Summary
库仑呼吸法是测量小生物代谢率的理想方法。在本研究中，当适用于黑腹果蝇时，测得的 O2 消耗量在先前研究报告的野生型黑腹果蝇的范围内。体型较小且活性较低的 CASK 突变体的每只苍蝇消耗 O2 显著低于野生型。
Abstract
库仑显微呼吸法是一种简单、廉价的方法，用于测量小生物体的 O2 消耗量，同时保持稳定的环境。库仑显微呼吸计由一个密闭室组成，其中消耗 O 2，并通过吸收介质去除生物体产生的 CO2。 由此产生的压力降低会触发电解 O 2 的产生，并且通过记录用于产生 O2 的电荷量来测量产生的 O2 的量。在本研究中，该方法已适用于在小组中测试的黑腹果蝇，该仪器的灵敏度和环境条件经过优化以实现高稳定性。该装置中野生型苍蝇消耗的O2量与先前研究测量的量一致。CASK突变体的质量特异性O2消耗量较小且已知活性较低，与同源对照没有区别。然而，小尺寸的CASK突变体导致每只苍蝇的O2消耗量显着减少。因此，显微呼吸计能够测量黑腹果蝇的 O2 消耗量，可以区分基因型之间的适度差异，并增加了测量代谢率的多功能工具。
Introduction
测量代谢率的能力对于全面了解生物体的环境背景至关重要。例如，有必要测量代谢率，以了解其在寿命中的作用 1、饮食在新陈代谢中的作用2 或缺氧应激的阈值3。
测量代谢率有两种一般方法4.直接量热法通过测量产热法直接测量能量消耗。间接量热法通过其他方式测量能量产生，通常通过呼吸测量 O 2 消耗量 （VO2）、CO2 产生量或两者兼而有之。虽然直接量热法已应用于小型变温动物，包括黑腹果蝇 5，但呼吸测定法在技术上更简单且更常用。
几种形式的呼吸测量法已成功用于测量野生型和突变型黑腹果蝇的代谢率，并深入了解温度6、社会环境 3、饮食 3、7 和神经发育障碍的代谢影响8。它们分为两类，它们在成本和复杂性方面差异很大。测压法是最简单和最便宜的 9,10，其中将苍蝇放入一个密封室中，该室含有 CO2 吸收剂，并通过细毛细管连接到储液器。随着 O 2 的消耗和 CO2 的吸收，腔室中的压力降低，流体被吸入毛细管。因此，毛细管的充满液体的体积与 VO2 成正比。更精细的版本，补偿了毛细血管中液体施加的力，也被用于黑腹果蝇1。测压法的优点是简单且价格低廉，但由于它对压力敏感，因此需要恒定的环境条件。此外，由于消耗的 O 2 没有被替换，因此 O2 （PO2） 的分压在腔室内逐渐降低。
使用气体分析的呼吸测定法也经常用于黑腹果蝇。在这种情况下，定期从含有苍蝇的密封室中对气体进行采样，并发送到红外分析仪2,6,11。这种类型的设备具有以下优点：它可以在市场上买到，对环境条件不太敏感，并且在采样过程中刷新气体，使PO2保持稳定。然而，这些设备可能既昂贵又操作复杂。
最近开发的库仑显微呼吸计12 为现有系统提供了一种廉价、灵敏且稳定的替代方案。在实践中，将生物体放入密闭室中，在那里它消耗 O 2，呼出的 CO2 被吸收材料去除，导致室压净降低。当内部压力降低到预设阈值（ON阈值）时，电流通过电解O2发生器，将压力返回到第二个阈值（OFF阈值），从而停止电解。O 2 发生器上的电荷转移与重新加压腔室所需的 O 2 量成正比，因此可用于测量生物体消耗的 O 2 4。该方法灵敏度高，可精确测量 V O2，定期更换 O2 可将 PO2 维持在几乎恒定的水平数小时或数天。
本研究中使用的库仑显微呼吸计采用多模态（压力、温度和湿度）电子传感器。该传感器由微控制器操作，该微控制器可检测压力的微小变化，并在达到低压阈值12 时激活 O2 生成。该装置由现成的零件组装而成，可用于各种腔室和实验环境，并已成功用于检查体重和温度对甲虫Tenebrio molitor的影响。在本研究中，微量呼吸计已用于测量黑腹果蝇的 O2 消耗量，其质量约为 T. molitor 的 1%。通过降低激活 O2 生成的阈值来提高设备的灵敏度，并通过在温控水浴中进行实验并将腔室内的湿度保持在 100% 或接近 100% 来增强环境稳定性。
CASK（钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶）蛋白是膜相关鸟苷酸激酶 （MAGUK） 家族的一部分，是不同多蛋白复合物中的分子支架，CASK 中的突变与人类和黑腹果蝇的神经发育障碍有关 13,14。与同源对照组相比，活的黑腹果蝇突变体 CASKΔ18 会破坏多巴胺能神经元的活性 15，并将活性水平降低 50% 以上14,16。由于 CASK 突变体的活性水平降低以及儿茶酚胺在调节代谢中的作用17，我们假设与对照组相比，它们的标准代谢率以及 O2 消耗量将显着降低。
在 CASKΔ18 及其野生型同源物 w（ex33） 中测量 O2 消耗量。将成组的苍蝇放入呼吸测量室，测量 O 2 消耗量，计算 O2 消耗量，并在质量特异性和每只苍蝇的基础上表示。该装置记录了野生型果蝇中的VO2，这与以前的研究一致，并且可以区分野生型和CASK突变果蝇的每只苍蝇O2消耗量。
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Protocol
1. 苍蝇饲养和收集
- 将苍蝇保持在25°C的狭窄小瓶中，装有标准 果蝇 食物。
注：每种基因型的样本量应至少包括九个重复，每个重复由一个包含15-25只苍蝇的呼吸计室组成，如下所述。 - 每 2-3 天转移一次苍蝇。
- 用 CO2 麻醉苍蝇，收集每种基因型的 15-25 只雄性，并将每组放入新鲜的、未发酵的食品瓶中。
注：男性用于减少由于生殖状况引起的变异性。该方法适用于男女。 - 让苍蝇在25°C下恢复至少24小时。
注意：在实验时，苍蝇应该是1-4天大。可以设置步骤1.3中描述的收集频率以缩小苍蝇的年龄范围。
2. 呼吸计室的设置和组装
- 打开水浴并将其设置为实验所需的温度。
注：以下实验在25°C下使用50mL舒伦克管作为腔室进行。组件的组装如图 1A、1B 和 1C 所示。 - 通过将70%乙醇喷洒在实验室擦拭布上（而不是直接喷洒在接头上）并擦去传感器插头上的灰尘和旧油脂，彻底清洁腔室和传感器塞的毛玻璃接头（图1A）。用新鲜的实验室湿巾擦去乙醇。
- 将浸泡在纯净水中的 1 厘米棉卷放入腔室底部以稳定湿度。
- 加入足够的水（~0.5 mL），在棉卷底部形成一个小水池。
- 擦去溅到腔室接缝上的任何水。
- 使用漏斗将苍蝇转移到标记的聚丙烯管中。
- 用棉卷塞住管子。
注：试管由5mL聚丙烯试管组成，长度修剪至5.5cm，并用热刀穿孔，以便与实验室自由交换空气。众所周知，CO2 麻醉会导致代谢异常，因此苍蝇在没有麻醉的情况下转移，这需要更加小心以避免失去苍蝇。
- 用棉卷塞住管子。
- 将一根带有苍蝇的通风管添加到每个呼吸计室（在湿棉布上）。
- 填充碱石灰盒（每管 4-5 个颗粒）并将它们放在腔室内装有苍蝇的管子顶部。
注：碱石灰滤芯由 800 μL 离心管组成，用电钻打孔 4-5 次。 - 在排气孔水平以下用饱和硫酸铜 （CuSO4） 溶液填充 O2 发生器
注意： O2 发生器由螺旋盖离心管组成，螺纹下方钻有 4 个孔。铂 （Pt） 和铜 （Cu） 电极焊接到两针连接器上，插入盖子上钻孔的孔中，并用环氧树脂固定。CuSO4 的电解产生实验生物体消耗的 O2 。CuSO4 对无脊椎动物有毒，避免溢出或泄漏并立即清理。 - 将填充的 O2 发生器连接到传感器插头上的两针连接器。
注意： 铜阴极必须与控制器的负输出连接，铂阳极必须连接到正极。接反会导致实验失败。 - 将两小块透明硅脂放在传感器插头毛玻璃接头的相对两侧。
- 将塞子插入腔室并以适度的压力旋转塞子（或腔室），以将润滑脂散布在接头中。
- 用实验室湿巾擦去多余的油脂。
- 卡扣塑料 Keck 夹在接头上，以将塞子固定在腔室中。组装好的腔室应如图 1C 所示。
- 对当天实验使用的腔室数量重复上述步骤。
注意： 可记录的腔室数量受可用腔室、控制器和计算机 USB 输入的数量限制。在本实验中，通常有七个腔室并行运行。实验性苍蝇（如突变体）应与适当的对照相匹配。每个实验中应包括一个设置相同但没有苍蝇的腔室，作为环境变化的对照。含有不同处理（突变型，野生型，禁蝇）的腔室应在实验之间轮换。 - 将组装好的腔室放入水浴中的架子中，旋塞阀打开（图1E）。
注意：为避免昼夜节律变化，在上午9：30至9：50之间将腔室放入浴中，用于此处描述的所有实验。 - 保持旋塞阀打开（保持手柄与旋塞阀平行）。
注意： 小心不要让水进入旋塞阀。 - 让腔室平衡，旋塞阀打开约 30 分钟。
注意： 当腔室平衡时，连接电子设备并设置数据采集，如下所述。
3. 设置控制器和计算机
- 确保向 O2 发电机供电的开关处于关闭位置（远离连接器; 图1D）。
- 将每个控制器盒插入可用的通用串行总线 （USB） 端口。
注：控制器单元的构造和编程在别处描述12. - 使用 6 芯电缆将控制器连接到呼吸计室。
- 检查控制器的有机发光二极管（OLED）显示器（图1D）是否显示环境参数。
- 使用控制器上的开关短暂打开 O2 发生器（图 1D）。
- 如果电流值从零增加到 35 到 55 mA 之间，则控制器和腔室已准备好进行实验。
- 确定控制器正在使用的 COM 端口，如下所述。
- 单击 Microsoft Windows 中的 “开始 ”图标。
- 单击 设置 图标。
- 单击 蓝牙 和 设备。
- 确保控制器及其 COM 端口显示在设备列表中。
- 在桌面上打开 PuTTY，并为呼吸计的每个通道设置日志文件，如下所述。
注意：PuTTY 是一个免费的安全 shell 和 telnet 客户端，用于通过 COM 端口将数据传输到计算机。- 通过在“串行线路”框中键入端口号来选择控制器的COM端口（图2A）。
- 单击 “Logging”（日志记录）。
- 在“会话日志记录”中选择可打印输出（图2B）。
- 在“日志文件名”下，单击 “浏览”。
- 在所选文件夹中，创建一个包含描述性信息（例如，日期、物种、COM 端口号）的文件名。
- 点击 保存。
- 单击 “打开”。将打开一个窗口，显示正在记录的逗号分隔数据（图 2C）。
- 对用于实验的所有其他控制器重复上述步骤。每个COM端口的输入将显示为一个单独的窗口（图2D）。
4. 运行实验
- 一旦腔室平衡30分钟，通过关闭旋塞阀来密封它们。
- 用聚苯乙烯泡沫盒盖住浴缸和房间，以保持稳定的环境。
- 再平衡一个小时。
- 使用控制器盒上的开关打开每个腔室的 O2 发生器的电流。
- 一旦 O2 发生器被激活，确保压力增加到预设的 OFF 压力。
注：1017 hPa，略高于大气压，在本系列实验中用作“关闭”压力。恢复到环境压力将表明气体从腔室泄漏。此外，无论环境气压如何，它都允许在实验中使用相同的压力。“ON”压力为 1016 hPa，这意味着在 O2 发生器启动之前，压力只需要下降 1 hPa。这为测量果蝇中的 O2 消耗量提供了足够的灵敏度。一旦腔室被加压到“OFF”设置，电流应降至零。 - 让实验运行3小时或更长时间。
注意：在高温下较高的VO 2 可以缩短实验时间。偶尔进行监测以确保设备正常运行，但避免在腔室附近进行可能影响温度稳定性的过度活动。
5.精加工实验
- 关闭所有控制器上的 O2 发电机。
注意： 首先要避免在腔室打开时运行 O2 发生器。 - 打开旋塞阀以打开腔室。
- 让 PuTTY 窗口再打开 5-15 分钟以提供最终基线。
- 关闭每个控制器的 PuTTY 窗口，结束录制。
注意：所有实验在下午 4：50 至 5：10 之间结束。 - 断开传感器与电缆的连接。
- 将腔室移至干架。
- 从腔室中一次拔下一个传感器插头。
- 断开 O2 发生器并将它们放入管架中。
- 擦去传感器插头上的油脂并将其放在机架中。
- 清除腔室接头上的油脂，并用苍蝇和碱石灰去除管子。
- 用 CO 2 麻醉每根管中的苍蝇， 轻敲重量船并在微量天平上称重。
- 记录每个试管的重量和苍蝇数量。
- 丢弃苍蝇或将它们放在一边进行其他程序。
- 将筒中的碱石灰倒入废物容器中。
- 打开 O2 发生器并将 CuSO4 溶液丢弃到废物容器中。
- 用纯净水冲洗电极和管子。
- 放置管架进行干燥。
6. 电荷转移数据分析
- 将数据作为逗号分隔的文本导入电子表格，每条记录由一个单独的工作表组成。
- 记录 O2 发生器每个脉冲的电流和时间数据。从腔室加压后的第一个脉冲开始，记录每个当前脉冲的开始时间和结束时间（作为行号）。这是当电流高于零（通常约为 45-50 mA）到高于零的最后一行时的行号。
- 在工作表上制作一个表格以记录以下数据：
- 脉冲期间的平均电流幅度：= AVERAGE（[第一行脉冲]：[最后一行脉冲]）对于每个脉冲（来自电流列）。
- 脉冲持续时间：（[最后一行脉冲] - [第一行脉冲[-一行]]）/每个脉冲为 1000（从以毫秒为单位的时间列）。
- 总实验时间：[最后一个脉冲开始的时间] - [腔室加压后第一个脉冲结束时的时间]（从分钟列开始）。
- 然后计算每个脉冲的电荷转移 （Q）（平均电流 X 持续时间）
- 将所有脉冲的电荷相加以计算总电荷 （Qtot）。
7. O2 消耗量分析
- 为所有数据设置一个新的电子表格，并为每个腔室输入或计算以下内容：
- Qtot （总费用）
- 摩尔 （= Q ÷ 96485 × 4）
- mL O2 （= 摩尔× 22413 mL/mol）
- 总时间（来自上面的数据分析）
- mL min-1 （= ml O2 ÷总时间）
- 重量（克）（实验后麻醉并称重测量的苍蝇）
- mL min-1 g-1 （= mL min-1 ÷重量（克）
- mL/h/g（以上×60）
- mg/苍蝇（= 苍蝇重量÷苍蝇数量）
- μL 苍蝇-1 h-1（=（mL min-1 × 3600） ÷苍蝇数量）。
- 将每种处理的数据制成表格（例如基因型）
- 使用方差分析、t 检验或 Mann-Whitney u 检验 13 比较治疗。
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Representative Results
呼吸计控制器的压力和电流输出显示在图3A中一个实验中的一个腔室。第一个长电流脉冲将腔室从环境压力（约 992 hPa）加压到预设的 OFF 阈值 1017 hPa。当苍蝇消耗 O 2 和 CO 2 被吸收时，压力缓慢下降，直到达到 1016 hPa 的 ON 阈值，从而激活通过 O2 发生器的电流。在所示示例中，每个脉冲的平均幅度为 50.1 mA，持续时间为 16.1 s，每个脉冲产生约 0.81 库仑 （C） 的电荷转移。该腔室的总电荷转移为 3.28 C，总时间为 240.0 min。使用程序中描述的苍蝇质量和数量（23只苍蝇总重14.9mg）的计算，该室中组的O 2消耗量为3.19mL h-1 g-1或2.07μL h-1苍蝇-1。
该设备易于设置，只需最少的培训，并且在许多组装和停机周期中都能可靠地运行。尽管如此，必须定期维护和检查设备，并且必须仔细控制实验条件。例如，由于接头或旋塞阀的故障，气密密封的损失会导致快速的加压循环和虚假的高 VO2 （图 3B）。此外，腔室内的温度和湿度必须保持稳定。如果温度或湿度降低，产生的压降将被错误地解释为消耗的 O2 。相反，温度或湿度的向上漂移将抵消 O2 消耗引起的压力降低，并人为地减少或消除 VO2 信号（图 3C）。
该方法用于测试 CASKΔ18 突变体的 VO2，该突变体是通过不精确地从 CASK 位点 14 中切除转座元件而产生的，其中运动急剧减少14,16。在野生型w（ex33）对照中，通过精确切除转座元件产生，平均质量比O2消耗量为3.65 ± 0.24 mL·g-1·h-1 （n = 16腔室;图4A）。
尽管运动明显减少，但CASKΔ18突变体的VO2略低于对照组（平均值±s.e.m.= 3.23±0.13 mL·g-1·h-1;n=11组;P = 0.08 Mann-Whitney u检验）。
由于以体重表示代谢率的有效性受到质疑18，因此还分析了每只苍蝇的O2消耗量（图4B）。使用该分析，与野生型对照相比，CASKΔ18 中的 VO2 显著降低 （ex33： 2.22 ± 0.13 μL·fly-1·h-1;木桶Δ18： 1.58 ± 0.10 μL·fly-1·h-1;P = 0.0003，Mann-Whitney u检验）。然而，CASKΔ18果蝇的平均质量比ex33对照组低>20%（图4C; ex33 0.61±0.01mg;桶Δ18 0.51±0.02mg;P = 0.0005，Mann-Whitney u检验），因此基因型之间代谢率的差异可能是由于它们的大小不同。
图 1：呼吸计设置。 （A） 组装前的传感器插头（上图）和 50 mL 腔室（由 50 mL 舒伦克管组成，下图）的示意图。注意将连接腔室和传感器插头的 19/22 磨砂玻璃接头的位置，每次实验前必须清洁这些接头。还指出了打开或密封腔室所必需的旋塞阀。（B） 组装好并准备进行实验的腔室和组件图，显示：湿棉卷、装有苍蝇的聚丙烯管、用棉塞塞住、碱石灰盒和填充有 CuSO4 的 O2 发生器。（C） 组装室的照片。将塞子固定到腔室的 Keck 夹具被固定腔室的环形支架夹部分遮挡。（D） 控制器的照片，显示通过O2发生器的开关控制电流和用于查看OLED显示屏的窗口。（E） 在水浴中组装的腔室。图中显示了七个腔室，其中三个包含突变体，三个包含野生型对照，一个腔室包含除苍蝇以外的所有成分。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：数据采集设置。 （A） PuTTY接口，用于选择用于数据采集的串口。已选择COM3，波特率为9600以匹配控制器的输出。（B） 用于设置日志文件的 PuTTY 接口。选择“可打印输出”以将数据记录到文本文件，使用“浏览”按钮选择数据文件夹，并创建文件名。（C） 实验期间的 PuTTY 日志文件。大约每秒采集两次数据，每行包含以下逗号分隔的信息：传感器编号、自采集开始以来的时间 （ms）、腔室温度 （°C）、腔室压力 （hPa）、湿度（相对百分比）和电流 （mA）。（D） 典型实验期间的数据记录，有七个实验室窗口，外加一个记录浴槽温度、环境空气温度、压力和湿度的通道。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：来自微呼吸计的数据。 （A） 在包含 23 w（ex33） 苍蝇的单个呼吸计室中，穿过 O2 发生器（黑线，右轴）的压力（灰线，左轴）和电流。开始时，需要长电流脉冲将腔室从 ~992 hPa 加压到 1017 hPa 的 OFF 阈值。当苍蝇消耗 O 2 时，压力下降，直到达到 1016 hPa 的 ON 阈值，从而激活通过 O2 发生器的电流，从而将腔室重新加压至 1017 hPa。在这个实验中，这个过程重复了六次。（B） 由损坏的旋塞阀引起的腔室泄漏的例子，取自不同的一系列实验。腔室无法保持压力（灰线），导致电解电流不断循环（黑线）。请注意与图A不同的时间刻度。 （C）湿度漂移的影响。腔室中 20 mg 瓢虫 （Hippodamia convergens） 消耗的 O2 应该产生类似于图 3A 的压力循环模式，但湿度的稳定增加（黑线）导致腔室压力的人为增加（灰线），掩盖了 VO2。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：野生型和 CASK 突变体 D. melanogaster 的定量数据。 （A） 野生型 （w（ex33）） 和突变型 （CASKΔ18） 果蝇的质量特异性 VO2。在所有图中，方框的底部和顶部分别表示第一和第三四分位数，晶须表示极值，样本量（腔室数量，每个腔室包含 17-24 只苍蝇）在基因型上方的括号中给出。CASK Δ18 果蝇与 ex33 无统计学差异（中位数：ex33：3.420 mL·g-1·h-1，CASK Δ18 ：3.029 mL·g-1·h-1;p = 0.08 Mann-Whitney u 检验）。（B） 苍蝇特异性 VO2。CASKΔ18果蝇消耗的 O 2 （中位数 1.650 mL·fly-1·h-1） 明显少于 w（ex33） （2.078 mL·fly-1·h-1;p = 0.0003，Mann-Whitney u 检验;显著性用星号表示）。（C）CASKΔ18和野生型的质量差异（中位数：0.526 mg，ex33：0.623 mg;p = 0.0005，Mann-Whitney u检验;显著性用星号表示）。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1. 在25°C下对野生型果蝇的 果蝇 呼吸测量数据进行调查。 除了18个例外，研究仅限于测量O2 消耗量的研究。在大多数情况下，有必要从图表中估计 VO2 ，并提供原始论文中的数字。尽管所有基因型都被认为是“野生型”，但来源和繁殖方法各不相同。 请按此下载此表格。
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Discussion
上述程序演示了使用电子库仑显微呼吸计测量 D. melanogaster 中 O2 消耗量。野生型黑腹果蝇中 O2 消耗量的最终数据在大多数先前出版物中使用不同方法描述的范围内（表 1），尽管略低于其他人报告的数据 3,6。
关键步骤满足了该方法的两个绝对要求：气密密封和环境稳定性。保持气密环境很简单，但需要小心。舒伦克烧瓶和试管非常适合用作呼吸测量室。玻璃结构避免了许多类型的塑料19 中存在的透气性，这在长时间的实验中尤为重要。标准接头允许与包含传感器和电子连接的插头进行气密连接。旋塞阀提供可靠的密封，可以在实验过程中根据需要打开或关闭。为确保每次实验的气密密封，检查旋塞阀，彻底清洁接头，适量涂抹干净的硅脂，并用凯克夹固定接头。
该方法的灵敏度受到腔内温度和湿度稳定性的限制。任一参数的变化都会导致压力波动，从而干扰 VO2 信号。使用环境室12或循环水浴提供更稳定的温度控制。其他人的先前工作已经证明，当温度保持在 ±0.01 °C20 时，该方法可以在 nmol·h-1 水平上测量 O2 消耗量。为了稳定湿度，浸入水中的棉卷将湿度保持在接近 100%。在用电解产生的O2对腔室加压并开始记录之前，使温度和湿度稳定至少90分钟。所有实验都包括一个由所有组件组装而成但不含苍蝇的腔室，以监测环境条件。
定期持续监测温度、压力和湿度，大大简化了故障排除。例如，能够检测和纠正由损坏的旋塞阀（图3B）引起的人为高表观VO2或由于不稳定的腔室湿度（图3C）导致的VO2表观损失。
这里描述的库仑显微呼吸计有几个优点。首先，它相对便宜，每个通道（包括腔室、传感器和控制器）的总成本约为 100 美元。其次，由于每个通道独立采集和传输数据，因此系统具有可扩展性，腔室数量仅受环境控制器（水浴或环境腔）的尺寸和计算机中可用USB端口的数量（通常可扩展至>100）的限制。此外，由于腔室和控制器是独立的，因此其中任何一个的故障都不会影响其他腔室和控制器。第三，控制器可以很容易地重新编程，以适应环境压力或根据需要调整灵敏度。与此相关的是，腔室内的压力被设置为一个固定值，因此无论环境气压如何，实验压力在实验中都是恒定的。第四，关于时间、温度、压力、湿度和电流的稳定数据流允许对每个腔室的这些参数进行详细分析，便于在较长时间的实验中对 VO2 的时间变化进行故障排除或分析。最后，腔室内的环境条件可以保持恒定水平数小时或数天，因为消耗的 O2 会不断被替换。在本研究中，腔室压力在1016-1017 hPa之间波动，小于0.1%，PO2的变化小于0.5%。根据每个 O 2 发生器中可产生 28 mL O2 的 CuSO4 量，以及本研究中苍蝇组的平均 V O2,1.15 mL/天（平均值 = 每个腔室 21.8 只苍蝇），一次最多可研究 24 天的代谢率。假设为苍蝇提供了足够的营养，这意味着在苍蝇的大部分寿命中可以连续研究新陈代谢。
目前，大多数黑腹果蝇代谢研究都是基于气体分析或测压法。依赖于气体分析的方法，如止流和连续流呼吸计2,3,6，其优点是该方法已经成熟，并且设备可以在市场上买到。然而，它们需要昂贵且复杂的设备，包括用于调节流量的歧管和分子流量传感器，以及用于测量气体浓度的气体分析仪。另外，简单的压力计9 要便宜得多。在最简单的形式中，通常用于黑腹果蝇，将苍蝇麻醉并放置在含有CO2吸收材料的小腔室中，该腔室通过毛细管连接到储液器。当 O 2 被消耗并吸收产生的 CO2 时，腔室中的压降，将流体吸入毛细管。然后，流体的高度与消耗的 O2 量成正比。由于在实验过程中消耗的 O2 不会被替换，因此 PO2 在实验过程中不断减少。虽然常规实验可能无法充分降低 P O2 以对 V O2 产生负面影响，但长时间的实验或高温下的实验可能会耗尽 O2 并达到临界 P O2，此时 V O2 急剧下降3。另一个问题是，毛细管中流体的重量会施加向下的力，从而降低流体的高度，从而与施加的向下力成比例地降低，从而导致潜在的误差。已经描述了补偿这种效应的方法4,21，但很麻烦，没有被广泛使用。气体分析和测压法的直接比较表明，这两种方法产生的结果明显不同，但作者无法对这种差异做出令人满意的解释22。
尽管有其优点，但库仑显微呼吸仪也有局限性。首先，与一些截流气体分析系统不同，它不是市售的。这些组件易于获取，设计和编程都不复杂，但其构造可能比简单的测压系统更复杂 9.其次，准确数据的获取必须包括 O2 生成的多个循环，因此每个实验必须持续数小时。使用测压法的实验也是如此。最后，与测压法一样，腔室内的温度和湿度必须稳定。尽管如此，库仑显微呼吸计在成本和复杂性方面提供了一个中间地带，一旦组装起来就坚固可靠，并且可以精确测量 O2 消耗量。
CASKΔ18突变体的实验表明，阴性（质量特异性V O2）和阳性结果（苍蝇特异性VO2）。如果 CASKΔ18突变体的行走减少 >50% 是由于代谢受损造成的，则可以预测 VO2 将减少类似的量。然而，质量比O2消耗量的变化是适度的（中位VO2减少9.6%），并且没有统计学意义。这一阴性结果与具有相对正常代谢的 CASKΔ18 突变体一致，行为表型由运动驱动降低引起。尽管该方法可能缺乏足够的灵敏度，但由相对较小的尺寸差异（中值质量减少 15.5%）引起的 VO2 降低非常显着。
步行与显着增加的能量消耗有关5,23，那么为什么 CASK 突变体中的 VO2 相对正常？CASK 突变体16 中的过度梳理可能会抵消步行的减少，或者当在小管中成群测试果蝇时，步行表型不太明显，但这些假设正在等待实验验证。尽管如此，我们得出结论，CASK 基因座的突变对新陈代谢没有强烈、直接的影响，并且库仑显微呼吸计是研究黑腹果蝇代谢的有效工具。
由于该装置易于由普通组件构成，可精确测量O2 消耗量，具有高度便携性，可在任何温度稳定的环境中使用，并且已用于小至0.5mg苍蝇（本研究）和大至500mg蝎子的生物（DJS未发表），它为研究各种生物的新陈代谢增加了一种多功能工具。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢亚利桑那大学的Linda Restifo博士建议测试CASK突变体的O2 消耗量，并发送CASK突变体及其同源对照。出版费由帕克大学生物系的部门再投资基金提供。空间和一些设备由Shady Grove的大学提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
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