El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

Summary

En este artículo se describen las buenas prácticas agrarias basadas en la fluorescencia

Abstract

ADN de doble filamento se rompe son las lesiones del ADN más peligrosa que puede conducir a la pérdida masiva de información genética y la muerte celular. Las células de reparación de DSBs con dos vías principales: no homólogos fin de unirse (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). Las perturbaciones de NHEJ y de recursos humanos a menudo se asocian con el envejecimiento prematuro y la tumorogénesis, por lo tanto es importante tener una forma cuantitativa de medición de cada vía de reparación del OSD. Nuestro laboratorio ha desarrollado estructuras fluorescentes reportero que permiten la medición sensible y cuantitativo de NHEJ y de recursos humanos. Las construcciones se basan en un gen GFP diseñado que contiene sitios de reconocimiento para un poco de corte I-II CPE endonucleasa para la inducción de DSBs. Las construcciones de partida son las buenas prácticas agrarias negativas como el gen de la GFP se inactiva por un exón adicional, o por mutaciones. Éxito de la reparación de la I-SCE-inducida por NHEJ rompe o HR restaura el gen GFP funcional. El número de células GFP positivos contados por citometría de flujo proporciona una medida cuantitativa de NHEJ o la eficiencia de recursos humanos.

Protocol

En este protocolo se describe el método para el análisis de la reparación del ADN con el reportero del OSD integrado cromosómicamente construcciones de ^1,2 en DSBs son inducidos en vivo por la expresión transitoria una endonucleasa de corte rara I-SCE ^3. El ensayo integrado proporciona la ventaja de analizar la reparación del OSD en el contexto de los cromosomas. Sin embargo, este protocolo requiere células prolongada pases, lo que puede ser problemático cuando se trabaja con células primarias.

Un enfoque alternativo es un ensayo extracromosómico en reportero construcciones se digieren in vitro con el I-SCE o endonucleasas HindIII y transfectadas en las células como ADN lineal. El protocolo del ensayo exctrachromosomal ⁴ es similar a la prueba integrada se describe a continuación con las siguientes modificaciones. Para el ensayo de extracromosómico omitir la integración de las construcciones de reportero y en su lugar co-transfectar las células con 0,5 ug de reportero NHEJ plásmido linealizado in vitro con el I-SCE o HindIII y 0,1 mg de pDsRed2-N1 como control de transfección. Para el ensayo de recursos humanos co-transfectar 2 reportero HR mg plásmido linearizado con I-SCE o HindIII y 0,1 mg pDsRed2-N1. Analizar las células por FACS tres días después de la transfección. El ensayo extracromosómico permite el análisis de la reparación del OSD en los aislados primarios, evitando celular extensa pases, y facilitar el análisis de múltiples líneas celulares.

1. Construye reportero de NHEJ y de recursos humanos

El cassette reportero NHEJ ⁵ contiene un gen GFP con una ingeniería intrón 3 kb del gen Pem1 (GFP-Pem1). El intrón Pem1 contiene un exón adenoviral flanqueado por secuencias de reconocimiento para las endonucleasas HindIII y SCE (Figura 1a) para la inducción de DSBs. Las páginas de I-SCE se encuentran en orientación invertida. I-SCE tiene una secuencia de reconocimiento nonpalindromic, por lo tanto, dos sitios invertido generar extremos incompatibles ADN (Figura 1c). ADN incompatible termina mejor imitar el DSBs natural. El casete intacta NHEJ es GFP negativas como el exón adenoviral interrumpe la ORF GFP. Tras la inducción de DSBs por I-II CPE, el exón adenoviral se retira y NHEJ restaura la función del gen de la GFP (Figura 2). La característica única de este reportero NHEJ es que se puede detectar una amplia gama de eventos NHEJ desde el intrón puede tolerar eliminaciones e inserciones.

El cassette reportero HR ¹ (Figura 1b) también se basa en la GFP-Pem1. En la cinta de recursos humanos, el primer exón de la GFP-Pem1 contiene una deleción de 22 pb en combinación con la inserción de tres sitios de restricción, I-SceI/HindIII/I-SceI. La supresión se asegura de que las buenas prácticas agrarias no se puede reconstituir un evento NHEJ. Los dos me-SCE sitios se encuentran en orientación invertida, de manera que I-SCE digestión hojas fines incompatibles (Figura 1c). La primera copia de la GFP-Pem1 es seguido por un promoter-less/ATG-less primer exón y el intrón de GFP-Pem1. La construcción está intacta GFP-negativos. Tras la inducción de un OSD por I-SCE digestión del gen GFP funcional se reconstituye por la conversión de genes intramolecular o intermolecular entre las dos copias mutadas de la primera GFP-Pem1 exón. Desde la segunda copia del gen de la GFP se carece del codón ATG primero y el segundo exón, cruzar o recocido de cadena sencilla no va a restaurar la actividad de las buenas prácticas agrarias. Este diseño permite la detección exclusiva de la conversión de genes, que es la vía de recursos humanos predominante en células de mamíferos (Figura 3).

2. Integración de los reportero construye en el genoma

1. Hacer una preparación de alta calidad de NHEJ o reportero de recursos humanos del plásmido. Para obtener los mejores resultados, utilice Qiagen Endo Kit gratis. Medir la concentración de plásmido y la pureza de la absorbancia a 260/280 nm.
2. Linealizar 10 mg del plásmido reportero por digestión con 50 U de NheI en 50 l (volumen total de la reacción) durante 6 horas a 37 ° C incubadora (no utilice el bloque seco, para evitar la evaporación). Purificar el ADN de la solución de digestión con Qiagen QiaexII Kit, eluir el ADN en 20 l de 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Medida de concentración de ADN y la pureza de la absorbancia a 260/280 nm. Por lo general, se pierde un 20-30% del ADN durante la purificación. Confirmar el rendimiento y la digestión mediante la ejecución de una pequeña alícuota (2 l) en un gel, junto con un reportero de la construcción de digerir. La construcción purificada reportero lineal se pueden almacenar a 20 ° C.
3. En preparación para la transfección, las células de traer a las mejores condiciones de crecimiento. Si a partir de un vial congelado, dividir las células dos veces antes de la transfección. Si a partir de una placa de células confluentes, dividir una vez.
4. Crecer las células a un 70-80% de confluencia (por lo general dos días, si plateado 5x10 ⁵ mm células/100 placa, por los fibroblastos humanos normales). Es fundamental para la mejor eficiencia de la transfección de llevar las células en crecimiento logarítmico. La cultura en crecimiento activo contiene células en fase M (visto como células redondeadas unidas a la superficie).
5. Transfect las células con las recomendaciones del fabricante Amaxa siguientes Nucleofector es. Para utilizar la solución de los fibroblastos NHDF y Sub-20 del programa. Para la transfección, las células de la cosecha a partir de dos placas de 100 mm (~ 2x10 ⁶ células). Es muy importante que no trypsinize sobre las células. Dejar de tripsinización tan pronto como el 80% de células separadas de la placa. Resuspender las células en una solución de NHDF. Las células son sensibles a la solución de NHDF, por lo tanto, minimizar el tiempo de incubación y mezclar suavemente las células. Transfectar las células con 0,5 ug de reportero construir en forma lineal. Estas condiciones de transfección, cuando se utiliza con el resultado de los fibroblastos humanos normales en la integración de una sola copia de un reportero de la construcción de la mayoría de los integrantes.
6. Seleccione las celdas con las construcciones de reportero cromosómicamente integrado por la adición de 1 mg / ml de geneticina (G418) 24 horas después de la transfección. Continuar la selección durante 7-10 días.
7. Elige las colonias resistentes a G418 (usted puede escoger las colonias individuales o en la piscina de los clones resistentes). Ampliar la cultura de aproximadamente cinco placas de 100 mm. Congelación de tres platos para su uso futuro y ampliar otros dos placas con el número de células deseadas (por lo general diez placas de 100 mm son suficientes para cinco transfecciones).
8. Cuando las células alcanzan 70-80% de confluencia (dos días después de placas 5x10 ⁵ células por placa de 100 mm para los fibroblastos), las células están listos para ser transfectadas con I-II CPE expresión del plásmido.

3. La inducción de la OSD por la expresión transitoria de la I-SCE endonucleasa

1. Transfectar ~ 2x10 ⁶ células (dos placas) de la cultura logarítmica de crecimiento con una mezcla de 5 g I-SCE expresar plásmido y 0,1 mg pDsRed2-N1 (Clontech) como un control de eficiencia de transfección utilizando Amaxa Nucleofector (utilizar la solución de NHDF y el programa Sub-20 de los fibroblastos ).
2. Al mismo tiempo, preparar tres controles de calibración para FACS por trasfecting ~ 2x10 ⁶ células con (i) 5 mg EGFP-expresando plásmido, (ii) 5 mg pDsRed2-N1, (iii) 5 g de un plásmido de control que no expresan una la proteína fluorescente (estamos utilizando un plásmido que codifica minigene HPRT).
3. Crecer las células durante cuatro días para dar tiempo suficiente para la expresión de la GFP y DsRed proteínas.
4. (Opcional) Tres días después de la transfección verificar la eficacia de la transfección y expresión de las buenas prácticas agrarias y de las proteínas fluorescentes DsRed por microscopio invertido con filtros para la detección de buenas prácticas agrarias y DsRed.

4. Análisis de la GFP + y células DsRed + por citometría de flujo

1. Cuatro días después de la transfección de la cosecha I-SCE células transfectadas y el control de las células. Resuspender las células en 500 l de PBS y la transferencia de células a las trompas de FACS. En esta etapa es fundamental para cosechar todas las células y tienen células de forma redonda. Para lograr esto, se recomienda utilizar un tiempo más largo o un tripsinización tripsina más fuerte. Confirmar que el 99% de las células se separan de la placa y tienen forma redonda al observar las células bajo el microscopio. Mantener las células en hielo protegido de la luz (cubierta cubo de hielo con papel de aluminio). Es posible almacenar las células en hielo durante unas horas. Para obtener los mejores resultados de análisis de las células inmediatamente después de la cosecha.
2. Calibrar FACS con las buenas prácticas agrarias, DsRed y los controles negativos. Ajustar el voltaje y la compensación de color con el fin de incluir todas las células fluorescentes en el análisis (Figura 4). Tenga en cuenta que la intensidad de fluorescencia de las muestras experimentales será más baja que la de los controles.
3. Analizar I-SCE células transfectadas por FACS. Contamos con al menos 20.000 células por cada tratamiento. Para evitar posibles interferencias entre las buenas prácticas agrarias y DsRed fluorescencia se recomienda para mantener el porcentaje de las buenas prácticas agrarias + o DsRed + células por debajo del 25%. Si el porcentaje de DsRed + o células GFP + es más alto reducirá la cantidad de pDsRed2-N1 o me SCE-plásmido. En nuestros experimentos sólo se necesita para ajustar la cantidad de pDsRed2-N1 plásmido, pero no del plásmido I-SCE.
4. El porcentaje de células GFP + corresponde a la eficiencia de reparación del ADN del OSD y el porcentaje de células + DsRed indica la eficiencia de la transfección. Calcular la eficiencia relativa de reparación del ADN OSD como la proporción de células GFP + + en las células DsRed.
5. Las uniones final reparados pueden ser secuenciados para probar la exactitud de la reparación. El reportero construcciones contienen el origen de la replicación de E. coli y los genes de resistencia a la kanamicina (Figura 1). Esto permite el rescate de las construcciones por la digestión del ADN genómico con EcoRI enzima, recircularization, y su transformación en células competentes de E. coli. Los plásmidos rescatados son analizadas por la digestión de restricción y secuenciación.

5. Resultados representante

FACS resultados típicos de la transfección de control y de NHEJ y experimentos de recursos humanos en las Figuras 4 y 5. La intensidad de fluorescencia y el número de células fluorescentes serán más bajos en las células I-SCE transfectadas que contienen integrared NHEJ y construye HR (Figura 5) en comparación con los controles (Figura 4) debido a la diferencia en el número de copias de las buenas prácticas agrarias y DsRed construye en estas células. Cada célula en el experimento sólo contiene una copia del reportero construir integrada, los eventos de reparación tanto éxito se reconstituirá el gen de la GFP en una fracción de las células. Transfección con 0,1 mg pDsRed2-N1 en fibroblastos humanos ofrece aproximadamente una copia del plásmido por célula.

La eficiencia de los recursos humanos y NHEJ se calcula como la relación de las buenas prácticas agrarias + / DsRed + en las células. NHEJ es un proceso más eficiente que la de recursos humanos en las células humanas ^2. En los fibroblastos humanos de la eficiencia NHEJ es típicamente 0.6-1.3, y la eficiencia de recursos humanos es 0.05-0.3. Dado que la eficiencia del OSD se mide como una proporción de GFP + / DsRed + variaciones de las células de la mezcla de I-SCE y los plásmidos DsRed2-N1 puede afectar al resultado. La calidad del plásmido también puede afectar los resultados al cambiar la eficiencia de transfección. Por lo tanto, para obtener medidas consistentes, es importante utilizar la mezcla mismo plásmido dentro de un experimento. Por otra parte, la eficiencia de reparación del OSD se ve afectada por el tipo de células, la fase del ciclo celular y localización cromosómica de las construcciones integradas.

Figura 1. Reportero construye para el análisis de la reparación del ADN OSD por NHEJ (A) y HR (B). (C) del ADN incompatibles extremos generados por la digestión de dos invertida I-SCE sitios SD, empalme de donantes, SA, aceptor de empalme, sombreadas plazas, sitios de poliadenilación, Neo / Kana, único ORF controlada por dos promotores:. SV40 que confiere resistencia a la neomicina en los mamíferos las células, y β-lactamasa que confiere resistencia kanamicyn en E. coli, Ori, E. Coli pUC origen de replicación.

Figura 2. Reportero construir para el análisis de NHEJ En esta construcción el gen de la GFP está inactivo;. Sin embargo, la inducción de un NHEJ OSD y el éxito se convierte en la construcción GFP +. A continuación se muestra un producto de reparación de este reportero por NHEJ.

Figura 3. Reportero construir para el análisis de recursos humanos por la conversión de genes. Tras la inducción de la DSBs por I-SCE, de recursos humanos por conversión génica (GC) reconstituye un gen GFP activo. A continuación se muestran los productos de reparación de este reportero por la vías de reparación del ADN importantes: GC, cruzando (X-over), solo capítulo recocido (SSA), y NHEJ. X-over reparación del producto se muestra para la recombinación intramolecular, la recombinación exramolecular dará el mismo producto pero se encuentra en un cromosoma. Los genes que expresan proteínas GFP activa (GFP +) se indican con color verde.

Figura 4. Calibración de los parámetros para el análisis de FACS. (A) Los fibroblastos transfectados con el plásmido pHPRT, utilizado como control negativo para excluir a las células auto fluorescentes. (B) Los fibroblastos transfectados con el plásmido pEGFP, que se utiliza para ajustar la puerta de enlace para las buenas prácticas agrarias + células (zona verde). (C) Los fibroblastos transfectados con el plásmido pDsRed2-N1, que se utiliza para ajustar la puerta de enlace para las células + DsRed (zona roja).

Figura 5. Los resultados típicos del análisis de NHEJ (A) y HR (B) en los fibroblastos humanos normales con las construcciones de reportero integrado cromosómicamente.

Discussion

Los fluorescentes NHEJ y ensayos HR reportero proporcionan una forma cuantitativa para medir por separado cada vía de reparación del OSD en vivo. Los ensayos son muy sensibles, como FACS puede detectar con fiabilidad 10 células GFP + de 20.000 células. Los ensayos pueden ser adaptados para medir los eventos de reparación en "tiempo real" mediante la detección de la aparición de células GFP + en minutos u horas después de la inducción de DSBs ^2. Además, el análisis de las células GFP + no se basa en la proliferación de células adicionales, permitiendo la reparación del OSD para ser analizado en diferentes etapas del ciclo celular después del tratamiento con diversos fármacos que la división de la detención de ⁶ celdas. Esto proporciona una ventaja importante sobre reportero construye sobre la base de la reconstitución de un marcador de selección.

El proceso NHEJ es intrínsecamente generando propenso a errores reajustes varios pequeños en las uniones de los extremos. La característica única de nuestro reportero NHEJ es que los eventos ocurren de reparación dentro de un intrón, que tolera deleciones e inserciones, permitiendo así la detección de un amplio espectro de eventos NHEJ. La construcción de recursos humanos se basa en el gen GFP misma modificación como la construcción de NHEJ permitiendo el análisis comparativo de NHEJ y de recursos humanos. El uso de lámparas fluorescentes NHEJ y ensayos de Recursos Humanos facilitará el estudio de los mamíferos de reparación de DSB.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi kit	Qiagen	12362
Qiaex II Gel Extraction Kit	Qiagen	20021
Amaxa Nucleofector	Lonza Inc.	AAD-1001
Geneticin (G418)	Invitrogen	11811-031
pDsRed2-N1	Clontech Laboratories	632406
Round bottom tubes	BD Biosciences	352058	FACS tubes