מאמר זה מתאר GFP מבוססי פלואורסצנציה<em> In vivo</em> מבחני כי בנפרד לכמת הומולוגיים רקומבינציה ו nonhomologous סוף להצטרף בתאי יונקים.
Abstract
גדיל הדנ"א הכפול הפסקות הם נגעים DNA המסוכן ביותר שעלול להוביל לאובדן מסיבי של מידע גנטי ומוות התא. תאים לתקן DSBs באמצעות שני מסלולים עיקריים: nonhomologous סוף להצטרף (NHEJ) ו הומולוגיים רקומבינציה (HR). הפרעות של NHEJ ו HR הקשורים לעתים קרובות עם הזדקנות מוקדמת ו tumorigenesis, ולכן חשוב לנו דרך כמותית למדוד כל מסלול תיקון DSB. המעבדה שלנו פיתחה בונה כתב ניאון המאפשרים מדידה כמותית של רגיש NHEJ משאבי אנוש. בונה מבוססים על גן ה-GFP מהונדסים המכיל אתרים הכרה endonuclease I-SCEI נדיר חיתוך לזירוז של DSBs. בונה החל GFP הם שליליים כמו הגן GFP הוא מובטל ידי אקסון נוספת, או על ידי מוטציות. תיקון מוצלח של שוברת את I-SCEI הנגרמת על ידי NHEJ או HR משחזר את גן ה-GFP תפקודית. מספר התאים GFP חיובי נספר על ידי cytometry זרימה מספקת למדוד כמותית של NHEJ או יעילות משאבי אנוש.
Protocol
בפרוטוקול זה אנו מתארים את שיטת ניתוח לתיקון DSB-DNA משולב עם הכתב chromosomally בונה 1,2 שבו DSBs הם המושרה in vivo על ידי ביטוי חולף endonuclease חיתוך נדיר I-SCEI 3. Assay משולב מספק את היתרונות של ניתוח לתיקון DSB בהקשר כרומוזומליות. עם זאת, פרוטוקול זה מחייב תא passaging ממושך, אשר ?…
Discussion
NHEJ פלורסנט מבחני HR כתב לספק דרך כמותית למדוד בנפרד עבור כל מסלול תיקון DSB in vivo. מבחני רגישים מאוד, כמו FACS יכולים לזהות באופן אמין 10 + התאים GFP ב 20,000 תאים. מבחני עשוי להיות מותאם למדידת אירועים לתקן "בזמן אמת" על ידי איתור את המראה של ה-GFP בתאים + בתוך דקות או שעות ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המקורי GFP-Pem1 היה מתנה ד"ר Li Lei. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH ו הרפואי אליסון קרן אל VG ו AS
Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (43), e2002, doi:10.3791/2002 (2010).