Summary
Denne protokollen beskriver høsting og visualisering av elasmoide skjell av sebrafisk under in vivo regenerering. I tillegg presenteres ex vivo-kulturen av disse skalaene i opptil 7 dager etter høsting.
Abstract
Skjelettsykdommer er ofte komplekse i sin etiologi og påvirker millioner av mennesker over hele verden. På grunn av den aldrende befolkningen er det behov for nye terapier som kan lette byrden på helsevesenet. Siden disse sykdommene er komplekse, er det vanskelig og dyrt å nøyaktig modellere beinpatofysiologi i en laboratorieinnstilling. Utfordringen for feltet er å etablere en kostnadseffektiv, biologisk relevant plattform for modellering av beinsykdom som kan brukes til å teste potensielle terapeutiske forbindelser. En slik plattform bør ideelt sett tillate dynamisk visualisering av celleadferd av beinbyggende osteoblaster og beinnedbrytende osteoklaster som virker i deres mineraliserte matriksmiljø. Sebrafisk brukes i økende grad som modeller på grunn av tilgjengeligheten av genetiske verktøy, inkludert transgene reporterlinjer, og det faktum at noen skjelettvev (inkludert skalaene) forblir gjennomsiktige til voksen alder, noe som tillater dynamiske bildebehandlingsalternativer. Siden sebrafiskskalaer har både osteoblaster og osteoklaster og er svært rikelige, gir de en lett tilgjengelig og rikelig tilgjengelig ressurs av uavhengige beinenheter. Dessuten, når de er fjernet, regenererer voksne sebrafiskskalaer fullstendig, og tilbyr derfor en måte å studere spatiotemporal vekst av mineralisert vev in vivo. Her beskriver vi protokoller for høsting og sporing av regenerering av skalaene. Til slutt presenteres også en protokoll for stabil kultur av skalaer ex vivo i en uke og etter helbredelsesresponsen etter kontrollert skade på den mineraliserte matrisen av skalaen over tid.
Introduction
Ben er et hardt bindevev som utgjør en stor del av skjelettet, som muliggjør bevegelse og fungerer som et mineralreservat i kroppen. For å opprettholde sunt bein, er en utsøkt balanse mellom beindannelse og nedbrytning viktig via den koblede aktiviteten til osteoblaster (som er anabole) og osteoklaster (som resorberer bein). Denne balansen forstyrres av aldring eller hormonell ubalanse, noe som ofte fører til benfraghetssykdommer som osteoporose1. Selv om eksisterende medisiner har blitt godkjent for å målrette benfraghetssykdommer, har mange bivirkninger; Derfor er det behov for ny behandling1. Dermed er det fortsatt behov for rikelig med kilder til biologisk relevant beinvev som kan brukes til å teste potensielle terapeutiske forbindelser.
Tradisjonelt har gnagermodeller og cellekultursystemer blitt brukt til å studere beinbiologi. Imidlertid blir sebrafisk i økende grad en annen modell av valg. Selv om det ikke er et pattedyrsystem, gir sebrafisk visse fordeler for beinforskning i forhold til gnagere; Disse inkluderer deres fecundity og gjennomskinnelighet av larver; Selv i voksen alder forblir noen skjelettvev, inkludert skalaene og finnene, gjennomskinnelige, noe som muliggjør høyoppløselig in vivo-avbildning og økt tilgjengelighet av skjelettmutanter 2,3. Både finner og skalaer av sebrafisk er i stand til fullstendig regenerering etter fjerning. Skjelettregenerering og skadereparasjon av sebrafiskfinner har blitt studert grundig 4,5, mens sebrafiskskalaer er en nyere beinmodell i felt, men gir fordeler for ex vivo kultur6.
Vektene er svært rikelige, med minst 300 skjell på hver fisk som fungerer som et beskyttende dekke for fisken. Hver skala er en liten mineralisert plate bestående av beindannende osteoblaster og beinresorberende osteoklaster av en kollagenrik skjelettmatrise7. Ossifikasjonsprosessen av både sebrafiskskalaer og menneskelige bein krever differensiering av mesenkymale stamceller til osteoblaster for å danne den mineraliserte matrisen. Sebrafiskskjell gir en stor fordel for skjelettforskning med sin sterke regenerative evne som kan brukes til å studere beinregenerering og reparasjon. Til tross for tilstedeværelsen av både osteoblaster og osteoklaster, mangler sebrafiskskalaer osteocytter som er viktige for human beinremodellering og mekanosensasjon; Den overfladiske plasseringen av vektene betyr at de lett kan fjernes med et par tang. Ved fjerning av skalaen oppstår en kaskade av hendelser, og skalaregenerering begynner 8,9. Det finnes ulike farge- og avbildningsalternativer tilgjengelig for å visualisere aktiviteten til osteoblaster og osteoklaster og mineraliseringen av skalaene, som vist i figur 1. I tillegg betyr tilgjengeligheten av mange relevante fluorescerende transgene reporterlinjer av sebrafisk at man kan visualisere celledynamikk under regenerering 7,10,11. Denne prosessen gjør det mulig å få mer forståelse av de novo beindannelse ved å observere den tidlige mønstret av skalaregenerering på flanken av fisken for å studere morfologi, cellulær aktivitet og genetiske profiler av disse regenererte skalaene. Biologien til skaladannelse og regenerering har blitt godt karakterisert. Det er viktig at vekter kan vise en god prediktiv evne for terapeutisk relevante forbindelser12 og behandling av fisk med glukokortikoider fører til en skala som regenererer for å vise osteoporotiske fenotyper13. Transkriptomet av de regenererende skalaene viser at gener aktivert i skalaregenerering er beriket for de som er knyttet til menneskelige skjelettsykdommer, noe som ytterligere demonstrerer deres relevans som et modellsystem 6,14.
Til slutt kan disse skalaene dyrkes ex vivo i opptil 7 dager. Sammenlignet med cellelinjekulturer som vanligvis består av en enkelt celletype, gir ex vivo skalakultur in vitro benstudiemuligheter i sitt naturlige miljø som inneholder både osteoblaster og osteoklaster med sin naturlige ekstracellulære matrise 8,12,15,16.
Skalakultur lar oss også utføre narkotikascreening for nye osteoanabole mål. Overfloden av skjell på fisken betyr at man kan fylle minst to plater av 96-brønnsplaten fra bare en enkelt fisk, noe som muliggjør sammensatt screening i et flerbrønnsformat der hver enkelt brønn inneholder en skala sammen med sin naturlige nisje av celler. I tillegg, siden skalaene er tynne, er legemiddelabsorpsjonen forutsigbar12. Oppsummert har de elasmoide skalaene til sebrafisk stort potensial i skjelettforskning og kan hjelpe oss med å få mer innsikt i cellehendelsene under beindannelse og reparasjon. Her beskriver vi protokoller for høsting av skjell for å følge regenerering in vivo og kultur av skalaene ex vivo.
Protocol
University Animal Scientific Unit (ASU) er ansvarlig for sebrafiskpleie under veiledning av retningslinjer for sebrafiskhold. Alle prosedyrer, inkludert kalkhøsting, farging av levende bein og levende bildebehandling, ble godkjent og utført under en UK Home Office Project License (PP4700996). For dette manuskriptet ble unge voksne transgene sebrafisk fra sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46] linjen brukt17. Fisken inkluderte både hanner og hunner på 4 måneder.
1. Regenerering i in vivo-skala
- Før du starter skalaregenereringseksperimentet, overfører du sebrafisk fra hovedtankene til individuelle tanker (se materialtabell) og går tilbake til disse individuelle tankene etter avbildning gjennom hele forsøket, som vist i figur 2. Dette er for å sikre at alle regenererende skalaer er de som høstes for eksperimentet; Gruppeoppstalling kan føre til sporadisk tap av skjell på grunn av skader forårsaket av annen fisk.
MERK: Fisken er individuelt plassert for å unngå slåssing og påfølgende skjelltap mellom fisk. - Registrer informasjon for hver forsøksfisk (dvs. genotype, alder og kjønn) i henhold til forsøksdesignet. Bruk et kamera (smarttelefonkameraer fungerer fint) for å ta et bilde av hver fisk ved siden av en linjal for å registrere fiskens størrelse/lengde og helsetilstand.
- På forsøksdagen bedøves sebrafisken med 0,05 % (v/v) trikain metansulfonat (MS222, se materialfortegnelse) ved nedsenking, og legg den deretter på en petriskål med fuktig vev for å unngå bevegelse av fisken under avbildning eller høsting.
- Plasser fisken på siden (vanligvis brukes venstre flanke her for konsistens). Utfør flankeavbildning ved hjelp av et stereomikroskop med passende forstørrelse (vanligvis ble 2x, 4x og / eller 6.3x og 8x brukt for denne studien for å fange både det generelle regenereringsområdet og det zoomede området for detaljert observasjon).
MERK: Tidspunktene for flankeavbildning avhenger av det eksperimentelle formålet og valget av transgene reportere. For eksempel, for å spore osteoblaster under skalaregenerering, er de foreslåtte tidspunktene dag 0 (ontogenetisk), 2 dager etter høsting (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. For å redusere effekter fra gjentatt anestesi, hold bildebehandlingstidspunktene til de færreste som kreves for forsøket. - Harvest skalaer med fin pinsett og tang under stereomikroskopet. Overfør de høstede vektene til oppsamlingsrør for kalkfarging senere.
MERK: Maksimalt antall vekter som kan høstes vil avhenge av lokale etiske godkjenninger som er på plass. Vi høster vanligvis rundt 20 til 30 skjell og samler dem inn i individuelle oppsamlingsrør for kalkfarging senere, for eksempel ALP, von Kossa14. - Samle vektene i enten et 1,5 ml eller 2 ml oppsamlingsrør. Dette avhenger av fargeteknikken som brukes.
- For både ALP- og von Kossa-farging, overfør skalaene til oppsamlingsrør som inneholder avionisert vann, mens for TRAP-farging eller immunhistokjemi, overfør skalaene til oppsamlingsrør som inneholder 4% PFA (festeløsning).
- Valgfritt: Før du overfører vekter til rør, må du ta bilder av individuelle høstede vekter om nødvendig.
MERK: Foreslåtte tidspunkter for innhøsting er dag 0 (ontogenetisk), dag 10 og dag 21 (regenererte skalaer).
2. Farging av levende bein
MERK: Levende skjelettfarging kan utføres enten når eksperimentell fisk ikke er transgen for fluorescerende reportere eller når du bærer ensfargede transgene reportere. Levende farging kan brukes til å utfylle transgenikk; for eksempel kan man bruke en osteoblastreporter som sp7 / osx i en farge (f.eks. GFP), og deretter flekke bein i rødt med Alizarin rødt (AR). AR og calceingrønn kan brukes til samme fisk sammen; I dette scenariet brukes AR til å merke originalt eller ontogenetisk bein ved å binde seg til den mineraliserte matrisen av alderen bein, og kalcein binder seg til kalsiumioner som er rikelig i nydannet bein. For eksempel, når du farger en ontogenetisk skala, kan AR visualiseres, men kalceingrønn kan være fraværende eller minimal siden ontogenetiske skalaer har lave nivåer av ny beindannelse.
- Utfør live Alizarin Red (AR) farging.
- Forbered en flaske med 2x AR-fargeløsning ved å blande 0,5 % (w/v) Alizarin-oppløsning (10 ml) med 10 ml 1 M stamHEPES (endelig konsentrasjon, 10 mM) (se materialtabell).
- Fyll på opptil 1 l med 1x Danieau-løsning (se materialfortegnelse). Løsningen må holdes i mørk eller innpakket med folie.
- På dagen for forsøket, ta med 500 ml 2x AR-løsning til sebrafiskanlegget, og tilsett 500 ml systemvann (fra akvariet) for å lage 1x fungerende AR-løsning.
- Overfør fisk fra tankene til en 1x fungerende AR-fargeløsning og la stå i 15-20 min. Vask av overflødig flekk på fisken med 15 min "vask" i systemvannet.
- Utfør live Calcein Green farging.
- Forbered en flaske 2x Calcein Green fargeløsning ved å tilsette 45 mg Calceinpulver i 900 ml 1x Danieau-løsning (se materialfortegnelse). Bruk en magnetisk omrører for å la pulveret oppløses helt.
- Juster pH til 8. Dette er 2x lager Calcein Green løsning. Oppløsningen kan oppbevares i mørket/innpakket med folie i opptil 1 måned.
- På dagen for forsøket, ta med 500 ml 2x Calcein Green-løsning til sebrafiskanlegget, og tilsett 500 ml systemvann for å lage 1x fungerende Calcein Green-løsning. Det anbefales å bruke nylaget Calcein-fargeløsning.
- Overfør fisk fra tankene til 1x fungerende Calcein Green fargeløsning og la stå i 1-2 timer. Avhengig av fiskens størrelse kan det være nødvendig med lengre fargetid.
- Vask av overflødig flekk på fisken med 15 min "vask" i systemvannet.
MERK: Se for deg Calcein Green-farget fisk så snart som mulig, da denne flekken vil falme om noen timer.
3. Alkalisk fosfatase (ALP) farging på skalaer etter høsting
- Forbered ALP-fargeløsningen ved å blande 100 mM Tris (pH 9,5 med HCl) med 100 mM NaCl og 50 mM MgCl2.
- Bruk kommersielt tilgjengelig NBT/BCIP lagerløsning (se Materialfortegnelse).
- Overfør vektene til rør som inneholder avionisert vann.
- Skyll vektene i ALP-fargeløsningen i 5 min.
- I mellomtiden forbereder du en fungerende fargeløsning ved å tilsette 200 μL av NBT / BCIP-løsningen til 10 ml ALP-fargebuffer. Dette må tilberedes på tidspunktet for farging.
- Beis vektene med den fungerende ALP-fargeløsningen i 15 minutter.
- Stopp reaksjonen ved å skylle skalaene med avionisert vann.
4. Von KOSSA farging på skalaer etter høsting
- Tilbered 5% (w / v) sølvnitratoppløsning.
- Lag 5 % (w/v) natriumtiosulfatoppløsning.
- Overfør høstede skalaer til rør som inneholder avionisert vann.
- Inkuber skalaene i sølvnitratoppløsningen i 40 minutter under sterkt lys.
MERK: Bruk PPE (personlig verneutstyr) da sølvnitrat etterlater en flekk som er vanskelig å fjerne. - Vask vektene to ganger i 5 min med avionisert vann.
MERK: Sølvnitratavfall må samles opp og destrueres i henhold til lokale retningslinjer. - Inkuber skalaene i natriumtiosulfat i 5 minutter.
- Vask vektene to ganger i 5 min med avionisert vann.
5. Kolorimetrisk TRAP-farging
MERK: For detaljert prosedyre, se tidligere publisert arbeid18.
- Forbered fargeløsningene.
- Klargjør 10 mg / ml Naphthol AS-MX fosfatoppløsning.
- Vei 5 mg Naphthol AS-MX fosfat (se Materialfortegnelse).
- I avtrekkshetten, klargjør et rør med 0,5 ml N, N'-dimetylformamid og oppløs 5 mg Naphthol AS-MX-fosfat i 0,5 ml N, N'-dimetylformamid for å lage en stamløsning på 10 mg / ml Naphthol AS-MX-fosfat (rist forsiktig).
- Tilbered 1,6 ml Fast Red Violet LB stamløsning i 50 ml natriumtartrat.
- Forbered 50 ml 0,1 M natriumacetat ved pH 5 (tilsett 0,41015 g natriumacetat i 50 ml avionisert vann og juster pH til 5 med 100% eddiksyre).
- Løs opp 0,575 g natrium L-tartrat dibasisk dihydrat (se materialfortegnelse) i 50 ml 0,1 M natriumacetattbuffer (pH = 5).
- Tilsett 30 mg raskt rødt fiolett LB-salt.
- Forbered PBS-0.1Tx (oppløs 500 μL Triton-X i 500 ml PBS).
- Forbered PBS-0.1Tw (oppløs 500 μL Tween-20 i 500 ml PBS).
- Klargjør 10 mg / ml Naphthol AS-MX fosfatoppløsning.
- Forbered en fungerende TRAP-løsning.
- Bland begge stamoppløsningene sammen i avtrekkshetten (0,5 ml 10 mg/ml Naphthol AS-MX fosfatoppløsning og 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB stamløsning i 50 mM natriumtartrat).
MERK: Arbeidsløsningen kan nå brukes utenfor avtrekkshetten. Den kan oppbevares i kjøleskapet (innpakket i folie) i opptil en måned. Oppbevares i separate beholdere fra antistoffer eller andre reagenser som er følsomme for fikseringsmidler. Hold deg unna lys så mye som mulig. - Valgfritt: klargjør blekeløsning (på etterfaste prøver som ble TRAP-farget) i PBS og 0,1 % Tween-20 (PBS-0,1 % Tw).
- Tilbered en endelig konsentrasjonsblanding av 0,5 % kaliumhydroksid (KOH) (fra 10 % stamløsning (w/v)) og 3 % hydrogenperoksid (H2O2) (33 % stamoppløsning, oppbevart i kjøleskapet).
- Bland begge stamoppløsningene sammen i avtrekkshetten (0,5 ml 10 mg/ml Naphthol AS-MX fosfatoppløsning og 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB stamløsning i 50 mM natriumtartrat).
- Utfør prøvefiksering.
- Fest vekter i 4 % PFA i 1x PBS som gynger eller roterer i 40 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern 4% PFA og vask med PBS-0.1Tx minst 3 ganger i 5 minutter hver vask.
- Gå direkte til TRAP-farging (den beste tilnærmingen) eller oppbevar i PBS-0.1 Tx over natten.
- Utfør TRAP-farging av skalaene.
- Fjern PBS-0.1 Tx-løsningen og tilsett den kolorimetriske TRAP-arbeidsløsningen (trinn 5.2.1) for å dekke prøvene fullstendig (dvs. 1 ml i et mikrosentrifugerør på 1,5 ml).
- Inkubere i 1-2 t på RT, rocking i mørket.
- Fjern fargeløsningen og vask minst 3 ganger med PBS-0,1 Tw i 5 min hver vask.
- Etterfiks prøvene i 4% PFA i 30 min ved RT, og gyng forsiktig i mørket.
- Fjern PFA-oppløsningen ved å vaske 3 ganger med PBS-0,1 Tw i 5 minutter hvert trinn.
MERK: Prøvene kan lagres (i lagringsløsninger/montert på mikroskoplysbilder) ved 4 °C i mørket på ubestemt tid.
6. Montering av fargede vekter
- Forbered monteringsmediet ved å tilsette 2,4 g Mowiol 4-88 krystaller til 6 g glyserol (se materialtabellen). Alle foretrukne monteringsmedier kan brukes.
- Tilsett 6 ml avionisert vann og la det stå på en magnetisk omrører i en time.
- Tilsett 12 ml 0,2 M Tris (pH 8,5) og inkuber ved ca. 53 °C til Mowiol-krystallene er fullstendig oppløst.
- Klargjør løsningen ved å sentrifugere ved 2000 x g i 20 minutter ved romtemperatur.
- Overfør løsningen til en lagerbeholder. Monteringsmediet kan oppbevares i fryseren i ca. 12 måneder. Den tinte Mowiol-løsningen er stabil i opptil 1 måned.
- Monter skalaene på et mikroskopglass ved montering av mediet, dekk dem med et deksel og se dem under et mikroskop.
7. Ex vivo kultur av skalaer
MERK: Dette trinnet er tilpasset fra de Vrieze et al.12.
- Før høsting av skalaene i et sterilt miljø, lag det osteogene mediet og kulturplaten.
- Osteogent dyrkningsmedium (OCM): I et sterilt sentrifugerør lager du 15 ml OCM i standard cellekulturmedium (høy glukose, ingen glutamin, ingen fenolrød) ved de endelige konsentrasjonene av 1% leggserum, 1% (200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl), 1% antibiotika / antimykotisk løsning (100x) løsning, 4 mM CaCl2, 10 mM β-glycerofosfat, 1 nM natriumpyruvat og 1 % amfotericin B (valgfritt) (se materialtabellen).
- Hell OCM i et sterilt reagensreservoar, og tilsett 100 μL til hver brønn på 96-brønnplaten ved hjelp av en flerkanalspipett.
- Forsegl platen med 96 brønner og oppbevar platen. OCM kan oppbevares i kjøleskap i en kort periode (over natten til 1 uke) og oppbevares ved 28 °C før bruk.
- Utfør kalkhøsting og PBS-vask.
- Høst skjellene med steril pinsett/tang og legg dem i en petriskål som inneholder en steril PBS-løsning.
- Utfør plateoppsett.
- Overfør hver skala fra petriskålen til hver brønn på 96-brønnsplaten med 100 μL OCM (oppvarmet til 28 °C) ved hjelp av steril tang.
- Når alle skalaene er overført til platen, ta platen under et stereomikroskop. Bruk en fin, steril pipettespiss til å forsiktig flytte hver vekt til bunnen av brønnen og holde dem borte fra siden av brønnene for å unngå lysrefleksjon under bildeopptak.
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis du utfører live bildebehandling. - Overfør platen forsiktig til inkubatoren eller Live Imaging System (LIS, se Materialfortegnelse) (satt til 28 °C, 5% CO2), hvor skalaene kan dyrkes i opptil 7 dager.
- Oppdater OCM (valgfritt).
- Varm OCM som ble oppbevart i kjøleskapet til 28 °C.
- Overfør platen med 96 brønner forsiktig til et sterilt miljø. Bruk en flerkanals pipette til å aspirere 50 μL fra hver brønn. For dette, trykk spissene mot veggene og ikke dypp dem før bunnen for å unngå å aspirere / flytte / fjerne skalaene. Bruk nye tips for forskjellige forhold.
- Hell OCM i et sterilt reagensreservoar, og tilsett 60 μL OCM ved hjelp av flerkanalspipetten til hver brønn.
- Plasser platen under stereomikroskopet og se etter feilplasserte skalaer (for nær veggene, flytende eller i vertikal stilling i mediet). Plasser dem på nytt med en fin, steril pipettespiss om nødvendig.
- Legg platen tilbake i inkubatoren/LIS.
MERK: Ikke oppdater mediet hvis eksperimentet involverer sirkadisk rytme (CR), da serumsjokk kan påvirke den biologiske klokken. Merk hvis du studerer CR bemerker at lysforholdene også tilbakestiller klokken.
- Utfør farging og avbildning etter kulturskala (valgfritt).
- Etter 6 dager med kultur, fikse dem og direkte dem for passende farging som von Kossa og ALP nevnt ovenfor.
- Alternativt, hvis forsøksfisken har et fluorescerende merke, sett platen inn i et levende bildesystem.
MERK: Hvis du bruker et levende bildesystem, må du sørge for at det er satt til en temperatur og CO2 -nivå som passer for eksperimentet. I denne studien ble det vanligvis brukt 28 °C og 5 % CO2 . Velg passende filtre og avbildningstidspunkter (her ble det brukt et intervall på 2 eller 4 timer, som er tilstrekkelig til å følge osteoblastmigrasjon) og mål for lav forstørrelse (dvs. 4x) for å sikre jevn avbildning av hele brønnene. Dette skyldes at vektene har en tendens til å bevege seg inne i brønnene, spesielt under medieendringer.
Representative Results
Regenerering av vekt
Skalaregenerering kan spores med et standard fluorescerende stereomikroskop ved å avbilde flanken til sebrafisken. Figur 3A viser endringer i sp7/osx-uttrykk av skjellene under skalaregenerering hos en 4 måneder gammel sebrafisk. Tidspunkter for flankeavbildning vist i figur 3A er ontogenetiske (opprinnelige skjell, før høsting), dag 2, dag 4 og dag 10 etter høsting. Vi bruker vanligvis osx (også kjent som osterix eller sp7) transgene linjer (enten som en GFP (Tg (Ola.sp7: NLS-eGFP) 19 eller mCherry Tg (osterix: mCherry-NTR) pd46) 17 for å spore endringer i skjelettsystemet som det merker beinproduserende osteoblaster. Tidlig mønster av nydannede skalaer kan ses på 2 dager med regenerering. Dette tidlige mønsteret av skalaregenerering er forstyrret i noen tilfeller, spesielt i skjelettmutanter. Ved å spore fremdriften av regenerering, kan man analysere kapasiteten og hastigheten på regenerering. På høstingsdagen kan individuell avbildning av høstede skjell utføres etter flankeavbildning med samme stereomikroskop, som vist i figur 3B. Regenererte skalaer har mye høyere osx-uttrykk sammenlignet med dag 0 ontogenetiske skalaer fordi osteoblaster er nødvendige for den nye beindannelsen.
Ex vivo skala kultur
Selv om man kan studere de novo beindannelsesprosessen ved å spore regenereringsprosessen på flanken av fisken, kan vi også bruke denne modellen til å studere reparasjon og helbredelse av skjelettskader med ex vivo skalakultur ved å gjøre en skade på vektene med en skalpell. Ved hjelp av et live bildebehandlingssystem kan reparasjonen spores i sanntid. Figur 4 viser et representativt resultat av en skadehelingsrespons på ontogenetisk skala på 3 dager inn i en kultur der osteoblastene er merket med osx: mCherry. Skadestedet vist ved innfeltene i begynnelsen av kulturen viser et tydelig gap mellom osteoblaster og skalacirkuli (figur 4A). Man kan overvåke migrasjonen av osteoblaster mot skadestedet med time-lapse-avbildning. Etter 3 dager i kultur reduseres gapets bredde, og uttrykket avosx kan ses mellom gapet og de nydannede skalacirkuliene (figur 4B). I tillegg er morfologien når det gjelder formen på osteoblastene, mer sirkulær i begynnelsen av kulturen og etter 3 dager er den mer langstrakt. Denne endringen i osteoblastutseende skyldes sannsynligvis å være i kultur og ikke i sitt naturlige miljø (festet til fisken).
Figur 1: Eksempler på bildealternativer for vekter. Osteoblaster kan visualiseres med osx / sp7 transgene reporterlinjer (enten i GFP eller mCherry). ALP-farging kan brukes til å vise osteoblastaktiviteten. TRAP-farging kan vise aktiviteten til osteoklaster. Alizarin rød (AR) og Calcein grønn er begge fargestoffer som kan brukes i levende fisk; AR merker mineralisering og Calcein etiketter nydannet bein. Omfanget av mineralisering kan også vises med von Kossa-farging. Skala barer: 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av et skalaregenereringseksperiment. Generisk skjema over et skalaregenereringsforsøk som viser at fisken er delt inn i individuelle kar før forsøket. Lengde, kjønn og helse registreres. Skjemaet viser også det foreslåtte området på flanken av fisken for å høste skjell og foreslåtte bildetidspunkter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av osterix-uttrykk (for å visualisere osteoblaster) under skalaregenerering tatt fra en 4 måneder gammel sebrafisk. (A) Flankebildene tatt på dag 0 (pre-harvest, ontogenetiske skalaer), 2 dph (dager etter høsting) dag 2, 4 dph og 10 dph for sporing av endringer i osx-uttrykk . Vektstenger: 1 mm. (B) Representative bilder av en ontogenetisk skala og en skala ved 10 dph tatt fra samme fisk som i panel (A). Legg merke til de økte nivåene av osx-uttrykk som vist i magenta i midten av regenereringsskalaene. Skala barer: 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av skjelettskadereparasjonsrespons på en ontogenetisk skala fanget fra en 4 måneder gammel sebrafisk ved hjelp av et levende bildesystem. (A) Ontogenetiske skjell med en skade gjort av skalpell samme dag som høsting (tidspunkt 0/dag0) av kulturen. (B) Den samme skalaen vises 3 dager etter skaden. Innfelt viser skadeområdet. Skala barer: 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
De elasmoide skalaene til sebrafisk, som en ny modell for skjelettforskning, har stort potensial for å hjelpe vår forståelse av beinvedlikehold, regenerering og skadereparasjon. Overfloden av skjell på fisk muliggjør screening med middels til høy gjennomstrømning, samtidig som antall dyr som brukes reduseres og intraindividuell variasjon begrenses. Her presenteres protokoller for skalaregenerering og ex vivo skalakultur for å studere regenerering og reparasjon.
Noen kritiske trinn må vurderes når du følger denne protokollen. Forsiktig fjerning av skalaene er viktig, spesielt når du bruker en transgen reporterlinje for å begrense forstyrrelsen i cellepopulasjonen forårsaket av høsting. Hvis man skal sammenligne ontogenetiske skjell, må du sørge for at regionen ikke inneholder spontant regenererende skjell (som naturlig kan oppstå gjennom fiskens levetid). Sørg for at miljøet og utstyret er sterilt for ex vivo kultur for å oppnå optimal celleoverlevelse og minimal infeksjon i kultur.
Avhengig av det spesifikke forskningsspørsmålet kan tilpasninger gjøres til protokollen, for eksempel å kombinere forskjellige transgene reporterlinjer for å visualisere andre celletyper av genuttrykksprofiler under regenerering og reparasjon11,14.
Det brede spekteret av farging man kan utføre på skalaene betyr at for hver testet forbindelse eller tilstand kan man se på dens effekter på beinet fra forskjellige vinkler; mens sp7 / osx-reportere kan vise osteoblasttall, kan ALP-farging visualisere osteoblastaktivitet, TRAP-farging kan visualisere osteoklastaktivitet, Calcein-grønn levende farging kan merke nydannende bein og Alizarin-rød eller von Kossa-farging kan vise skalamineralisering. Luciferaseaktivitet for å kvantifisere osteoblaster kan også brukes12. Kombinert med disse fargeteknikkene kan man lære det relative bidraget fra osteoblaster og osteoklaster til en gitt beineffekt. Vekter mangler osteocytter, som er utbredt i pattedyrbein og er de viktigste driverne for benmekanosensorisk respons; Skalareparasjon og regenerering i denne modellen drives primært av osteoblaster med påfølgende remodellering av osteoklaster 8,9. Det er viktig å merke seg at det er variasjon mellom individer og aldersgrupper20. For å minimere dette må slaktearealet være konstant, da forskjellige lokaliteter kan gi opphav til ulik skjellmorfologi, og det brukes fisk fra samme søskengrupper slik at alder og størrelse er konsistent. Men fordi flere skjell kan slaktes per fisk, kan man kjøre flere eksperimenter med færre fisk, noe som reduserer intraindividuell variasjon.
Oppsummert viser disse protokollene eksperimentelle teknikker som kan brukes på ontogenetiske og regenererende skalaer. Avslutningsvis viser elasmoide skalaer stort potensial som en skjelettmodell for å hjelpe forståelsen av beindannelse og reparasjon; og vil bidra til å redusere dyrebruk for høy gjennomstrømning osteoanabole sammensatte screening.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Mathew Green fra Animal Service Unit for fiskehold og Katy Jepson fra Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB og QT ble finansiert av Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB og QT Intermediate Fellowship 22044), RR ble finansiert av (NHMRC APP1158758). Dette arbeidet ble også støttet av BBSRC-stipendet (BB/T001984/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
| 12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
| 15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
| Alizarin red | Sigma | A5533 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
| Calcein powder | Sigma | C0875 | |
| Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
| Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Cover slips | VWR | 631-0146 | |
| Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
| Danieau | Sigma | ||
| DMEM | Life Technologies | 31053 | |
| Falcon tubes | Corning | 430828 | |
| Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
| Glycerol | Sigma | 81381 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
| IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
| Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
| L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
| Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
| Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| MQ water | X | ||
| N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
| NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
| NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
| Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
| Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
| Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
| Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
| Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
| Tris | Sigma | 252859 | |
| Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
| Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
| Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L - 28 cm x 11 cm x 17 cm |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L - 28 cm x 7 cm x 11 cm |
References
- Tobias, J. H., et al. Opportunities and challenges in functional genomics research in osteoporosis: report from a workshop held by the causes working group of the osteoporosis and bone research academy of the Royal Osteoporosis Society on October 5th 2020,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2021).
- Busse, B., Galloway, J. L., Gray, R. S., Harris, M. P., Kwon, R. Y. Zebrafish: An emerging model for orthopedic research. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 925-936 (2020).
- Dietrich, K., et al. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 436-458 (2021).
- McGowan, L. M., Kague, E., Vorster, A., Newham, E., Cross, S., Hammond, C. L. Wnt16 elicits a protective effect against fractures and supports bone repair in zebrafish. JBMR Plus. 5 (3), 10461 (2021).
- Sehring, I., Weidinger, G. Zebrafish fin: Complex molecular interactions and cellular mechanisms guiding regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (7), 040758 (2022).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10 (6), (2019).
- Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, 37001 (2018).
- Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Developmental Biology. 437 (2), 105-119 (2018).
- Metz, J. R., de Vrieze, E., Lock, E. J., Schulten, I. E., Flik, G. Elasmoid scales of fishes as model in biomedical bone research. Journal of Applied Ichthyology. 28 (3), 382-387 (2012).
- Cox, B. D., De Simone, A., Tornini, V. A., Singh, S. P., Di Talia, S., Poss, K. D. In toto imaging of dynamic osteoblast behaviors in regenerating skeletal bone. Current Biology. 28 (24), 3937-3947 (2018).
- Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2020).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex-vivo sp7: Luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
- De Vrieze, E., Moren, M., Metz, J. R., Flik, G., Lie, K. K. Arachidonic acid enhances turnover of the dermal skeleton: Studies on zebrafish scales. PLoS One. 9 (2), 89347 (2014).
- Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biology. 20 (1), 21 (2022).
- Bergen, D. J. M., et al. High bone mass disorders: New insights from connecting the clinic and the bench. Journal of Bone and Mineral Research. , John Wiley and Sons Inc. (2022).
- Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell and Tissue Research. 350 (1), 69-75 (2012).
- Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Developmental Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
- Ethiraj, L. P., Fong, E. L. S., Liu, R., Chan, M., Winkler, C., Carney, T. J. Colorimetric and fluorescent TRAP assays for visualising and quantifying fish osteoclast activity. European Journal of Histochemistry. 66 (2), 3369 (2022).
- DeLaurier, A., et al. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505 (2010).
- Carnovali, M., Banfi, G., Mariotti, M. Age-dependent modulation of bone metabolism in zebrafish scales as new model of male osteoporosis in lower vertebrates. Geroscience. 43 (2), 927-940 (2021).
