स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण
Summary
यह लेख GFP-आधारित प्रतिदीप्ति का वर्णन<em> Vivo में</em> Assays कि अलग मुताबिक़ पुनर्संयोजन यों और nonhomologous स्तनधारी कोशिकाओं में शामिल होने के अंत.
Abstract
डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता है सबसे खतरनाक डीएनए घावों कि आनुवंशिक जानकारी और कोशिका मृत्यु का भारी नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Nonhomologous अंत (NHEJ) में शामिल होने और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन): कोशिकाओं की मरम्मत दो प्रमुख रास्ते का उपयोग कर DSBs. NHEJ और मानव संसाधन के perturbations अक्सर समय से पहले बूढ़ा और tumorigenesis के साथ जुड़े रहे हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है प्रत्येक DSB मरम्मत मार्ग को मापने का एक मात्रात्मक तरीका है. हमारी प्रयोगशाला फ्लोरोसेंट संवाददाता constructs कि NHEJ और मानव संसाधन के संवेदनशील और मात्रात्मक माप की अनुमति विकसित किया है. constructs एक इंजीनियर GFP एक दुर्लभ काटने DSBs के शामिल होने के लिए मैं SceI endonuclease के लिए मान्यता साइटों युक्त जीन पर आधारित हैं. शुरू constructs GFP नकारात्मक GFP जीन के रूप में एक अतिरिक्त एक्सॉन द्वारा निष्क्रिय है, या परिवर्तन के द्वारा. NHEJ या मानव संसाधन के द्वारा मैं SceI प्रेरित टूट की मरम्मत सफल कार्यात्मक GFP जीन restores. GFP सकारात्मक प्रवाह cytometry द्वारा गिना कोशिकाओं की संख्या NHEJ या मानव संसाधन दक्षता के मात्रात्मक उपाय प्रदान करता है.
Protocol
Discussion
फ्लोरोसेंट NHEJ और मानव संसाधन संवाददाता assays vivo में अलग से प्रत्येक DSB मरम्मत मार्ग को मापने के लिए एक मात्रात्मक तरीके प्रदान करते हैं . assays के बहुत संवेदनशील होते हैं, के रूप में FACS मज़बूती से 20,000 कोशिकाओं …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
मूल GFP-Pem1 डॉ. Lei ली से एक उपहार था. यह काम NIH और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन से VG अनुदान द्वारा और के रूप में समर्थित किया गया था
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
References
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