브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 Micromirror 장치와 패턴 Photostimulation

Summary

디지털 micromirror 장치 (DMD)는 흥분의 연결을 제어할 수있는 시간과 공간의 복잡한 패턴을 생성할 수 있습니다. 설계, 건설 및 DMD 시스템의 운영과 관련된 문제가 논의됩니다. 이러한 시스템은 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 통합의 데모를 활성화.

Abstract

라이트의 연결을 흥분을 제어하는​​ 다목적 정확한 의미합니다. 이러한 채널 rhodopsin 및 갇힌 신경 전달 물질로 빛이 민감한 effectors의 최근 도입 공간 및 실험 신경 과학에 대한 유용한 시간에 빛의 패턴을 제어하는​​ 더 나은 방법을 개발에 관심이 들어서있다. 공촛점 및 2 광자 현미경에서 근무 한 종래의 전략은, 회절 제한된 장소에 조명을 집중하고 관심의 영역을 통해 순차적으로 그 하나의 자리를 검사하는 것입니다. 큰 영역을 짧은 시간 창, 이미지에 비해 photostimulation 더 적용 문제 이내에 자극해야 할 경우이 방법은 문제가된다. 대체 전략은 디지털 micromirror 장치 (DMD)의 도움을 대상에 전체 공간 패턴을 프로젝트에있다. DMD 접근 방식은 하드웨어 구성 요소가 상대적으로 저렴한 때문에 매력이며 상업적 이익에 의해 지원됩니다. 이러한 시스템이 직립 현미경 사용할 수 없기 때문에, 우리는 DMD 시스템의 구축 및 운영에 중요한 문제를 논의합니다. 우리가 주로 UV 광분해을위한 시스템의 구축을 설명한다하더라도, optogenetic 실험에 대해 훨씬 더 간단 가시 광선 시스템을 구축하기위한 수정도 제공됩니다. UV 광분해 시스템 신경 과학에 근본적인 질문을 연구하기 위해 실험을 carryout 위해 사용되었던, 어떻게 공간 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 통합된 입력을 배포합니다. 결과는 통합 지점 지점에 걸쳐 비선형 수 있으며 supralinearity가 주로 NMDA 수용체에 의해 중재되어 좋습니다.

Protocol

일반적인 설계 고려 사항

사진 자극의 파장 이러한 optogenetic의 실험으로 보이는 범위에있는 경우, 시스템의 레이아웃이 UV 광분해 실험에 비해 상당히 간단합니다. 하나는 현미경 회사의 모든에서 사용할 수있는 듀얼 카메라 포트 모듈을 구매해야합니다. DMD 비행기는 두 카메라의 포트 중 하나의 공액 이미지 평면에서 위치 수 있습니다. 카메라 선도 이미징 튜브 렌즈를 상용 현미경에도 자외선 파장에 대한 수정되지 않기 때문에 자외선 광분해에있는 치과에서 발생하는 빛을은 에피 조명 경로 (그림 3A)를 통해 가지고 있어야합니다. 350 nm의에서 이미징 튜브 렌즈의 구면 수차가 꽉 조여에 빛을 집중하고 충분한 공간 해상도를 생성할 수있는 능력을 막기 위해 충분히 심각한 것입니다. collimated 레이저가 같은 광학 축을 따라 가져온 때 튜브 렌즈가 제거되기 때문에이 문제는 공촛점 현미경에서 발생하지 않습니다. 거기 튜브 렌즈가 모든 부분 UV 파장에서 구면 수차에 대한 수정 때문에 자외선 조명의 문제는 에피 형광 경로를 통해 조명을 동원하여 해결하실 수 있습니다. 우리는 어떤 학위 저널 소원에 현미경의 광학에 확장할 수 있습니다. 과학 커뮤니티는이 주제에 일반적으로 빠른 관심에 잘 그것을 가르치는 많은 소스이 없습니다.

현미경의 수정을 최소화하고 있기 때문에 에피 형광 장치에 꽉 공간 제약을하기 위해서는 DMD은 릴레이 렌즈 (관련하여 DMD 장치의 위치 지적 만든 새로 만든 공액 이미지 비행기에 배치됩니다 현미경). 상업적인 자외선은 릴레이 렌즈 (그림과 현미경에 지적) (특수 광학) 구입한 수정.

DMD의 조명

는 바이너리 입력을 받으면 micromirror는 긍정적이고 부정적인 12 ° 기울기 칩의 비행기에 상대적으로 전환할 수 있습니다. 회전의 축은 각 미러 (칩의 양쪽에 45 °)의 대각선 모서리를 따라합니다. 미러 회전의 방향은 칩의 전면 표면 한 모서리에서 황금 색의 삼각형으로 지정되어 있습니다. micromirror의 기울기 각도가 들어오는 조명 빔의 높이와 azithmus의 정렬을 지시. 조명 광선의 피치는 DMD 칩 및 미러 회전 축에 수직으로 azithmus 요구의 수직 축에서 24 °해야합니다. 정확한 빔 정렬 효율적인 운영을 위해 중요합니다. 프로토 타입 시스템에서 우리는 우리가 설계와 가공에 대한 정확한 부족한 허용 여러 수동 기울기 조정을 설계했습니다. 이것은 필요한 것보다 상당히 더 부피가있는 시스템에서 발생. 빛 가운데에 데려 와서 대체보다 소형 협정 (유용하다고 판단하는 경우 대체 디자인을 표시) 할 수 있습니다.

광분해 실험을위한 레이저 소스 신속한 uncaging에 대한 높은 빛의 강도 집중 광선이 필요한 생성하기 위해 필요합니다. 고휘도 급격히 집중 조명이 필요하지 않습니다 optogenetic 실험 들어, 비 코히어런트 광원은 적절한 것입니다. 광분해 실험은 여기에 설명된 우리는 유사 지속적인 다이오드는 주파수 NdVO4 레이저 (1 W, 355 nm의)를 배로 고체 (DPSS)을 펌핑 고용. (광분해에 대한 광원의 선택에 대한 자세한 논의에 대한 참조 2 참조). DMD 시스템을 사용할 때 레이저 출력의 작은 파편만이 실제로 표본 전달되기 때문에 상대적으로 높은 전력 레이저 여기에서 설명하는 실험이 필요합니다. 표본에게 전달 빛의 금액은 레이저 빔 조명에 의해 지역 내에 ON / OFF 거울의 숫자의 비율에 비례합니다.

레이저 광원이 필요한 경우, 그것은 치과를 조명에 대한 올바른 축을 따라 위치와 방향을 쉽게 할 수 있도록 다중 광섬유로 레이저의 출력을 실행하는 것이 좋습니다. 광섬유를 통해 빛을 전송하는 것은 일관된 조명에 내재된 작은 반점 패턴을 제거하는 방법을, 두 번째 문제를 해결합니다. 섬유 ~ 40 kHz에서에서 진동 압전 섬유 신장기 (모델 915, 캐나다 계측 및 연구, (주)) 주위에 상처입니다. (장비에 지점이 밖으로) 섬유의 스트레칭 미세한는식으로 효과적으로 speckling의 효과를 제거, 각 사진의 자극 펄스의 밀리초 기간 동안 패턴을 여러 번 작은 반점 이동하기 충분합니다. 광섬유의 출력은 다음 자외선 현미경 목표 (올림푸스 DApo20UV)와 collimated 있습니다. (이것을 시점) 시스템의 광학 해상도의 교정은 그림에 표시됩니다. 3B. 로 사진의 장소의 위치의 함수로 전류 흐름의 진폭에 의해 측정된 유효 생리 해상도자극은 그림에 표시됩니다. 3C. 다양한 농도의 photostimulation 전류 응답을 그림 그림입니다. 3D.

시스템 운영 :

DMD 거울과 공동 등록 CCD 픽셀

사내 소프트웨어는 이미지 CCD 카메라의 특정 픽셀 개별 DMD 미러의 서신을 결정하는 것을 작성되었습니다. 이 소프트웨어 내에있는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)는 다음 사용자가 마우스로 태그 CCD 이미지의 영역에 해당하는 DMD 미러를 지정할 수 있습니다. 따라서 사진 자극에 대한 위치는 단순히 컴퓨터 화면에 표시되는 이미지 위로 커서를 이동하고 관심있는 태그 영역을 클릭하여 태그를하실 수 있습니다. (돌기 아버의 형광 이미지는 컴퓨터 화면에 표시됩니다. 학생이 컴퓨터 화면에 이미지를 통해 위치 번호를 표시합니다.)

빛의 전송을위한 패턴을 프로그래밍

운영자에 의해 컴퓨터 화면에 표시된 패턴은 별도의 이미지 시리즈로 저장됩니다. 각각의 공간적 패턴에 대한 레이저 펄스의 타이밍은 다음 데이터 수집 프로그램 (pClamp)와 통합되어 소프트웨어로 프로그래밍합니다. (이것을 보여줍니다.)

DMD 패턴에 레이저 펄스를 조정

데이터 수집 프로그램은 시작하고 대상 신경 세포에서 전기 신호를 채워 DMD 전자, 레이저의 게이팅 및 패치 인수의 타이밍을 조정합니다. (컴퓨터에서이 시퀀스를 시뮬레이트)

실험 데이터

말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 변론

전극과 돌기 통합은 전통적으로 개별 지역에서 자극의 진폭을 변화보다는 일정한 강도를 유지하면서 자극의 영역을 확대하여 실시되었습니다. electrogenesis과 위치에 의존 채널 모집의 포화에 관한 문제는 결과와 결론에 영향을 미칠 수있다. 분산 모수 석의 자극을 쉽게 DMD 기반 시스템 (그림 4A)를 사용하여 구현할 수 있습니다. 입력 강도는 photostimulation의 명소의 수를 늘림으로써 다양한했다. 우리는 공간 변론은 두 딸 지점에 도착 증가 입력 amplitudes와 함께 점점 위에 - 선형되는 지점 지점에 걸쳐 비선형 수 있습니다 볼 수 있습니다. 위에 - 선형성은 크게 NMDA 수용체를 중재하고 문이 채널 (그림 5) 전압하지

대표 결과

그림 1. DMD에있는 micromirrors 운영. (사이드 뷰) 개인 거울에서 감독 정전기 세력이 거울은 두 가지 방향 12 ° 수평에서 중 하나에 기울어져되도록. ON 위치에 입사 빔은 칩의 광학 축 직각 따라 이동합니다. OFF 위치에 입사 빔은 48 °에서 축을 이동합니다. 거울 사이의 얇은 간격을 조회 라이트는 24 °에서 축을 이동합니다. (톱 뷰) 기울기는 45 ° 방향이다 거울과 칩의 측면과 관련하여.

그림 2. 현대 형광 현미경의 기본 레이아웃. 필터 큐브는 객관적이고 튜브 렌즈 사이의 "무한의 공간"에 위치합니다. 카메라 연결 및 샘플에 빛을 가져다 조명 경로가 이미지 경로가 있습니다. 이 두 빛의 경로 튜브 렌즈는 일반적으로 디자인과 초점 길이 다릅니다. 조명은 아니지만 영상, 튜브 렌즈는 자외선 스펙트럼에서 작동하도록 설계되었습니다.

그림 3. UV 기반 DMD 시스템 레이아웃. 조명은 UV 스펙트럼에있다면, 그것은 자외선에 대한 해결 튜브 렌즈를 통해 가지고 있어야합니다. 이미지 경로에 튜브 렌즈는 자외선을 위해 설계되지 않습니다. 릴레이 시스템을 쉽게 액세스할 수 공액 이미지 비행기를 만들 필요합니다. 현미경의 다른 공액 이미지 비행기도 곳곳에 빨간색 선으로 표시됩니다. 하나의 이미지 평면에 밝은 패턴이 다른 공액 비행기에서 예상하고 있습니다. 이미징 동안 샘플 비행기의 패턴은 감지기 / 카메라로 예상된다. 조명에 대한 DMD에 의해 생성된 패턴은 샘플로 예상된다.

그림 4. 가시 광선 DMD 프로젝션 시스템 레이아웃. 조명 빛이 보이는 범위에있다면, 그것은 영상 조명 경로를 통해 DMD 생성된 빛의 패턴을 제공할 수 있습니다. 이것은 쉽게 commerci로 구현할 수 있습니다알 듀얼 카메라 포트 첨부하고 해당 이색성 거울.

그림 5. 체제의 래터럴 해상도. (A) 형광 목표 광학 해상도는 ~ 2 μm의 수 있습니다. (B)로 dendrite에 걸쳐 갇힌 글루 탐 산염의 광분해에 의해 측정된 유효 해상도는 ~ 5 μm의 수 있습니다. 증가 거리는 글루 탐 산염의 확산과 dendrite의 유한 너비의 조합에 의한 것입니다. (C) 광분해은 시냅스 사건의 속도론을 모방 수 있습니다. 전압의 가족이 현재의 응답 dendrite로 전달 빛 에너지의 차이에 의한 것입니다 고정되어.

그림 6. 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 변론. (A) 분산 입력은 별도로 두 가지 돌기에 적용됩니다. 각각의 전압 응답은 다음과 같습니다. (B) 자극 그러면 동시에 주어집니다. 측정 응답 (적색 추적)이 두 개인 응답 (회색 추적)의 산술 합계 다를 수 있습니다.

그림 7. Supralinear 변론은 NMDA 수용체 따라 달라집니다. (A) APV는 선택 NMDA 수용체 길항제는 supralinear 변론을 차단합니다. (B) 자극 강도 관계 및 NMDA 수용체 길항제하기 위해 감도는 꾸몄다됩니다.

Discussion

DMD 기반 photostimulation 접근의 장점은 목표가 비교적 큰 지역을 차지하고 상황에 가장 분명합니다. 관심의 대상이 같은 몇 가지 돌기의 쪽이 같은 매우 작은 경우, 순차 스캐닝 공촛점 및 2 광자 시스템은 좀더 나은 접근 방법이 될 가능성이 높습니다. DMD 접근법 중 하나는 큰 약점이 가능한 조명 자사의 비효율적 사용합니다. 사용 가능한 빛의 대량은 반드시 OFF 거울로 이동하고 사용되지 않습니다.

DMD 기반 시스템은 가장 가시 범위에서 작동에 적합합니다. 우리는 optogenetics 실험과 취업 때 DMD 기반 photostimulation 시스템은 상당한 영향을 미칠 것으로 예상.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355