Summary
この記事では、GFPベースの蛍光を示して
Abstract
DNA二本鎖切断は、遺伝情報と細胞死の巨大な損失につながる可能性が最も危険なDNAの損傷です。非相同端接合（NHEJ）と相同組換え（HR）：2つの主要な経路を用いて細胞の修復DSBが。 NHEJとHRの摂動は、しばしば早期老化と腫瘍形成に関連付けられている、それゆえに各DSBの修復経路を測定する定量的な方法を持つことが重要です。当研究室では、NHEJとHRの高感度かつ定量的な測定を可能にする蛍光レポーターコンストラクトを開発しました。構文は、DSBが誘導のための珍しいカットI - SCEIのエンドヌクレアーゼの認識部位を含む工学GFPの遺伝子に基づいています。 GFP遺伝子は、追加のエクソンによって、または変異により不活性化されるように始まる構造はGFP陰性である。 NHEJまたはHRによるI - SCEI誘起ブレイクの成功修復は、機能的なGFPの遺伝子を復元します。フローサイトメトリーによってカウントGFP陽性細胞の数は、NHEJまたはHR効率の定量的な尺度を提供する。
Protocol
このプロトコルでは、DSBのが一過性発現珍しい切断エンドヌクレアーゼI - SCEI 3によって生体内で誘導される1,2を構築する染色体に統合されたレポーターにDNA DSB修復の分析のための方法を説明します。統合された分析は、染色体のコンテキスト内でDSBの修復を分析することの利点を提供します。しかし、このプロトコルは、初代培養細胞を扱うとき問題が発生することが継長時間細胞を、必要になります。
別のアプローチは、レポーター構築物はI - SCEIまたはをHindIIIエンドヌクレアーゼでin vitroで消化し 、直鎖DNAとして細胞にトランスフェクトされている体外アッセイである。 exctrachromosomalアッセイプロトコール4次の修正で以下に説明する統合されたアッセイに似ています。体外アッセイ用レポーターコンストラクトの統合を省略し、代わりにI - SCEIまたはHindIIIとトランスフェクションのコントロールとしてpDsRed2 - N10.1μgのin vitro で直線化プラスミドNHEJのレポーター0.5μgの細胞を同時トランスフェクション。 HRアッセイ用プラスミドの共トランスフェ2μgのHRの記者は、I - SCEIまたはHindIIIと0.1μgのpDsRed2 - N1で直鎖状。三日間トランスフェクション後にFACSで細胞を分析する。体外アッセイは、継代し、複数の細胞株の解析を容易にする豊富なセルを回避し、一次分離株におけるDSB修復の解析が可能になります。
1。 NHEJとHRのレポーターコンストラクト
NHEJのレポーターカセット5 PEM1遺伝子（GFP - PEM1）から工学3キロバイトイントロンを持つGFPの遺伝子が含まれています。 PEM1イントロンは、DSBが誘導のためのHindIII及びI - SCEIエンドヌクレアーゼ（図1a）のための認識配列に挟まれたアデノウイルスのエクソンが含まれています。 I - SCEIのサイトでは、逆方向になります。 I - SCEIはnonpalindromic認識配列を有し、したがって2つの逆方向のサイトには互換性のDNA末端（図1c）を生成します。互換性のDNAは、最高の自然に発生するDSBのを模倣終了します。無傷NHEJカセットはGFPアデノウイルスエクソンGFP ORFを破壊するように負である。 I - SCEIによるDSBが誘導されると、アデノウイルスエクソンは削除され、NHEJは、GFPの遺伝子（図2）の機能が復元されている。このNHEJレポーターのユニークな特徴は、イントロンが欠失および挿入を許容することができるので、それはNHEJイベントの広いスペクトルを検出できることです。
HRレポーターカセット1（図1b）もGFP - PEM1に基づいています。 HRのカセットでは、GFP - PEM1の第一エクソンは、3つの制限部位、I-SceI/HindIII/I-SceIの挿入と組み合わせて22 bpの欠失を含んでいます。欠失は、GFPがNHEJのイベントで再構成することが不可能になります。つのI - SCEIのサイトでは、I - SCEIの消化は、互換性のない両端（図1c）を残すように、逆方向になります。 GFP - PEM1の最初のコピーは、GFP - PEM1のpromoter-less/ATG-less第一エクソンとイントロンが続いている。無傷の構造はGFP陰性である。 I - SCEIの消化によるDSBの誘導時に機能的なGFPの遺伝子は、最初にGFP - PEM1エクソンの二つ変異のコピーの間に分子内や分子間遺伝子変換によって再構成される。 GFP遺伝子の番目のコピーは、最初のATGコドンと第2エキソンを欠くクロスオーバーまたは一本鎖アニーリングされているためとGFPの活動を復元しません。この設計は、哺乳動物細胞で優勢なHRの経路（図3）である遺伝子変換の排他的な検出、することができます。
2。レポーターの統合は、ゲノムに構築
- NHEJまたはHRのレポータープラスミドの高品質な準備を行う。最良の結果を得るにはキアゲン遠藤フリーキットを使用してください。 280分の260 nmでの吸光度がプラスミドの濃度と純度を測定します。
- 50μlのNheIを50 U（反応の合計量）37で6時間で消化することにより、レポータープラスミド10μgを線形℃のインキュベーター（蒸発を防ぐために、乾燥したブロックを使用しないでください）。キアゲンQiaexIIキット、10mMトリス- HCl pH8.0を20μlのに溶出したDNAを用いた消化液からDNAを精製する。 280分の260 nmの吸光度でDNA濃度と純度を測定します。通常は、精製の間にDNAの20〜30％を失うことになる。未消化のレポーターコンストラクトと一緒に、ゲルに小さな分量（2μl）を実行して、収量と消化を確認してください。精製された線形化レポーター構築物を20℃で保存することができます
- トランスフェクションのための準備で、最高の生育状態に細胞をもたらす。凍結バイアルから開始する場合、トランスフェクションの前に細胞を2回に分割。コンフルエント細胞のプレートから始まる場合、それらを一度に分割。
- 70〜80％コンフルエント（通常正常ヒト線維芽細胞のための二日間、メッキ5 × 10 5 cells/100 mmのプレートなら、）に細胞を成長させる。それは、対数増殖に細胞を持って最高のトランスフェクション効率のための非常に重要です。活発に成長している文化は、Mステージの細胞を（表面に付着した丸みを帯びた細胞として見られる）が含まれています。
- TRANSFAmaxa Nucleofector以下のメーカーの推奨を用いて細胞をECT。線維芽細胞は、NHDFのソリューションとプログラムのU20を使用してください。トランスフェクションのために、2つの100 mmプレート（〜2 × 10 6個の細胞）から細胞を採取する。それは上の細胞をトリプシン処理することではないが重要です。とすぐにプレートから切り離された細胞の80％として、トリプシン処理を停止します。 NHDF溶液中で細胞を再懸濁します。細胞がNHDFのソリューションに敏感である、従って、インキュベーション時間を最小限に抑え、穏やかに細胞を混在させること。線形化されたレポーター構築0.5μgので細胞をトランスフェクション。レポーターの単一コピーの統合における正常ヒト線維芽細胞の結果で使用されるこれらのトランスフェクション条件は、integrantsの大半を構築する。
- トランスフェクション後に1 mg / mLのジェネティシン（G418）24を追加することによって、染色体に統合されたレポーターコンストラクトを持つセルを選択します。 7〜10日の選択を続行します。
- G418耐性コロニーを（あなたが個々のコロニーやプール耐性クローンを選択できます）選択。約5 100 mmのプレートに文化を展開します。将来の使用のための3つのプレートを凍結し、所望の細胞数（通常10百ミリメートルプレートに5つのトランスフェクションのために十分である）に、残りの二つのプレートを展開します。
- 細胞は70〜80％コンフルエント（2日間線維芽細胞を100 mmプレート当り5 × 10 5細胞を播種した後に）到達すると、細胞はI - SCEIが発現するプラスミドでトランスフェクトする準備が整いました。
3。 I - SCEIエンドヌクレアーゼの一過性発現によるDSBの誘導
- トランスフェクション〜5μgのI - SCEI発現プラスミドおよび0.1μgのAmaxa Nucleofectorを（NHDFのソリューションおよび線維芽細胞のためのU20プログラムを使用して使用してトランスフェクション効率の制御などのpDsRed2 - N1（Clontech社製）の混合物と対数的に成長する文化の2 × 10 6個の細胞（二つのプレート） ）。
- 同時に、（i）の5μgのプラスミドEGFP発現で〜2 × 10 6個の細胞をtrasfectingによってFACSための3つのキャリブレーションコントロールを用意すること、（ii）5μgのpDsRed2 - N1、表現していないコントロールプラスミドの（ⅲ）5μgを蛍光タンパク質（我々がコードするプラスミドHPRTミニ遺伝子を使用している）。
- GFPとDsRedタンパク質の発現に十分な時間を提供するために、四日間のために細胞を成長させる。
- GFPとDsRedの検出のためのフィルターと蛍光倒立顕微鏡でGFPとDsRedタンパク質のトランスフェクションと発現の効率をトランスフェクションを確認した後（省略）三日。
4。フローサイトメトリーによるGFP +およびDsRed +細胞の解析
- トランスフェクションの収穫I - SCEIトランスフェクトした細胞とコントロール細胞の後の四日間。 PBS500μlに細胞を再懸濁し、FACSチューブに細胞を移す。この段階ではすべての細胞を回収し、丸い形の細胞を持つことが重要です。これを達成するために、それは長いトリプシン処理の時間またはより強力なトリプシンを使用することをお勧めします。細胞の99％がプレートから切り離されていることを確認し、顕微鏡下で細胞を観察することによって丸い形を持っている。 （箔と氷のバケツをカバーする）、光から保護氷上で細胞を維持する。数時間のために氷上で細胞を保存することが可能です。のために最良の結果は、収穫直後の細胞を分析する。
- GFP、DsRedを、およびネガティブコントロールとFACSをキャリブレーション。分析のすべての蛍光細胞（図4）を含めるために、電圧と色補正を調整します。実験試料の蛍光強度は、対照のそれよりも低くなることに留意してください。
- 分析I - SCEI FACSにより細胞をトランスフェクション。私たちは、それぞれの治療のために少なくとも20,000のセルをカウント。 GFPとDsRedの蛍光との間の潜在的な干渉を防止するためには、GFPのパーセント+またはDsRed + 25％以下の細胞を維持することが推奨されます。 DsRedを+またはGFP +細胞の割合が高い場合pDsRed2 - N1またはI - SCEIプラスミドの量を減らす。我々の実験では、唯一のpDsRed2 - N1プラスミドのではなく、プラスミドI - SCEIの量を調整する必要がありました。
- GFP +細胞のパーセントは、DNA DSB修復の効率に相当するとDsRed +細胞のパーセントは、トランスフェクションの効率を示します。 DsRedタンパク質+細胞へのGFP +細胞の比率としてDNA DSB修復の相対的な効率を算出する。
- 修理終了の接合は、修復の精度をテストするために配列決定することができる。レポーターコンストラクトは、複製の大腸菌の起源とカナマイシン耐性遺伝子（図1）を含んでいます。これは、EcoRI酵素、再環状化、および有能な大腸菌細胞への転換でゲノムDNAを消化することによって構造を救出することができます。救出プラスミドを制限酵素消化および配列決定により分析されています。
5。代表的な結果
コントロールのトランスフェクションのとNHEJとHRの実験の代表的なFACSの結果を図4と図5に示す。蛍光強度と蛍光細胞の数は、を積分を含むI - SCEIトランスフェクション細胞で低くなります。ED NHEJとHRの構造（図5）GFPとこれらの細胞にDsRedの構造のコピー数の違いによるコントロール（図4）と比較。実験の各セルは、統合されたレポーター構築のコピーを1つだけ含まれている、したがって、修復が成功のイベントには、細胞の割合で再構築GFP遺伝子を務める。ヒト線維芽細胞では0.1μgpDsRed2 - N1のトランスフェクションは細胞あたり約1プラスミドのコピーを提供します。
NHEJとHRの効率は、GFP + / DsRedタンパク質+細胞の比率として計算されます。 NHEJは、2つのヒト細胞におけるHRよりも効率的なプロセスです。ヒト線維芽細胞ではNHEJの効率は一般的に0.6から1.3であり、そしてHRの効率は0.05から0.3です。 DSB効率は比のGFP + / DsRedを+ I - SCEIとDsRed2の- N1の混合物中の細胞の変化として測定されるためのプラスミドは、結果に影響を与える可能性があります。プラスミドの品質はまた、トランスフェクション効率を変更することにより、結果に影響を与える可能性があります。したがって、一貫性のある測定値を得るために、それは一つの実験内の同じプラスミドミックスを使用することが重要です。また、DSBの修復効率は、細胞型、細胞周期の段階、および統合された構造の染色体位置の影響を受けます。
図1。レポーターはNHEJ（）とHR（B）によるDNA DSB修復の分析のために構築する。 （C）互換性のないDNAは、2つの逆方向のI - SCEIのサイトでの消化によって生成された終了 SD、スプライスドナー、SA、アクセプタースプライス、日陰の正方形、ポリアデニル化部位、ネオ/仮名、単一のORF 2つのプロモーターによって制御される：。哺乳類におけるSV40付与するネオマイシン耐性細胞、及び大腸菌のβ-ラクタマーゼ付与kanamicyn抵抗、オリ、E.大腸菌のpUC複製起点。
図2。 。レポーターNHEJの分析のために構築しこの中でGFP遺伝子を構築は非アクティブですがDSBと成功NHEJの誘導時に構造物はGFPの+になります。次に示すのは、NHEJによってこのレポーターの修理の製品です。
図3。レポーターは、遺伝子変換によるHRの分析のために構築する。遺伝子変換（GC）によってI - SCEI、HRによってDSBが誘導されると、アクティブなGFPの遺伝子を再構成。 GC、交差（クロスオーバー）、一本鎖（SSA）アニーリング、およびNHEJ：以下に示す主要なDNA修復経路により、このレポーターの修復の製品です。 X -オーバー修理製品は分子内組換えのために示されている、exramolecular組換えは、同じ製品を与えるが、1つの染色体上に位置される。アクティブなGFPタンパク質を発現する遺伝子（GFP +）緑の色で示されている。
図4。 FACS解析のためのパラメータのキャリブレーション。自動蛍光細胞を除くためのネガティブコントロールとして使用されるプラスミドpHPRT、でトランスフェクション（）線維芽細胞。 （B）繊維芽細胞は、GFP +細胞（緑色の領域）のためのゲートを設定するために使用される、プラスミドpEGFPをトランスフェクト。 （C）線維芽細胞はDsRedタンパク質+細胞（赤色の領域）のためのゲートを設定するために使用されるプラスミドpDsRed2 - N1でトランスフェクト。
図5。染色体に統合されたレポーターコンストラクトと正常ヒト線維芽細胞におけるNHEJ（）とHR（B）の分析の典型的な結果。
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Discussion
蛍光NHEJとHRのレポーターアッセイでは、別々にin vivoで各DSBの修復経路を測定するための定量的な方法を提供します。 FACSは、確実に20,000細胞で10 GFP +細胞を検出することができるようなアッセイは、非常に敏感です。アッセイは、DSBの2の誘導後数分または数時間以内GFP +細胞の出現を検出することにより、"リ アルタイム"で修復イベントを測定するために適合させることができる。さらに、GFP +細胞の分析は、DSBの修復は細胞分裂を停止させる6その様々な薬による治療後に別の細胞周期の段階で分析できるように、追加の細胞増殖に依存しません。これは、選択マーカーの再構成に基づいて、レポーターコンストラクト上重要な利点を提供します。
NHEJプロセスは、本質的にエラーが発生しやすい両端の接合部において、様々な小さな再配列を生成しています。私たちのNHEJレポーターのユニークなプロパティは、修理のイベントがこのようにNHEJイベントの広いスペクトルの検出を可能にする、欠失および挿入を許容するイントロン内で発生するということです。 NHEJはNHEJとHRの比較分析を可能にする構成としてHR構築物は、同一の改変GFPの遺伝子に基づいています。蛍光NHEJとHRアッセイの使用は、哺乳類のDSB修復の研究を促進する。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
オリジナルのGFP - PEM1は博士レイリーから寄贈されたもの。この作品は、NIHとエリソン医学財団からVGへの補助金によってと同様にサポートされて
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Round bottom tubes | BD Biosciences | 352058 | FACS tubes |
References
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- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
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