weg haben. Unser Labor hat fluoreszierenden Reporter-Konstrukte, die empfindliche und quantitative Messung der NHEJ und HR erlauben entwickelt. Die Konstrukte werden auf ein konstruiertes GFP-Gen enthält Erkennungsstellen für eine selten-Schneiden I-SceI-Endonuklease für die Induktion von DSB basieren. Der Ausgangspunkt Konstrukte GFP negativ, wie das GFP-Gen durch ein zusätzliches Exon inaktiviert wird, oder durch Mutationen. Erfolgreiche Reparatur der I-SceI-induzierten bricht durch NHEJ oder HR stellt die funktionelle GFP-Gen. Die Zahl der GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie gezählt bietet quantitatives Maß für NHEJ oder HR-Effizienz.
Protocol
In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode zur Analyse von DNA-DSB-Reparatur mit chromosomal integrierter Reporter-Konstrukte 1,2, wo DSBs in vivo durch transiente Expression einer seltenen Schneiden Endonuklease I-SceI 3 sind induziert. Der integrierte Test bietet den Vorteil einer Analyse der DSB-Reparatur innerhalb der chromosomalen Kontext. Allerdings erfordert dieses Protokoll verlängert Zelle Passagieren, was problematisch sein kann, wenn die Arbeit mit Primärzellen.
Ein alternativer Ansatz ist eine extrachromosomale Test, bei dem Reporter-Konstrukte in vitro mit I-SceI oder HindIII Endonukleasen verdaut werden und dann in die Zellen transfiziert als lineare DNA. Die exctrachromosomal Assayprotokoll 4 ist ähnlich der integrierten Test unten mit den folgenden Modifikationen. Für die extrachromosomale Test weglassen die Integration von Reporter-Konstrukte und statt Co-Transfektion der Zellen mit 0,5 ug NHEJ Reporterplasmid in vitro mit I-SceI oder HindIII und 0,1 ug pDsRed2-N1 als Transfektion Kontrolle linearisiert. Für die HR-Assay Co-Transfektion von 2 pg HR Reporterplasmid linearisiert mit I-SceI oder HindIII und 0,1 ug pDsRed2-N1. Analysieren Sie die Zellen durch FACS 3 Tage nach der Transfektion. Die extrachromosomale Assay ermöglicht die Analyse der DSB-Reparatur in Primär-Isolate, die Vermeidung umfangreicher Zelle Passagierung und die Erleichterung der Analyse von mehreren Zelllinien.
1. Reporter-Konstrukte für NHEJ und HR
Die NHEJ Reporter Kassette 5 enthält ein GFP-Gen mit einem technisch 3 kb-Intron des Gens Pem1 (GFP-Pem1). Die Pem1 Intron enthält einen adenoviralen Exon von Erkennungssequenzen für HindIII und I-SceI Endonukleasen (Abbildung 1a) für die Induktion von DSB flankiert. Die I-SceI Seiten sind in umgekehrter Orientierung. I-SceI hat eine nonpalindromic Erkennungssequenz, erzeugen somit zwei invertierte Seiten unvereinbar DNA-Enden (Abbildung 1c). Inkompatible DNA-Enden am besten imitieren die natürlich vorkommenden DSBs. Die intakte NHEJ Kassette GFP negativ, wie die adenoviralen Exon der GFP ORF stört. Nach Induktion von DSB durch I-SceI, ist die adenovirale Exon entfernt und NHEJ wieder Funktion des GFP-Gens (Abbildung 2). Die Besonderheit dieses NHEJ Reporter ist, dass es ein breites Spektrum an NHEJ Ereignisse erkennen, da das Intron Deletionen und Insertionen tolerieren kann.
Die HR-Reporter Kassette 1 (Abbildung 1b) ist ebenfalls auf der GFP-Pem1 basiert. In der HR-Kassette enthält die erste Exon des GFP-Pem1 einem 22 bp-Deletion mit der Aufnahme von drei Restriktionsschnittstellen, I-SceI/HindIII/I-SceI kombiniert. Die Löschung wird sichergestellt, dass GFP nicht durch eine NHEJ Veranstaltung aufgelöst werden. Die beiden I-SceI Seiten sind in umgekehrter Orientierung, so dass I-SceI Verdauung unvereinbar Enden (Abbildung 1c) verläßt. Das erste Exemplar des GFP-Pem1 wird durch eine promoter-less/ATG-less ersten Exon-und Intron des GFP-Pem1 gefolgt. Die intakte Konstrukt GFP-negativ. Nach Induktion einer DSB durch I-SceI Verdauung der funktionellen GFP-Gen wird durch intra-oder intermolekularen Genkonversion zwischen den beiden mutierten Kopien der ersten GFP-Pem1 Exon rekonstituiert. Da die zweite Kopie des GFP-Gens fehlt das erste ATG-Codon und das zweite Exon, überqueren oder Einzelstrang-Glühen wird nicht zur Wiederherstellung der GFP-Aktivität. Dieses Design ermöglicht die ausschließliche Detektion von Gen-Umwandlung, die die vorherrschende HR Weg in Säugerzellen (Abbildung 3).
2. Integration der Reporter-Konstrukte in das Genom
- Machen Sie eine qualitativ hochwertige Vorbereitung NHEJ oder HR-Reporter-Plasmid. Für beste Ergebnisse verwenden Qiagen Endo Free Kit. Messen Sie Plasmid-Konzentration und Reinheit durch Absorption bei 260/280 nm.
- Linearisieren 10 ug des Reporter-Plasmid durch Verdau mit 50 U der NheI in 50 ul (Gesamtvolumen der Reaktion) für 6 Stunden in 37 ° C Inkubator (benutzen Sie nicht die trockene Block, um Verdunstung zu verhindern). Purify DNA aus der Aufschlusslösung mit Qiagen QIAExII Kit, eluieren DNA in 20 ul 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Messen DNA-Konzentration und Reinheit durch Absorption bei 260/280 nm. In der Regel werden Sie 20-30% der DNA während der Reinigung zu verlieren. Bestätigen Sie die Ausbeute und die Verdauung, indem Sie ein kleines Aliquot (2 ul) auf einem Gel zusammen mit einer unverdauten Reporter-Konstrukt. Das gereinigte linearisiert Reporter-Konstrukt kann bei 20 ° C gelagert werden
- In Vorbereitung für die Transfektion, bringen die Zellen, die besten Wachstumsbedingungen. Wenn ab einem gefrorenen Fläschchen, spaltete sich die Zellen zweimal vor der Transfektion. Wenn ab einer Platte von konfluenten Zellen, teilen Sie sie einmal.
- Wachsen die Zellen zu 70-80% Konfluenz (in der Regel zwei Tage, wenn verchromt 5x10 5 Zellen/100 mm-Platte, für die normale menschliche Fibroblasten). Es ist entscheidend für die beste Transfektionseffizienz der Zellen in logarithmischem Wachstum zu bringen. Aktiv wachsende Kultur enthält Zellen in M-Stadium (gesehen als abgerundete Zellen an der Oberfläche).
- Transfect die Zellen mit Amaxa Nucleofector folgenden Empfehlungen des Herstellers. Für Fibroblasten verwenden NHDF Lösung und Programm U20. Für die Transfektion Ernte der Zellen von zwei 100 mm-Platten (~ 2x10 6 Zellen). Es ist wichtig, nicht über trypsinize den Zellen. Stoppen Trypsinierung, sobald 80% der Zellen von der Platte abgelöst. Resuspendieren der Zellen in NHDF Lösung. Die Zellen sind empfindlich gegen NHDF Lösung, daher Minimierung der Inkubationszeit und mischen Sie die Zellen vorsichtig. Transfizieren die Zellen mit 0,5 ug linearisierte Reporter-Konstrukt. Diese Transfektionsbedingungen, wenn sie mit normalen menschlichen Fibroblasten Ergebnis in der Integration einer einzigen Kopie eines Reporters verwendet für die Mehrheit der Integranten konstruieren.
- Markieren Sie die Zellen mit chromosomal integrierter Reporter-Konstrukte durch Zugabe von 1 mg / mL Geneticin (G418) 24 Stunden nach der Transfektion. Weiter Auswahl für 7-10 Tage.
- Wählen Sie das G418-resistente Kolonien (Sie können einzelne Kolonien oder den Pool der resistenten Klone holen). Erweitern Sie die Kultur auf etwa fünf 100-mm-Platten. Einfrieren drei Platten für die zukünftige Verwendung und erweitern verbleibenden zwei Platten auf die gewünschte Zellzahl (in der Regel zehn 100-mm-Platten sind für fünf Transfektionen ausreichend).
- Wenn die Zellen 70-80% Konfluenz (zwei Tage nach dem Ausplattieren 5x10 5 Zellen pro 100 mm-Platte für Fibroblasten) zu erreichen, werden die Zellen bereit, mit I-SceI exprimierenden Plasmid transfiziert werden.
3. Induktion von DSB durch transiente Expression von I-SceI Endonuclease
- Transfizieren ~ 2x10 6 Zellen (zwei Platten) von logarithmisch wachsenden Kultur mit einer Mischung aus 5 ug I-SceI exprimierenden Plasmid und 0,1 ug pDsRed2-N1 (Clontech) als Transfektionseffizienz Kontrolle über Amaxa Nucleofector (Verwendung NHDF Lösung und U20-Programm für Fibroblasten ).
- Zur gleichen Zeit bereiten dreimaligem Kalibrier-Kontrollen für FACS durch trasfecting ~ 2x10 6 Zellen mit (i) 5 pg EGFP-exprimierenden Plasmid, (ii) 5 pg pDsRed2-N1, (iii) 5 ug eines Kontroll-Plasmid, das äußert sich nicht fluoreszierendes Protein (wir sind mit einem Plasmid kodiert HPRT Minigen).
- Wachsen die Zellen für vier Tage, um genügend Zeit für die Expression von GFP und DsRed Proteine liefern.
- (Optional) Drei Tage nach der Transfektion überprüft die Effizienz der Transfektion und Expression von GFP und DsRed Proteine mit fluoreszierenden inversen Mikroskop mit Filtern zur Detektion von GFP und DsRed.
4. Die Analyse der GFP + und + DsRed Zellen mittels Durchflusszytometrie
- Vier Tage nach der Transfektion Ernte I-SceI transfizierten Zellen und den Kontrollzellen. Resuspendieren der Zellen in 500 ul PBS und Transfer-Zellen, die FACS-Röhrchen. In diesem Stadium ist es wichtig, auf alle Zellen ernten und haben Zellen von runder Form. Um dies zu erreichen, ist es empfehlenswert, eine längere Zeit Trypsinierung oder eine stärkere Trypsin verwenden. Bestätigen Sie, dass 99% der Zellen von der Platte abgelöst und haben runde Form durch die Beobachtung der Zellen unter dem Mikroskop. Halten Sie die Zellen auf Eis lichtgeschützt (Deckel Eiskübel mit Folie). Es ist möglich, die Zellen auf Eis für ein paar Stunden zu speichern. Für die besten Ergebnisse analysieren die Zellen unmittelbar nach der Ernte.
- Kalibrieren FACS mit GFP, DsRed, und den negativen Kontrollen. Passen Sie Spannung und Farbkompensation, um alle die fluoreszierenden Zellen in der Analyse (Abbildung 4) enthalten. Beachten Sie, dass die Fluoreszenzintensität der experimentellen Proben wird niedriger sein als die der Kontrollen.
- Analysieren I-SceI transfizierten Zellen durch FACS. Wir zählen mindestens 20.000 Zellen für jede Behandlung. Um mögliche Interferenzen zwischen GFP und DsRed-Fluoreszenz ist es empfehlenswert, der prozentuale Anteil der GFP + oder DsRed + Zellen unter 25% zu halten. Verhindern Wenn der Anteil der DsRed + oder GFP +-Zellen ist höher reduzieren die Menge der pDsRed2-N1 oder I-SceI Plasmid. In unseren Experimenten haben wir nur benötigt, um die Menge der pDsRed2-N1-Plasmid anpassen, aber nicht von der I-SceI Plasmid.
- Der prozentuale Anteil der GFP +-Zellen entspricht der Effizienz der DNA-DSB-Reparatur und der prozentuale Anteil der DsRed +-Zellen zeigt die Effizienz der Transfektion. Berechnen Sie die relative Effizienz der DNA-DSB-Reparatur als das Verhältnis der GFP + Zellen DsRed + Zellen.
- Das reparierte Ende Kreuzungen kann sequenziert, um die Genauigkeit der Reparatur zu testen. Der Reporter-Konstrukte enthalten E.coli Replikationsursprung und Kanamycin-Resistenz-Genen (Abbildung 1). Dies ermöglicht die Rettung der Konstrukte durch Verdau genomischer DNA mit EcoRI Enzym, Rezirkularisierung und Transformation in kompetente E. coli-Zellen. Die geretteten Plasmide werden dann durch Restriktionsverdau und Sequenzierung analysiert.
5. Repräsentative Ergebnisse
Typische FACS Ergebnisse der Kontrolle Transfektionen und NHEJ und HR Experimente sind in den Abbildungen 4 und 5 dargestellt. Fluoreszenzintensität und der Anzahl der fluoreszierenden Zellen niedriger sein wird in der I-SceI transfizierten Zellen mit inteed NHEJ und HR-Konstrukte (Abbildung 5) zu den Kontrollen (Abbildung 4) aufgrund der Differenz in der Kopienzahl von GFP und DsRed Konstrukte in diesen Zellen verglichen. Jede Zelle in dem Experiment enthält nur eine Kopie des integrierten Reporter-Konstrukt wird somit erfolgreicher Reparatur Ereignisse rekonstruieren das GFP-Gen in einem Bruchteil der Zellen. Die Transfektion mit 0,1 ug pDsRed2-N1 in menschlichen Fibroblasten liefert ca. 1 Plasmid Kopie pro Zelle.
Die Effizienz der NHEJ und HR wird als Verhältnis von GFP + / DsRed + Zellen berechnet. NHEJ ist ein effizienter Prozess als HR in menschlichen Zellen 2. In menschlichen Fibroblasten der NHEJ Effizienz ist in der Regel 0,6 bis 1,3, und HR-Effizienz ist 0,05-0,3. Da DSB Effizienz als Verhältnis GFP gemessen + / DsRed + Zellen Schwankungen in der Mischung aus I-SceI und DsRed2-N1 Plasmide können das Ergebnis beeinflussen. Die Plasmid-Qualität kann auch Auswirkungen auf die Ergebnisse, indem Transfektionseffizienz. Deshalb, um konsistente Messungen zu erhalten, ist es wichtig, die gleichen Plasmid-Mix in einem Experiment zu verwenden. Darüber hinaus ist der DSB-Reparatur Effizienz durch Zelltyp, Zellzyklus-Phase und chromosomale Lage der integrierten Konstrukte betroffen.
Abbildung 1. Reporter-Konstrukte für die Analyse von DNA DSB-Reparatur durch NHEJ (A) und HR (B). (C) Inkompatible DNA-Enden erzeugt durch Verdauung von zwei invertierten I-SceI Websites SD, Splice-Donor, SA, Splice-Akzeptor; schattige Plätze, Polyadenylierungsstellen; Neo / Kana, einzelne ORF durch zwei Promotoren gesteuert:. SV40 verleihen Neomycinresistenz in Säugetierzellen Zellen und β-Lactamase-Verleihung kanamicyn Widerstand in E. coli; Ori, E. Coli pUC Replikationsursprung.
Abbildung 2. Reporter für die Analyse von NHEJ konstruieren In diesem Konstrukt das GFP-Gen inaktiv ist;. Aber bei Induktion eines DSB und erfolgreiche NHEJ das Konstrukt wird GFP +. Unten ist eine Reparatur Produkt dieser Reporter von NHEJ.
Abbildung 3. Reporter für die Analyse von HR durch Genkonversion konstruieren. Nach Induktion der DSBs durch I-SceI, HR durch Gen-Konversion (GC) wieder her eine aktive GFP-Gen. Hier findest du reparieren Produkte dieser Reporter von den großen DNA-Reparatur-Reaktionswege: GC, Crossing-over (X-over), Einzelstrang Annealing (SSA) und NHEJ. X-over Reparatur Produkt für intramolekulare Rekombination angezeigt wird, wird exramolecular Rekombination das gleiche Produkt, sondern befindet sich auf einem Chromosom. Gene aktiv GFP-Protein (GFP +) sind durch grüne Farbe angezeigt.
Abbildung 4. Die Kalibrierung der Parameter für die FACS-Analyse. (A) Fibroblasten mit dem pHPRT transfiziert, verwendet als negative Kontrolle für den Ausschluss von auto fluoreszierenden Zellen. (B) Fibroblasten mit pEGFP Plasmid transfiziert, verwendet für die Einstellung der Gating für GFP +-Zellen (grüner Bereich). (C) Fibroblasten mit pDsRed2-N1-Plasmid, zur Einstellung der Gating für DsRed +-Zellen (rote Fläche) verwendet transfiziert.
Abbildung 5. Typische Ergebnisse der Analyse der NHEJ (A) und HR (B) in normale menschliche Fibroblasten mit chromosomal integrierter Reporter-Konstrukte.
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Discussion
Die fluoreszierenden NHEJ und HR-Reporter-Assays bieten eine quantitative Weise gesondert Messen jeder DSB-Reparatur-Weg in vivo. Die Assays sind sehr empfindlich, wie FACS zuverlässig erkennen können 10 GFP +-Zellen in 20.000 Zellen. Die Tests können zur Messung der Reparatur Ereignisse in "real time" durch den Nachweis der Auftritt von GFP +-Zellen innerhalb von Minuten oder Stunden nach der Induktion von DSB 2 angepasst werden. Darüber hinaus ist die Analyse der GFP +-Zellen nicht auf zusätzliche Zellproliferation stützen, das DSB-Reparatur an verschiedenen Zellzyklus-Phasen nach der Behandlung mit verschiedenen Medikamenten, die Verhaftung der Zellteilung 6 analysiert werden. Dies stellt einen wichtigen Vorteil gegenüber Reporter-Konstrukte zur Rekonstitution eines Selektionsmarker basiert.
Die NHEJ Prozess ist untrennbar fehleranfällig Erzeugung verschiedene kleine Umstellungen an den Enden Kreuzungen. Die einzigartige Eigenschaft unseres NHEJ Reporter ist, dass die Reparatur Ereignisse innerhalb eines Introns, die Deletionen und Insertionen toleriert auftreten, so dass Erkennung von einem breiten Spektrum von NHEJ Veranstaltungen. Die HR-Konstrukt wird auf die gleiche modifizierte GFP-Gens als NHEJ Konstrukt erlaubt die vergleichende Analyse der NHEJ und HR. Die Verwendung von fluoreszierenden NHEJ und HR-Assays erleichtert die Untersuchungen von Säugetieren DSB-Reparatur.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die ursprüngliche GFP-Pem1 war ein Geschenk von Dr. Lei Li. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und der Ellison Medical Foundation zu VG und AS unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Round bottom tubes | BD Biosciences | 352058 | FACS tubes |
References
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