分岐点間での樹の統合を調査するためにデジタルマイクロミラーデバイスと模様の光刺激

Summary

デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）は、神経細胞の興奮性を制御するために、時間と空間の複雑なパターンを生成することができます。 DMDシステムの設計、建設、および操作に関連する問題について説明します。このようなシステムは、遠位樹状分岐点を越え非線形統合のデモンストレーションを有効にする。

Abstract

光は、神経細胞の興奮性を制御するための汎用性と正確な手段です。このようなチャネルロドプシンとケージ神経伝達物質などの光に敏感なエフェクターの最近の導入は、スペースと実験的神経科学のための有用な時間で、光のパターンを制御するためのより良い手段を開発する上での利益につながっている。共焦点、2光子顕微鏡で使用されている1つの従来の戦略は、回折限界のスポットに光を集中し、関心領域で順次にその単一のスポットをスキャンすることです。大きな領域は、短い時間枠の、イメージングのためのより光刺激により適用される問題の中で刺激する必要がある場合は、この手法には問題になります。代替戦略は、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）の助けを借りて、ターゲット上で完全な空間パターンを投影することです。 DMDのアプローチは、ハードウェアコンポーネントが比較的安価であるため魅力的ですし、商業的利益によってサポートされています。そのようなシステムは直立顕微鏡の利用できないため、我々はこのようなDMDシステムの構築と運用に重要な問題を議論します。我々は主に紫外光分解のためにシステムの構築を記述する場合でも、optogeneticの実験のためにはるかに簡単な可視光システムを構築するための修正も提供されます。 UV光分解システムは神経科学における基本的な問題を研究する実験をCARRYOUTするために使用された、どのように空間的に遠位樹状分岐点間で統合の入力を配布されます。結果は、統合が分岐点を越え非線形することができ、超線形の大部分がNMDA受容体によって媒介されることを示唆している。

Protocol

一般的な設計上の考慮事項

写真刺激の波長は、そのようなoptogenetic実験用として、可視範囲内にある場合、システムのレイアウトは、UV光分解実験よりもかなり単純になります。一つは、顕微鏡の会社のすべてから使用可能なデュアルカメラポートのモジュールを購入する必要があります。 DMD平面は2つのカメラポートのいずれかの共役結像面に配置することができます。カメラにつながるの撮像管のレンズは市販の顕微鏡のいずれかでUV波長に対して補正されていないので、しかし、UV光分解でDMDから発信された光は、落射照明のパス（図3A）を介して持ち込まれている必要があります。 350nmでの撮像管レンズの球面収差は、狭い場所に光を集中すると十分な空間分解能を生成する能力を防ぐのに十分厳しいです。平行レーザービームが同じ光軸に沿って持って来られるときにチューブレンズが削除されるため、この問題は、共焦点顕微鏡では発生しません。そこにチューブのレンズはすべて部分的に紫外波長における球面収差を補正しているため、UV照射の問題は、落射蛍光パスを通る光を取り込むことで解決できます。我々は、どの程度ジャーナルの希望に顕微鏡の光学系に拡張することができます。科学界は、このトピックでは一般的な迅速な興味がでており、よくそれを教える多くのソースがないです。

顕微鏡の改造を最小限とするため落射蛍光ユニットでタイトなスペースの制約のためには、DMDは、リレーレンズ（との関係でDMDユニットの位置を指摘することによって作成された、新しく作成された共役結像面に配置されています顕微鏡）。商業UVは、リレーレンズを修正（図にして顕微鏡でそれを指摘）（特殊光学）購入した。

DMDのイルミネーション

そのバイナリの入力を受け取るとマイクロミラーは、正と負の12 °傾斜チップの面に対して相対的に切り替えることができます。回転の軸は、各ミラー（チップの両側に45 °）の対角に沿っている。ミラーの回転の向きは、チップの表面上の1コーナーで金色の三角形で示されている。マイクロミラーの傾斜角度は、着信照明ビームのピッチとazithmusの配置を指示します。照射ビームのピッチは、DMDチップとミラーの回転軸に垂直になるようazithmusのニーズの垂直な軸より24 °である必要があります。正確なビームアライメントには、効率的な運用のための非常に重要です。プロトタイプシステムでは、私たちは設計と加工の不備を補正するために許容される複数の手動のチルト調整を設計した。これはかなりかさばる必要以上なシステムとなりました。光にもたらすための代替、よりコンパクトな配置が（有用と判断した場合、代替設計を示す）ことが可能です。

光分解の実験のためのレーザ光源は、迅速なアンケージングために必要なビームの焦点高い光強度を生成するために必要です。高輝度焦点を絞った光を必要としないoptogenetic実験のために、非コヒーレント光源は十分です。光分解の実験はここで説明では、準連続ダイオードは、周波数がNdVO4レーザー（1 W、355 nm）を倍固体（DPSS）を励起採用。 （光分解用光源の選択肢の詳細については文献2参照）。 DMDシステムを使用するときにレーザーの出力のごく一部が実際に試料に配信されているため、比較的高出力のレーザーは、ここで説明する実験に必要となります。試料に供給される光の量は、レーザビームによって照射された領域内でON / OFFのミラーの数の比に比例します。

レーザ光源が必要な場合は、DMDを照明するための適切な軸に沿って容易に位置し、配向させることができるように、それはマルチモードファイバへのレーザーの出力を起動するのが最善です。光ファイバを通して光を透過することはコヒーレント照明に固有のスペックルパターンを除去する方法、2番目の問題を解決します。繊維は〜40kHzで振動する圧電ファイバストレッチャ（モデル915、カナダの機器＆リサーチ株式会社）に巻き取られる。 （リグのポイントこれらを）繊維のストレッチ顕微鏡は、このように効果的に斑点の影響を排除し、各写真の刺激パルスのミリ秒の持続時間の間にパターンを何度もスペックルの動きに十分です。光ファイバの出力は、UV顕微鏡対物（オリンパスDApo20UV）でコリメートされる。 （これを指す）システムの光学解像度のキャリブレーションは、図に示されています。 3B。として、写真のスポットの位置の関数として電流の流れの振幅で測定された効果的な生理的分解能刺激は、図に示されています。 3C。異なる強度の光刺激に対する電流応答を図に示します。 3D。

システムの操作：

DMDのミラーとの共同登録するCCDの画素

社内のソフトウェアは、イメージングCCDのカメラの特定のピクセルに個々のDMDのミラーの対応を決定する書かれています。このソフトウェア内のグラフィックユーザインタフェース（GUI）は、ユーザーがマウスでタグ付けされたCCD画像上の領域に対応するDMDのミラーを割り当てることができます。このように、写真の刺激のための場所は、単にコンピュータの画面上に表示された画像の上にカーソルを移動し、関心のタグ付き領域をクリックすることでタグを付けることができます。 （樹状アーバの蛍光画像は、コンピュータの画面上に表示されます。生徒は、コンピュータの画面上で画像の上に場所の番号をマークします。）

光配信のためのパターンをプログラミング

オペレータがコンピュータ画面に表示されているパターンは独立した一連の画像として保存されます。各空間パターンのレーザーパルスのタイミングは、データ収集プログラム（pClamp）と統合されているソフトウェアにプログラムされます。 （これを示す）。

DMDパターンにレーザーパルスの調整

データ収集プログラムが開始され、ターゲットのニューロンから電気信号をクランプDMDエレクトロニクス、レーザーのゲート、およびパッチの取得のタイミングを調整します。 （コンピュータにこのシーケンスをシミュレートする）

実験データ：

遠位樹状分岐点間の非線形和

電極を有する樹枝状の統合は、従来、個別の場所で刺激の振幅を変化させるのではなく、一定の強度を維持しながら刺激の面積を拡大することで行われている。位置依存性チャネルの電気発生と募集の彩度に関係する問題は、結果や結論に影響を及ぼすことができる。分散型樹状刺激は容易にDMDベースのシステム（図4A）を使用して実装することができます。入力強度は、光刺激のスポット数を増やすことによって変化させた。我々はその空間的加重が2つの娘枝に到着増加する入力の振幅とますます超えた線形になる分岐点を越え非線形になることができる見ることができます。上記直線性は、主に電位依存性チャネル（図5）にNMDA受容体を媒介とされていません

代表的な結果

図1 DMDのマイクロミラーの動作。 （サイドビュー）個々のミラーに向けられた静電気力は、ミラーが2つの可能な方向、水平から12 °のいずれかに傾けることが原因となる。 ONの位置に入射ビームは、チップの光軸に垂直に沿って指示される。 OFFの位置に入射ビームは48 °の軸外に向けられている。ミラー間の薄い隙間に当たる光は24 °の軸外に向けられている。 （トップビュー）の傾きは、ミラーとチップの側面に対して45 °指向です。

図2。近代的な蛍光顕微鏡の基本的なレイアウト。フィルターキューブは、客観とチューブレンズの間に"無限の空間"内に位置している。カメラにつながると、試料に光をもたらす照明パスが存在する画像のパスがあります。これら2つの光パスのチューブレンズは、通常、設計で、焦点距離が異なります。照明ではなく、イメージング、チューブレンズは、UVスペクトルで動作するように設計されています。

図3。UVベースのDMDシステムのレイアウト。照明は、UVスペクトル内にある場合、それは紫外線のために補正されているチューブレンズを通して状態にする必要があります。イメージングパスのチューブレンズは、UVのために設計されていません。中継システムは、簡単にアクセス共役像面を作成するために必要です。顕微鏡で異なる共役のイメージプレーンは赤い点線の線でマークされています。一つの画像平面内の明るいパターンは他の共役面に投影されています。イメージング中にサンプルの平面上のパターンは、検出器/カメラ上に投影される。照明用DMDで生成されたパターンは、試料上に投影される。

図4。可視光DMD投影システムのためのレイアウト。照明光が目に見える範囲内にある場合、それは撮像光路を介してDMD生成された光パターンを実現することが可能です。これは簡単にcommerciで実装することができますらデュアルカメラポートの添付ファイルと適切なダイクロイックミラー。

図5。システムの横方向の解像度。 （A）蛍光ターゲット上の光学分解能は〜2μmである。 （B）のような樹状突起全体にケージドグルタミン酸の光分解によって測定された効果的な分解能は〜5μmである。上昇距離は、グルタミン酸の拡散と樹状突起の有限幅の組み合わせによるものです。 （C）光分解はシナプス事象の動態を模倣することができます。電圧の家族は、現在の応答が樹状突起に配信光エネルギーの変動に起因するクランプ。

図6。樹状分岐点間の非線形和。 （）分散入力は2つのサービス樹枝に適用されます。それぞれの電圧の応答を以下に示します。 （B）の刺激は、同時に投与されています。測定された応答（赤のトレース）は、2つの個別の回答（グレーのトレース）の算術和とは異なります。

図7。Supralinear総和は、NMDA受容体依存性である。 （）APV、選択的NMDA受容体アンタゴニストは、supralinear総和をブロックします。 （B）刺激強度の関係およびNMDA受容体拮抗薬への感受性がプロットされます。

Discussion

DMDベースの光刺激のアプローチの利点は、ターゲットが比較的大きな面積を占める状況に最も明白である。興味の対象がそのような少数の樹状突起棘のような、非常に小さい場合、シーケンシャルスキャン共焦点、2光子のシステムは、より良いアプローチになる可能性があります。 DMDのアプローチの一つの重要な弱点は、使用可能な光のその非効率的な使用です。利用可能な光の大部分は、必ずしもOFF鏡に向けて使用されていません。

DMDベースのシステムは、最高の可視範囲での動作に適しています。我々は、DMDベースの光刺激システムはoptogenetics実験で採用した重要な影響を与えるだろうと期待しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355