Summary
Her beskriver vi en metode for selektivt å endre genuttrykk i choroid plexus samtidig som man unngår påvirkning i andre hjerneområder.
Abstract
Choroid plexus (ChP) fungerer som en kritisk inngangsport for immuncelleinfiltrasjon i sentralnervesystemet (CNS) under både fysiologiske og patologiske forhold. Nyere forskning har vist at regulering av ChP-aktivitet kan gi beskyttelse mot CNS-lidelser. Imidlertid er det utfordrende å studere den biologiske funksjonen til ChP uten å påvirke andre hjernegrupper på grunn av dens delikate struktur. Denne studien presenterer en ny metode for genknockdown i ChP-vev ved bruk av adenoassosierte virus (AAV) eller sykliserende rekombinasjonsenzym (Cre) rekombinaseprotein bestående av TAT-sekvens (CRE-TAT). Resultatene viser at etter injeksjon av AAV eller CRE-TAT i lateral ventrikkel, var fluorescensen utelukkende konsentrert i ChP. Ved hjelp av denne tilnærmingen slo studien vellykket ned adenosinA2A-reseptoren (A2AR) i ChP ved hjelp av RNA-interferens (RNAi) eller Cre / locus av X-overP1 (Cre / LoxP) -systemer, og viste at denne knockdown kunne lindre patologien til eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE). Denne teknikken kan ha viktige implikasjoner for fremtidig forskning på ChPs rolle i CNS-lidelser.
Introduction
Choroid plexus (ChP) ble ofte antatt å bidra til å opprettholde hjernens funksjonelle homeostase ved å utskille cerebrospinalvæske (CSF) og hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF)1,2. Økende forskning de siste tre tiårene har vist at ChP representerer en distinkt vei for immuncelleinfiltrasjon i sentralnervesystemet (CNS).
De stramme kryssene (TJ) i ChP, sammensatt av et monolags ChP-epitel, opprettholder immunologisk homeostase ved å hindre makromolekyler og immunceller i å komme inn i hjernen3. Under visse patologiske forhold oppdager og reagerer imidlertid ChP-vevet på fareassosierte molekylære mønstre (DAMP) i CSF og blod, noe som fører til unormal immuninfiltrasjon og hjernedysfunksjon 4,5. Til tross for sin kritiske rolle, gjør ChPs lille størrelse og unike plassering i hjernen det vanskelig å studere funksjonen uten å påvirke andre hjernegrupper. Derfor er manipulering av genuttrykk spesifikt i ChP en ideell tilnærming til å forstå dens funksjon.
I utgangspunktet ble syklisasjonsrekombinasjonsenzym (Cre) transgene linjer, som uttrykker Cre under kontroll av promotorer som er spesifikke for gener uttrykt i ChP, ofte brukt til å slette målgener ved avl med floxed kandidatgener 6,7,8. For eksempel er transkripsjonsfaktoren Forkhead box J1 (FoxJ1) utelukkende uttrykt i ChP-epitelet i prenatal musehjerne7. Dermed ble FoxJ1-Cre-linjen ofte brukt til å slette gener som ligger i ChP 6,9. Suksessen til denne strategien avhenger imidlertid sterkt av spesifisiteten til promotoren. Det ble etter hvert oppdaget at FoxJ1-uttrykksmønsteret ikke var særegent nok, da FoxJ1 også var til stede i cilierte epitelceller i andre deler av hjernen og det perifere systemet7. For å overvinne denne begrensningen ble intracerebroventrikulær (ICV) injeksjon av Cre recombinase utført for å levere rekombinase til ventriklene i floxed transgene linjer. Denne strategien viste høy spesifisitet, som det fremgår av tilstedeværelsen av tdTomatfluorescens utelukkende i ChP-vevet10,11. Imidlertid er denne metoden fortsatt begrenset av tilgjengeligheten av floxed transgene muselinjer. For å løse dette problemet har forskere brukt ICV-injeksjon av adenoassosiert virus (AAV) for å oppnå ChP-spesifikk knockdown eller overekspresjon av målgener12,13. En omfattende evaluering av ulike AAV-serotyper for ChP-infeksjon viste at AAV2/5 og AAV2/8 har sterke infeksjonsevner i ChP, mens de ikke infiserer andre hjerneregioner. Det ble imidlertid påvist AAV2/8 som infiserte ependyma rundt ventriklene, mens AAV2/5-gruppen ikke viste infeksjon14. Denne metoden har fordelen av å overvinne begrensningene ved å anskaffe floxed transgene dyr.
Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll for genknockdown i ChP ved hjelp av to metoder: ICV av AAV2 / 5 som bærer shRNA av adenosin A2A-reseptoren (A 2A R) og Cre rekombinaseprotein bestående av TAT-sekvens (CRE-TAT) rekombinase for å oppnå ChP-spesifikk knockdown av A2AR. Studiefunnene tyder på at å slå ned A2AR i ChP kan lindre eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE). Denne detaljerte protokollen gir nyttig veiledning for ChP-funksjonsstudier og den spesifikke knockdown av gener i ChP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer beskrevet i denne studien ble utført i samsvar med retningslinjene som er skissert i NIHs veiledning for omsorg og bruk av forsøksdyr og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Wenzhou Medical University.
1. Dyr
- Kjøp hannmus C57BL/6 mus i alderen 8-12 uker og veier 20-22 g.
- Få tak i den transgene Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) muselinjen, og mannlige A2AR flox/ flox mus.
- Tilfeldig tilordne musene til to grupper og hus i bur, med maksimalt fem mus per bur, under en standard 12 t lys / 12 t mørk syklus i 1 uke.
- Gi musene tilstrekkelig mat og vann og hold dem ved en konstant temperatur ved 25 °C.
2. ChP-spesifikk knockdown av A2ARs med AAV2/5-shRNA
- Vei hver mus og skriv ned verdiene.
- Bedøv musene intraperitonealt med 1% pentobarbitalnatrium i en dose på 6-8 ml / kg tilsvarende 60-80 mg / kg pentobarbital, og legg musen på en varmepute for å holde den varm.
MERK: Det er avgjørende å administrere riktig dose av pentobarbitalnatrium i henhold til musens vekt for å sikre vellykket kirurgi. Anestesien bør ikke være for dyp, da det kan føre til dødelighet, men bør ikke være for grunt, da musen kan våkne opp under prosedyren, noe som potensielt påvirker effektiviteten av virusinjeksjonen. Sjekk for riktig anestesidose ved tåklemme og sørg for at mus ikke svarer. - Bruk en spesialisert musebarbermaskin for å trimme det øverste håret til de bedøvede musene.
- Påfør øyesalve på begge øynene for å forhindre tørking, og fest musene på et stereotaktisk apparat for å immobilisere hjernen. Dekk dyret med en steril drapering.
- Steriliser huden på musens hode og nakke grundig med tre runder iodophor desinfeksjonsmiddel og 75% alkohol for å redusere postoperativ infeksjon. Påfør deretter 1% lidokain lokalt i hodebunnen av mus og gjør et lite snitt for å fullstendig eksponere skallen under et mikroskop.
MERK: Bruk sterile instrumenter under hele prosedyren. - Klargjør to 10 μL sprøyter: en med kjøpt AAV2/5-A2AR-shRNA (titer: 6,27 × 10 9 vg/μL) og den andre med innkjøpt AAV2/5-Scramble (titer: 6,21 × 109 vg/μL).
MERK: Når sprøyten brukes, må frontenden kobles til en glasskapillær, og et område på 10 μL kan oppnås ved å kontrollere lengden på glasskapillæren. - Bruk mikroskopet til å lokalisere bregma og lambda og angi koordinatpunktet (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2,20) på 10 μL-sprøyten (figur 1). Koordinatpunktet er basert på musens hjerne stereotaksiske atlas15.
- Bor et lite hull i skallen ved det justerte koordinatpunktet.
MERK: Under mikroskopet utføres boring ved hjelp av en steril mikrodrill mot overflaten av skallen. Etter boring, ved å fjerne hjernehinnene som dekker hjernen og utsette den underliggende hjernen parenchyma, er skade på blodårene forhindret. Dette trinnet forhindrer at spissen av glasskapillæren brytes av av hjernehinnene. Diameteren på det borede hullet skal være tilstrekkelig til at nålespissen kan komme inn i hjernevevet. - Administrer 2 μL AAV2/5-A2AR-shRNA-virus inn i hjerneventrikkelen via lateral injeksjon med en jevn hastighet på 100 nL/min. Hold kanylen på plass i 10 min før den trekkes ut. Merk at viruset ble administrert med ensidig injeksjon.
- Forsegl den skadede huden ved hjelp av medisinsk biofibrinlim omgående for å forhindre virustap, som kan skylles ut med CSF etter at nålen er fjernet hvis limet ikke påføres raskt. Bruk heller ikke bomullspinner til å tørke av CSF, da det også kan føre til virustap.
- For å lette utvinningen, plasser musen på en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen på 37,0 ± 0,5 ° C, og påfør 1% lidokain lokalt til musens hodebunn. La musene komme seg i 2 uker før du induserer EAE-modellen, da denne perioden er nødvendig for AAV2 / 5-A2AR-shRNA-virusuttrykk og påfølgende A2AR knockdown.
3. ChP-spesifikk knockdown av A 2AR med en Cre / locus av X-overP1 (Cre / LoxP) system
MERK: Følgende prosedyrer kan oppnås ved hjelp av metoden beskrevet tidligere. Se trinn 2.1-2.11 for detaljerte injeksjonsmetoder.
- Injiser 2 μL CRE-TAT rekombinase i hver laterale ventrikkel i en Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mus som eksperimentell gruppe og 2 μL steril fosfatbufret saltvann (PBS) som kontrollgruppe. Bruk samme protokoll som ovenfor (avsnitt 2), injiser 2 μL CRE-TAT rekombinase i hver av de laterale ventriklene til A2AR flox/flox-mus sammen med 2 μL steril PBS som kontrollgruppe.
- Forbered frosne vevsseksjoner og utfør nukleær farging 2 uker etter CRE-TAT rekombinaseinjeksjonen. Se trinn 4.1-4.3 for mer informasjon.
4. Transkardial perfusjon hos mus
- Administrer 60-80 mg / kg pentobarbitalnatrium for å bedøve musene dypt. Bekreft anestesiplanet med en tåklemme og utfør transkardial perfusjon med 40 ml steril PBS-oppløsning etterfulgt av 20 ml 4% paraformaldehyd (PFA).
MERK: Vellykket perfusjon indikeres av en hvit farge i leveren, mens tilstedeværelsen av forstørrede lunger eller PBS-utstrømning fra munnen under perfusjon antyder en feil i prosedyren. - Trekk raskt ut musehjernen, og sørg for minimal proteinnedbrytning.
- Senk musehjernen i 4% PFA / PBS over natten for postfiksering, etterfulgt av erstatning med 30% sukrose PB-løsning i 72 timer.
MERK: Det er viktig å unngå overdreven dehydrering av hjernevevet, slik at hjernen ikke bør stå i sukrose PB-løsningen for lenge.
5. Seksjonering og farging av frosset vev
- Legg inn den tidligere dehydrerte musehjernen i optimal skjæretemperatur (OCT) lim, frys den innebygde hjernen, og bruk en glidende mikrotome for å kutte koronale seksjoner med en tykkelse på 20 μm.
- Plasser hjerneseksjonene på glassglasset. Når hjerneseksjonene er tørre, oppbevar dem i et kjøleskap på -20 °C for påfølgende eksperimenter.
- Plasser hvert glassglass i et rammehus og senk rammen ned i en beholder fylt med PBS for å skylle lysbildet grundig. Skyll forsiktig hjernelysbildene med PBS-oppløsning tre ganger, i 10 minutter hver gang.
MERK: Forsiktighet bør utvises for å forhindre at hjerneseksjonene faller av glassglasset. - Flekk hjernen glir med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) løsning i 10 min.
- Skyll hjernelysbildene med PBS-løsning i 5 minutter.
- Påfør en dråpe antifademonteringsmedium på hjerneseksjonene.
- Plasser en dekselslipp på hjerneseksjonene, forsegle dekselet med neglelakk, og analyser seksjonene ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop.
6. EAE-induksjon
MERK: Utfør EAE-induksjon etter 2 uker med shRNA eller CRE-TAT rekombinaseinjeksjon11.
- Lag en vandig løsning ved å blande 2,5 mg myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG35-55) med 2 ml PBS. Klargjør en komplett Freunds adjuvans (CFA) oljeoppløsning ved å blande M. tuberculosis (H37Ra) med ufullstendig Freunds adjuvans (IFA).
- Bland vann- og oljeløsningene i forholdet 1:1. Bruk et tee-rør til å piske blandingen til en olje-i-vann-tilstand.
MERK: Tee-røret kalles også et treveis rør. Det er et plastrør som kan kontrollere retningen av flytende løsning for å blande MOG35-55 og CFA helt. - Bruk en høyhastighets homogenisator for å lage MOG-antigenemulsjonen for EAE-modellen under isbadforhold.
- Bedøv musene intraperitonealt med 1% pentobarbitalnatrium i en dose på 6-8 ml / kg tilsvarende 60-80 mg / kg pentobarbital.
- MOG-antigenemulsjonen injiseres subkutant i fire forskjellige punkter (nakke, rygg, venstre og høyre hofter) i et volum på 10 ml/kg for totalt fire injeksjoner hver.
MERK: Det er viktig å velge injeksjonssted nøye, da forskjellige steder kan ha varierende effekter på morbiditet og dødelighet hos mus. I tillegg kan gjentatte MOG-injeksjoner føre til immuntoleranse, så forskergruppen valgte en enkelt injeksjonsmetode for å forhindre dette potensielle problemet. - Injiser umiddelbart 500 ng/ml kikhostetoksin (PT) intraperitonealt i en dose på 5 mg/kg etter MOG-injeksjon.
MERK: PT øker permeabiliteten til blod-hjernebarrieren (BBB) og letter infiltrasjonen av T-celler i hjernen. - Etter 48 timer injiseres PT-oppløsningen intraperitonealt med samme volum.
7. Nevrologisk underskuddsscore
- Evaluer og grader musene daglig ved hjelp av en vurderingsskala 16 fra 0 til15 for å vurdere forekomsten og alvorlighetsgraden av EAE i henhold til følgende nevrologiske underskudd:
Hale: 0 indikerer ingen tegn, 1 representerer en halvlammet hale, og 2 indikerer en fullstendig lammet hale.
Lemmer: 0 indikerer ingen tegn, 1 representerer en svak eller endret gange, 2 indikerer parese og 3 representerer en fullstendig lammet lem. - Tilordne et quadriplegic dyr som har fullstendig lammelse en score på 12, og tilordne dødelighet en poengsum på 15.
8. Hematoksylin-eosin (H&E) farging
- Ta den dehydrerte musehjernen og legg den inn i smeltet parafin. La parafinblokken avkjøles og stivne for senere bruk.
NOTAT: Parafinblokken skal være helt tørr og kjølig for å unngå vevskader. - Klipp musens hjerneparafinblokk i 5 μm tykke lysbilder. Legg parafinmusens hjerneseksjon på en glassglass og tørk den i en ovn på 60 °C i 3 timer.
- Senk lysbildene sekvensielt i xylenløsning I i 10 minutter, xylenløsning II i 10 minutter, 100% alkohol I i 3 min, 100% alkohol II i 3 min, 95% alkohol i 3 min, 90% alkohol i 3 min, 80% alkohol i 3 min, 70% alkohol i 3 minutter og destillert vann i 1 min.
9. Analyse av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR)
- Etter å ha perfusjonert musene med PBS, fjern ChP fra ventriklene og trekk ut RNA med Trizol. Syntetiser cDNA ved hjelp av det første Strand cDNA-syntesesettet.
- Utfør qPCR-analyse ved hjelp av Ex Taq SYBR-green premix og et sanntids PCR-system. Bruk følgende A2AR primere: fremover - GCCATCCCATTCGCCATCA; omvendt - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ChP-spesifikk A2AR knockdown ved ICV-injeksjon av AAV2/5-shRNA eller CRE-TAT
Rollen til A2AR i ChP som en kraftig regulator av nevral informasjon i EAE-patogenesen er fortsatt uklar. Å slå ned ChP-spesifikt A 2A R-uttrykk kan kaste lys over A2ARregulatoriske effekter på det sentrale immunsystemet i EAE og andre betennelser i nervesystemet. Denne studien brukte ICV-injeksjon av CRE-TAT for å redusere A 2A R-uttrykk i ChP av A2AR flox/ flox mus. For å sikre ChP-spesifisitet injiserte vi først CRE-TAT i laterale ventrikler hos Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) mus. Bildene indikerer at den spontane tdTomatfluorescensen var begrenset til ChP-vevet (figur 2). Tilsvarende administrerte studien AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV-enhanced green fluorescent protein (EGFP) i C57BL/6-mus og fant at EGFP-fluorescensen var begrenset til epitelcellelaget i ChP og infiserte ikke de omkringliggende parenkymale cellene nær laterale ventrikler (figur 3).
EAE-induksjon med MOG35-55
For å indusere stabil EAE ble mus subkutant injisert med en emulsjon bestående av MOG35-55 og CFA, etterfulgt av intraperitoneal injeksjon av PT på dag 0 og 2 etter immunisering (figur 4). Den kliniske symptomskalaen ble brukt til å evaluere EAE-score daglig, basert på hale- og lemmenes tilstand. Utbruddet av EAE ble definert som den første dagen med en EAE-score ≥1, mens varigheten mellom debut og topp EAE-score ble kalt det progressive stadiet.
ChP-spesifikk A2AR knockdown lindrer EAE-patologi
For å undersøke involveringen av A 2A R-signalet i EAE-patologi, benyttet studien en ChP-spesifikk A2AR knockdown. Studien slo spesifikt ned A2AR i ChP ved bruk av ICV-injeksjon av CRE-TAT eller AAV2/5-A2AR-shRNA. Ved 2 uker etter knockdown ble EAE indusert av MOG35-55 immunisering. Resultatene viste at, sammenlignet med kontrollgruppen, utviklet mus med A2AR knockdown mildere EAE-patologi, noe som fremgår av lavere score og redusert infiltrasjon av immunceller i ryggmargen (figur 5A, B, E, F). I tillegg ble fem EAE-induserte mus fra hver gruppe ved dag 20 etter MOG35-55-immunisering tilfeldig valgt. Etter perfusjon med PBS ble ChPs isolert for RNA-ekstraksjon og qPCR. qPCR-analysen viste at mRNA-nivåene av A 2A R var åpenbart redusert i AAV2/5-shRNA (A2AR-Kd) og CRE-TAT gruppene, sammenlignet med hver kontroll (figur 5C,D).
Figur 1 Anatomisk lokalisasjon av lateralt ventrikkelinjeksjonssted. (A) Et skjematisk diagram som viser punktet for virusinjeksjon. (B) Injeksjonsstedet for lateral ventrikkel ligger 0,58 mm under bregma og 1,1 mm lateralt for sagittalsuturen, som indikert med den røde prikken. (C) Et bilde som viser stedet for virusinjeksjon på en mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lokalisering av tdTomatfluorescens i ChP . (A,B) Representativt bilde av Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomatmus behandlet med ICV-injeksjon av CRETAT. Ved 2 uker senere ble tdTomato autofluorescens spesifikt lokalisert til ChP-vevet (n = 3/gruppe). (C,D) De sammenslåtte bildene av tdTomato autofluorescens og DAPI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av C57BL/6-mus tatt 2 uker etter ICV-injeksjon av AAV2/5-scramble-EGFP eller AAV2/5-shRNA-EGFP. (A,B) De representative bildene av mus injisert med AAV2/5-scramble-EGFP (n = 3/gruppe). (C,D) De representative bildene av mus injisert med AAV2/5-shRNA-EGFP (n = 3/gruppe). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Induksjon av EAE-modellen. (A) For det første injiseres MOG-antigenemulsjonen subkutant på fire forskjellige steder (nakke, rygg, venstre og høyre hofter), som er betegnet med røde prikker. (B) PT injiseres intraperitonealt på tidspunktet for immunisering og gjentas 2 dager senere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: ChP-spesifikk knockdown av A 2AR lindret EAE-patologi. (A) ChP-spesifikk knockdown av A 2A R i A2AR flox /flox mus, oppnådd gjennom ICV-injeksjon av CRE-TAT, førte til reduserte EAE kliniske score (n = 6-7 / gruppe). Statistisk analyse ble utført med toveis RM ANOVA etterfulgt av Sidaks multiple sammenligningstest. (B) ChP-spesifikk knockdown av A2AR i villtype (WT) mus, oppnådd med ICV-injeksjon av AAV2/5-shRNA, reduserte EAE kliniske score (n = 7-8/gruppe). Statistisk analyse ble utført med toveis RM ANOVA etterfulgt av Sidaks multiple sammenligningstest. (C,D) Resultater fra qPCR-analysen av A2AR mRNA-nivåer i ChP-vev (n = 5/gruppe). Statistisk analyse ble utført med uparet t-test. (E,F) H&E-farging. ChP-spesifikk A2AR knockdown dempet immuncelleinfiltrasjon i ryggmargen. Statistisk signifikans er representert som ###p < 0,001, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskningen presenterte to forskjellige tilnærminger for målrettet knockdown av ChP-gener. Den første tilnærmingen involverte ICV-injeksjon av CRE-TAT, som inneholder Cre recombinase, i A2AR flox/ flox mus. Den andre tilnærmingen innebar ICV-injeksjon av AAV2/5 som bærer shRNA av A2AR. Ved å benytte disse to strategiene oppnådde arbeidet den selektive knockdown av A2AR i ChP og var i stand til å demonstrere de beskyttende effektene av å hemme A2AR-signalering i ChP på EAE-patologi. Merk at denne protokollen inneholder to viktige trinn. For det første er den stereotaktiske lokaliseringsoperasjonen viktig, og betydelig avvik fra de foreslåtte koordinatene kan føre til tilfeldige feil. For det andre er volumet av det injiserte viruset kritisk, da det har blitt funnet at injeksjon av mindre enn 1 μL virus (~ 6 x 1012) også har en viss sjanse for feil. Dette skyldes muligens behovet for en tilstrekkelig mengde viruspartikler for tilstrekkelig infeksjon.
Bruk av Cre/LoxP-systemet tillot ikke observasjon av den nøyaktige fordelingen av CRE-TAT rekombinase i hjernen etter ICV-injeksjon. Som et resultat benyttet studien Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mus for å spore fordelingen av CRE-TAT ved bruk av autofluorescens av tdTomato-proteinet. Tomatfluorescensen var utelukkende lokalisert i ChP-vev 2 uker etter injisering av CRE-TAT intracerebroventrikulært, noe som indikerer at rekombinasen primært ble absorbert av ChP. Deretter ble CRE-TAT administrert til A 2A R flox/ flox mus, og en reduksjon i A2AR mRNA nivåer ble observert i ChP-vevet. Denne målrettede knockdown-strategien ble brukt til å undersøke rollen som kortikosteroidsignalering i ChP i formidling av psykologisk stress17. Alternativt brukte forskningen AAV2 / 5 for å levere shRNA designet for å målrette ChP-gener. Tidligere studier har evaluert infeksjonsevnen til ulike serotyper av AAV og lentivirus i ChP-vev og funnet at AAV2/5 og AAV2/8 var de mest effektive14. Studien viste at AAV2/5 var i stand til å infisere ChP spesifikt uten å forårsake åpenbare infeksjoner i andre hjernegrupper. Disse to metodene er mindre arbeidskrevende enn klassiske knockout-strategier som krever to transgene linjer (Cre- og Flox-linjer)6,18. En begrensning ved denne studien er fraværet av et gain-of-function-eksperiment med genoveruttrykk. Imidlertid ville en mulig tilnærming for å oppnå dette være å klone hele cDNA og pakke det inn i AAV2/5-viruset, som ville bli administrert via ICV-infeksjon. I en tidligere studie ble overekspresjon av NKCC1 i ChP ved bruk av AAV2/5 funnet å fremme CSF-clearance og redusere ventrikulomegali in vivo9. Det er viktig å merke seg at enten AAV2/5 eller Cre/LoxP-strategien har sin egen fordel. ICV-injeksjonen av CRE-TAT i transgene mus sikrer høy knockdown-effektivitet, da målgenet slettes direkte fra cellens DNA. Denne metoden avhenger imidlertid av produksjon og avl av floxed mus. På den annen side unngår ICV-injeksjonen av AAV2/5 den tidkrevende prosessen med å avle transgene mus. Imidlertid avhenger knockdown-effektiviteten til denne metoden i stor grad av ytelsen til det designede shRNA. Derfor kan forskere velge en passende metode basert på deres eksperimentelle forhold.
Multippel sklerose (MS) er en autoimmun sykdom som forårsaker betennelse og demyelinisering av hvit substans i CNS19. For å studere de patologiske mekanismene til MS har forskere brukt en EAE-modell som simulerer sykdommens symptomer, som demyelinisering og immuninfiltrasjon. Denne modellen anses som ideell for å forstå MS. I 2009 ble det oppdaget at immunceller infiltrerer CNS gjennom ChP, som er en nøkkelrute for immuncelleinngang i MS-patologi. Den "første bølgen" av immunceller går inn i CSF gjennom ChP, etterfulgt av den "andre bølgen", som kommer inn i hjerneparenkymet gjennom BBB20. Den "første bølgen" av immunceller fremmer betennelse og akselererer BBB-lekkasje, så hemming av immuninfiltrasjon ved ChP kan være nyttig for tidlig intervensjon i MS. Kjemokiner og adhesjonsmolekyler regulerer gatingaktiviteten til ChP, og kontrollerer lymfocyttenes evne til å infiltrere over den21,22,23.
Tidligere studier brukte helkropps knockout eller farmakologisk teknologi (som nøytraliserende antistoffer) for å undersøke signalmolekyler i ChP, men disse metodene definerte ikke nøyaktig deres biologiske funksjon i MS-patologisk prosess. I en nylig studie slo forskere ned A 2A R, lokalisert i ChP av A2AR flox/ flox mus,og fant at EAE-score og immuninfiltrasjon ble signifikant redusert11. Denne studien bekrefter rollen til A2AR-signalering i ChP under EAE-patologi og demonstrerer at ChP-spesifikke knockdown-metoder er nyttige verktøy for å studere ChP-funksjon i CNS-patologier.
Avslutningsvis er den ChP-spesifikke manipulasjonsprotokollen et ideelt verktøy for å utforske den biologiske funksjonen til ChP involvert i degenerative sykdommer i CNS, som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, MS og så videre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne sier at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser eller andre avsløringer å erklære.
Acknowledgments
Vi anerkjenner takknemlig støtten fra National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 31800903, tildelt W. Zheng) og Wenzhou Science and Technology Project (nr. Y2020426, tildelt Y Weng) for dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P.
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A.
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
