Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח צפיפות המיטוכונדריה והתפלגות האורך בסיבי שריר שלד חי של חולדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65306
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3
1Experimental Medicine and Advanced Therapies, The Institute for Obesity Research, Tecnologico de Monterrey, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Preclinical Research Unit, Tecnologico de Monterrey

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שינויים בצפיפות המיטוכונדריה ובפיזור האורך על ידי הדמיית שרירי שלד חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת רשת מיטוכונדריאלית.

Abstract

המיטוכונדריון הוא אברון שניתן להאריך, לפרק ולשפץ בהתאם לדרישות המטבוליות של התאים. העיצוב מחדש של רשת המיטוכונדריה מאפשר למיטוכונדריה בריאה לעמוד בדרישות התאים; עם זאת, אובדן יכולת זו היה קשור להתפתחות או התקדמות של פתולוגיות שונות. בשרירי השלד, שינויים בצפיפות המיטוכונדריה ובפיזור נצפים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים כגון פעילות גופנית, הזדקנות והשמנת יתר, בין היתר. לכן, חקר הרשת המיטוכונדריאלית עשוי לספק הבנה טובה יותר של מנגנונים הקשורים למצבים אלה.

כאן מתואר פרוטוקול להדמיית מיטוכונדריה של סיבי שריר שלד חיים מחולדות. סיבים מנותחים ידנית בתמיסה מרגיעה ומודגרים עם אינדיקטור הדמיה פלואורסצנטי של תאים חיים של מיטוכונדריה (tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE). אות המיטוכונדריה נרשם במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מצב סריקה XYZ כדי לקבל תמונות קונפוקליות של רשת המיטוכונדריה הבין-מיופיבריאלית (IMF). לאחר מכן, התמונות הקונפוקליות מעובדות על ידי סף ובינאריות. התמונה הקונפוקלית הבינארית לוקחת בחשבון את הפיקסלים החיוביים עבור מיטוכונדריה, אשר נספרים לאחר מכן כדי לקבל את צפיפות המיטוכונדריה. הרשת המיטוכונדריאלית בשרירי השלד מאופיינת בצפיפות גבוהה של אוכלוסיית IMF, בעלת התפלגות אורכית תקופתית דומה לזו של צינוריות T (TT). התמרת פורייה מהירה (FFT) היא טכניקת ניתוח סטנדרטית המבוצעת להערכת התפלגות TT המאפשרת למצוא את תדירות ההתפלגות ואת רמת הארגון שלהם. בפרוטוקול זה מתואר יישום אלגוריתם FFT לניתוח ההתפלגות המיטוכונדריאלית האורכית בשרירי השלד.

Introduction

מיטוכונדריה יוצרים רשתות דינמיות מאוד המווסתות בעיקר על ידי האיזון בין התארכותו (איחוי) ופיצול (ביקוע)1,2, המווסתות על ידי ביטוי ופעילות של חלבונים כגון מיטופוסין 1 ו-2 (Mfn1 ו-Mfn2), ואטרופיה של חלבון אופטי 1 (Opa1), המווסתים את האיחוי של קרום המיטוכונדריה החיצוני והקרום הפנימי, בהתאמה 1,2. חלבון הקשור לדינמין (Drp1) מווסת בעיקר את הביקוע המיטוכונדריאלי כאשר הוא עובר זרחן ב-Ser6163.

בשרירי השלד, הוכח היטב כי הרשת המיטוכונדריאלית מסודרת בתת-אוכלוסיות מוגדרות היטב מבחינה מבנית בהתבסס על קרבתן לאזורי תאים שונים (מיופיברילים, סרקולמה וגרעינים)4,5. המיטוכונדריה הממוקמים ממש מתחת לסרקולמה נקראים מיטוכונדריה תת-סרקולמלית (SSM), אלה הממוקמים בין חוטי ההתכווצות נקראים מיטוכונדריה אינטרמיופיברילארית (IMF), ותת-האוכלוסייה המיטוכונדריאלית סביב הגרעינים נקראת רשת מיטוכונדריה פרי-גרעינית (PMN). יתר על כן, הוצע כי תת-אוכלוסיות מיטוכונדריאליות אלה יש פונקציות ספציפיות לאזור והם מתמחים מטבולית 4,5.

תחזוקת הומאוסטזיס האנרגיה התאית, המאפשרת תפקוד מטבולי והתכווצות, תלויה במידה רבה באינטראקציה ובתקשורת באתרים ספציפיים דרך הרשת המיטוכונדריאלית (למשל, אינטראקציית IMF ו- SSM)4,6. בנוסף לאינטראקציות ברשת המיטוכונדריה, המיטוכונדריה יכולים גם לקיים אינטראקציה עם אברונים אחרים, וליצור קומפלקסים מבניים ופונקציונליים. בהקשר זה, הוכח כי IMF יכול להיות ממוקם בסמוך לרשתית הסרקופלזמית (SR) ובסמיכות ליחידות השחרור Ca2+ (CRU), שנוצרו על ידי הצינוריות הרוחביות (TT)7. עובדה זו רלוונטית בשל התפקיד של ספיגת Ca2+ מיטוכונדריאלי בוויסות סינתזת ATP ואפופטוזיס. לאחרונה הוצע גם תפקיד פוטנציאלי בוויסות מעברי Ca2+ ציטוסוליים8.

TT הם פלישות של סרקולמה שיש להן התפלגות מחזורית לאורך ציר האורך של קרדיומיוציטים וסיבי שרירי השלד 9,10, בדומה להתפלגות IMF 5. לשינויים בהתפלגות TT יש השלכות פיזיולוגיות חשובות, בהתחשב בתפקידם בתפקוד ההתכווצות. עם זאת, שינויים אלה הוערכו בעיקר cardiomyocytes. שימוש בניתוח התמרת פורייה מהירה (FFT) מאפשר המרה של אותות מחזוריים מתחום המרחק לתחום התדרים, וכתוצאה מכך ספקטרום FFT המציין את התדר ואת הסדירות של האות11,12,13. למרות שיש ראיות לכך שארגון הרשת המיטוכונדריאלית בסיבי שריר השלד חיוני להסתגלות לתנאים מטבוליים שונים, שכן במהלך התחדשות לאחר פגיעה בשריר14,15, רוב הניתוחים מבוצעים בצורה איכותית.

נוסף על כך, בהתחשב בכך שתפקוד לקוי של המיטוכונדריה נקשר למספר מחלות הקשורות לשרירי השלד (למשל, ניוון דיס-שימוש)2 ולמחלות שאינן קשורות לשרירים, במיוחד מחלות מטבוליות, ולאובדן מסת השריר (כלומר, ניוון)16, ההערכה הכמותית של הרשת המיטוכונדריאלית והפיזור בשרירי השלד רלוונטית. לאחרונה, הבדל משמעותי בהתפלגות האורכית של מיטוכונדריה של סיבי שריר gastrocnemius בין קבוצה שמנה (Ob; חולדות פא /פא של צוקר), וקבוצה רזה (Lean; חולדות צוקר +/+) זוהו באמצעות FFT17. מחקר זה הדגים את התועלת של FFT בניתוח התפלגות המיטוכונדריה. לכן, פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה לחקר מיטוכונדריה בסיבי שריר שלד חיים מתמונות שהתקבלו במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי. צפיפות המיטוכונדריה מכומתת על ידי סף רקע, ומתואר גם ניתוח התפלגות מיטוכונדריאלית אורכית על ידי ניתוח FFT. סכימת זרימת עבודה מוצגת באיור 1.

Protocol

כל הליכי הניסויים בבעלי חיים הוערכו ואושרו על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים (CICUAL) של Tecnologico de Monterrey (פרוטוקול 2019-007). חולדות צוקר זכרים (+/+ ו-fa/fa) בגילאי 12 עד 13 שבועות שימשו במחקר זה. בעלי החיים הוחזקו בתנאי גידול סטנדרטיים (מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, 40-60% לחות) והייתה להם גישה למזון (צ'או חולדה סטנדרטי) ומים עד ליביטום.

1. הרכב הפתרון

  1. הכינו תמיסת Relax טרייה על-ידי ערבוב הרכיבים המוצגים בטבלה 1. התאם את רמת החומציות ל-7.3 באמצעות נתרן הידרוקסידי (NaOH).
  2. חשב את ריכוז הסידן החופשי בתמיסת Relax באמצעות תוכנת סימולציה לקביעת ריכוז המתכת החופשית.
  3. הכינו מלאי של 5 mM tetramethylrhodamine methyl ester (TMRE) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ודילול עוקב של 0.1 mM ב-DMSO.

2. דיסקציה של צרורות סיבי שריר gastrocnemius

  1. הניחו את בעל החיים בתוך תא האינדוקציה וסגרו את המכסה. הפעל את מקור החמצן, הגדר את קצב זרימת הגז על 0.5 ליטר לדקה, והגדר את הוופורייזר על 4% סבופלורן כדי לגרום להרדמה.
  2. לאחר שהחולדה ישנה, הניחו אותה מחוץ לתא במצב שכיבה תוך שמירה על הרדמה. צבוט את הבוהן או הזנב כדי לאמת את חוסר הרפלקסים.
  3. בעזרת מספריים, חותכים דרך העור והשרירים של הבטן. לאחר מכן, חתכו את כלוב החזה כדי לקבל גישה ללב.
  4. כדי לבצע cardiectomy, לתפוס את הלב מן הוורידים העליונים והעורקים עם מלקחיים לחתוך את כלי הדם עם מספריים. הסר את הלב.
  5. מיד לאחר המתת חסד, לחטא את הגפה האחורית עם אתנול ולגלח אותו באמצעות מכונת גילוח.
  6. מחזיקים את כף הרגל האחורית ומבצעים חתך עם מספריים דרך העור בגובה גיד אכילס.
  7. חותכים את הגפה האחורית עם מספריים ברמה של השוקה הפרוקסימלית. מעבירים אותו לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה 3 מ"ל של תמיסת Relax קרה כקרח במצב גבי. כסו אותו בתמיסה מספקת כדי למנוע מהשרירים להתייבש.
  8. זהה את גיד אכילס, הרם אותו בזהירות עם מלקחיים, ונתח את השרירים הרחק מהעצם עם מספריים קשתית. השתמש בסטריאומיקרוסקופ משלב זה ואילך של הדיסקציה.
  9. זהה והפרד את שריר הגסטרוקנמיוס כולו, הנפח העיקרי בחלק האחורי של הגפה האחורית.
  10. נתחו והשליכו את רקמת החיבור והשומן המקיפה את השריר בעזרת מלקחיים עדינים. העבירו את הראש הצידי של השריר לצלחת פטרי חדשה עם תמיסת Relax קרה כקרח (ראו איור 2A).
  11. החזיקו בעדינות את השריר עם מלקחיים מקצה אחד והפרידו אותו בזהירות לצרורות עם מספריים זעירים. תמיד לתפעל צרורות על ידי החזקתם בעדינות בקצה אחד עם מלקחיים.
    הערה: צרורות הם באורך של כ-10 מ"מ וברוחב של 2 מ"מ.
  12. העבירו את חבילות הסיבים לצלחת פטרי חדשה עם 2 מ"ל של תמיסת Relax קרה כקרח. בחרו רק את אלה שיש להם מראה חלק, שהם שלמים מקצה אחד לשני ואינם מקוצרים (איור 2B).

3. רכישת הדמיה של מיטוכונדריה במיטוכונדריה בשרירי השלד במיקרוסקופ קונפוקלי

  1. לדגור על הסיבים בתמיסת TMRE של 2.5 × 10-4 mM בתמיסת Relax למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: עם ריכוזי העבודה המומלצים של TMRE, הוא צפוי להיות במצב לא מרווה. יש להגן מפני חשיפה לאור מנקודה זו ואילך.
  2. בזמן הדגירה:
    1. פתח את התוכנה הסטנדרטית של המיקרוסקופ הקונפוקלי, בחר את מסגרת התצורה , ובתיבת הדו-שיח תצורת חומרה בחר לייזר וסמן את האפשרות HeNe 543 .
    2. במסגרת הרכישה , בחר בתיבת הדו-שיח רכישה, ובמצב רכישה, בחר בחלונית XYZ.
    3. בתיבת הדו-שיח XY, בחר בתבנית 512 x 512, מהירות 400 הרץ וסמן את החלונית חור סיכה. בתיבת הדו-שיח המוצגת של חור הסיכה, בחר AU עבור יחידה והוסף ערך של 3 אוורירי עבור חור הסיכה.
      הערה: שקול להקטין את גודל חור הסיכה הקרוב ביותר לקריטריון האופטימלי 1 אוורירי, אם נשמר אות פלואורסצנטי מתאים.
    4. בתיבת הדו-שיח ' הגדרות נתיב אלומה' , בחר יעד טבילה במים של 20x וצמצם מספרי (NA) של 0.7 (20x/0.7 IMM), ובחר בחלון אורך גל הפליטה של 576-700 ננומטר. בחר DD488/543 ו- 15% מעוצמת הלייזר עבור לייזר 543.
      הערה: עדשה אובייקטיבית לטבילה במים לסריקת הדמיה חיה מומלצת בחום (אם קיימת). מאז מדד שבירה דומה של מדיום טבילה ואת מדיום הדגירה מושגת.
  3. לאחר 20 דקות של דגירה, להחליף את מדיום הדגירה פעמיים. ודא כי התמונות קונפוקליות נרכשות בתוך 20-30 דקות לאחר הדגירה.
  4. הכינו את תא ההקלטה עם כיסוי 0.15 מ"מ של זכוכית בורוסיליקט.
    הערה: בחר את עובי הכיסוי בהתאם לתא ההקלטה הזמין, בהתחשב בכך שעובי בדרך כלל נע בין 0.15 ל- 0.22 מ"מ לקבלת ביצועים מיטביים.
  5. הוסף 200 μL של פתרון Relax לתא ההקלטה והעבר את חבילות הסיבים.
  6. במיקרוסקופ קונפוקלי, השתמש במצב שדה בהיר כדי לזהות סיבים קיימא לרישום פלואורסצנטי של מיטוכונדריה. סיבים בני קיימא הם שלמים, לא מכווצים, ויש להם דפוס חתך שלם.
  7. הפרידו את צרורות הסיבים זה מזה ויישרו אותם בעזרת מלקחיים. בחר את אלה הקרובים ביותר לתלוש הכיסוי.
  8. סרוק את הפלואורסצנטיות באמצעות הלחצן החי כדי לכוונן את הרווח וההסטה במסוף לוח הבקרה בהתחשב בנושאים הבאים:
    1. בחר ערכי עוצמה פלואורסצנטית נמוכה עבור רקע של כמעט 0 יחידות שרירותיות (A.U).
    2. בחר רמת רווח בין 100 ל- 200 A.U. כדי למנוע רוויה של מערכת ההקלטה. לפיכך, לא לרשום את רמות הפלואורסצנטיות הגבוהות ביותר.
    3. בחרו גודל פיקסל של 150-190 ננומטר כדי לקבל את מלוא רוחב הסיב, תוך התאמת מקדם הזום בתיבת הדו-שיח XY .
      הערה: שקול להשתמש בגודל הפיקסלים הקרוב יותר לקריטריוני Nyquist (90 ננומטר), המאפשר סריקה של מלוא רוחב הסיב.
  9. בתיבת הדו-שיח 'מחסנית Z', התאימו את מרחק Z לקבלת האות הפלואורסצנטי החל מעומק סיב של 15 מיקרומטר (לחצן התחל) ועד 22 מיקרומטר (לחצן סיום). בחר 3 מיקרומטר כגודל Z-step.
  10. לחץ על לחצן התחל כדי להשיג את התמונות הקונפוקליות. קבל ערימת Z המורכבת משלוש תמונות קונפוקליות שנרכשו בעומק של 15, 18 ו- 21 מיקרומטר.

4. ניתוח צפיפות המיטוכונדריה

  1. בפלטפורמת הקוד הפתוח לניתוח תמונות ביולוגיות18 פתחו את קובץ Z-stack וסובבו את התמונות כדי למקם את הסיב בצורה אופקית, כפי שמוצג באיור 3B.
  2. בחר באופן אקראי אזור עניין מלבני (ROI) הכולל את האזור שנכבש על ידי המיטוכונדריה (ROImito). בחר בגדלים של ROImito הנעים בין 65 ל- 90 מיקרומטר עבור X. עבור Y, הגודל יהיה תלוי רוחב הסיב, הימנעות הפריפריה שלה.
  3. שכפל את מחסנית Z עם מיטוהחזר ההשקעה שנבחר ושמור אותו כמחסנית Z חדשה (מחסנית מיטו) בתבנית TIFF. שמור את מיקום המיטו של החזר ההשקעה שנבחר בערימה המקורית באמצעות הכלי ROI Manager.
  4. חשב את הסף לחיסור רקע באופן הבא:
    1. השתמש בפקודת הקיצור+shift+t כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח סף .
    2. בחר את אלגוריתם הסף Otsu |B&W | אפשרות רקע כהה . שים לב שהתמונה היא כעת בינארית.
    3. בתיבת הדו-שיח סף , התבונן בהיסטוגרמה של התפלגות עוצמת הפלואורסצנטיות ובערך הסף המוצג.
      הערה: לפיקסלים חיוביים למיטוכונדריה יש ערכי עוצמת פלואורסצנטיות גדולים מהסף, והם מופיעים כפיקסלים לבנים בתמונה הבינארית.
    4. החל את הסף על אוסף התמונות הבינארי באמצעות בחירה באפשרות החל. בתיבת הדו-שיח ' המר אוסף תמונות לבינארי ' המוצגת, בחרו באפשרויות ' חשב סף' לכל תמונה, רקע שחור, 'צור אוסף חדש' ולחצו על הלחצן 'אשר'.
  5. שימו לב שנוצרת ערימה עם שלוש התמונות הבינאריות (BinDMito-stack). שמור אותו בתבנית TIFF.
  6. חשב צפיפות מיטוכונדריאלית במחסנית BinDMito-באופן הבא:
    1. בחר בתפריט נתח . לאחר מכן, לחץ על היסטוגרמה. בתיבת הדו-שיח ההיסטוגרמה המוצגת, לחץ על כן כדי לכלול את כל התמונות של האוסף לניתוח.
    2. בתיבת הדו-שיח היסטוגרמה של אוסף , לחץ על רשימה כדי לקבל את נתוני ההיסטוגרמה. העבר את נתוני ההיסטוגרמה לגיליון אלקטרוני.
    3. בגיליון אלקטרוני, זהה פיקסלים מיטו-פיקסלים בעלי הערך 255 . חישוב צפיפות מיטוכונדריה באמצעות משוואה (1):
      צפיפות מיטוכונדריאלית = Equation 1 × 100 (1)
      סך כל הפיקסלים מזוהה כ- N בתיבת הדו-שיח 'היסטוגרמה' או מחושב על-ידי סיכום ספירת הפיקסלים בהיסטוגרמה בגיליון האלקטרוני.
    4. כדי לחשב את השטח התפוס על ידי מיטוכונדריה (מיקרומטר2), הכפל את הפיקסלים המיטיבים של ערימת BinDMito, בגודל הפיקסלים.

5. ניתוח התפלגות המיטוכונדריה על ידי התמרת פורייה מהירה

  1. בפלטפורמת הקוד הפתוח לניתוח תמונות ביולוגיות, פתח את מחסנית BinDMito-stack וצייר החזר השקעה מלבני של 256 פיקסלים רוחב וגובה 5 מיקרומטר. אתר החזר השקעה במיקום מרכזי ואחר במיקום רוחבי, כפי שמוצג באיור 4A,B.
  2. השתמש בכלי ROI Manager כדי להגדיר את החזר ההשקעה עבור ניתוח FFT ולשמור אותו.
    הערה: בהתאם לצורך הניתוח, ניתן לבחור ROI אחרים במיקומים שונים, וניתן לשנות את גודלם. עם זאת, הרוחב חייב להיות שווה ל- 2n פיקסלים כדי לבצע FFT (לדוגמה, 128, 256, 512 פיקסלים).
  3. השג את פרופיל ההתוויה של החזר ההשקעה באמצעות פקודת קיצור הדרך + k והעבר את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
  4. בגיליון האלקטרוני, מלא עמודות B ו - C בנתונים המתקבלים מפרופיל העלילה. עמודת B מכילה את המרחק במיקרומטר, ועמודת C מכילה את הערך האפור המתאים של עוצמת הפלואורסצנטיות (A.U).
  5. עמודת D מתאימה לתדר FFT (אירוע/מיקרומטר), אשר ימולא באופן הבא:
    1. חישוב תדירות הדגימה (Fs): Fs = 1/Δ d, כאשר Δd הוא שלב המרחק (הערך השני של B).
    2. חשב את Δ Fs: Δ Fs= Fs/N, כאשר N הוא מספר נקודות הנתונים של B (256).
    3. חשב את ערך העצירה של תדר FFT (S): S = (N/2) ×ΔFs.
    4. מלא את עמודת D באופן הבא:
      1. הערך הראשון של עמודת D שווה ל- 0.
      2. בחר את התא השני בעמודה D, עבור לתפריט הבית, בחר מילוי ולחץ על סידרה. בחר עמודות. עבור ערך השלב, השתמש ב- Δ Fs המחושב. עבור ערך העצירה, השתמש ב- S המחושבת.
    5. לאחר מכן, מלא את העמודה E בערכים המורכבים של FFT באופן הבא:
      1. הוסף 0 בתא הראשון של עמודת C, מכיוון שהמרחק 0 חייב לחפוף לאות 0 לצורך חישוב ה- FFT.
      2. לאחר מכן, עבור אל תפריט נתונים, לחץ על ניתוח נתונים ובחר ניתוח פורייה.
      3. בחלון החדש, בחר את טווח נקודות הנתונים של האות הפלואורסצנטי המתואר בעמודה C עבור טווח הקלט.
        הערה: מספר נקודות הנתונים חייב להיות 2n (לדוגמה, 256 או 128 נקודות נתונים של אות פלואורסצנטי).
      4. בחר את הטווח המתאים של E עבור טווח הפלט.
      5. בחר אישור ואפשר למלא את הערכים המורכבים של FFT באופן אוטומטי.
  6. מלא את עמודת F בגודל FFT באופן הבא:
    1. השתמש בפונקציה IMABS כדי להחזיר את הערך המוחלט ב- F מהמספר המרוכב ב- E ולהכפיל ב- 2/N כדי לנרמל (משוואה (2)):
      גודל FFT = (IM.ABS (E1... En) × (2/N) (2)
  7. התווה את ספקטרום ה- FFT באמצעות גודל FFT ב- F, כפונקציה של תדר FFT ב- D, עד S. מצא את נקודת הפסגה המרבית ואת תדר ה- FFT המתאים לה.
  8. המר את תדר FFT של הפסגה המקסימלית למרחק באמצעות משוואה (3). מרחק מחושב זה מייצג את המרחק האורכי של ההתפלגות המיטוכונדריאלית.
    מרחק (μm) = תדר 1/FFT (3)
    הערה: בשל סימטריית FFT, אל תתווה את תדר FFT מעבר לערך S , המתאים למחצית מנקודות הנתונים, ובכך הימנע מכפילות של ספקטרום FFT.

6. שלבי עיבוד מקדים אופציונליים להפחתת רעשי התמונה לפני ניתוח תמונה

  1. החל מסנן חציוני או דה-קונבולוציה דו-ממדית באופן הבא:
    1. עבור מסנן חציון:
      1. בחר תהליך | מסננים ולוחצים על האפשרות החציונית .
      2. בתיבת הדו-שיח החציונית המוצגת, בחר 2.0 בתיבה ' רדיוס ' ולחץ על הלחצן 'אשר'. בחרו 'כן ' להחלת התהליך על כל התמונות באוסף המיטו.
      3. שימו לב להפחתת הרעש בתמונות.
    2. עבור deconvolution דו-ממדי:
      1. יצירת פונקציית התפשטות נקודתית תיאורטית (PSF).
      2. הורד את PSF_Generator.jar התוסף והכנס את הקובץ לתיקייה "תוספים".
      3. בתיבת הדו-שיח מחולל PSF , לחץ על האפשרות Born &; Wolf 3D optical model, הזן את ערך טבילת אינדקס השבירה של 1.33 המשמש במהלך סריקה קונפוקלית ובחר באפשרות Best for the Accuracy computation .
      4. לכוד 576 ננומטר עבור אורך גל פליטה, NA של עדשת המטרה בשימוש של 0.7, ואת Z-step של 3,000 ננומטר.
      5. לכוד את גודל הפיקסלים XY של התמונה הקונפוקלית שיש לבטל, כמו גם את גודל XYZ המציין את מספר הפיקסלים של X ו- Y ואת מספר צעדי Z (3 עבור פרוטוקול זה).
      6. בתפריט תצוגה של מחולל PSF, לחץ על האפשרות ליניארית, בחר רזולוציה של 8 סיביות ולאחר מכן בחר באפשרות אפור עבור טבלת בדיקת המידע (LUT).
      7. הפעל את מחולל PSF ושמור את PSF התיאורטי שנוצר בפורמט TIFF.
      8. צור סכום פרוסות PSF שנוצר באמצעות פתיחת הכלי Z Project של האפשרות ' אוספים ' הממוקמת בתפריט 'תמונה '.
      9. בתיבת הדו-שיח ZProjection המוצגת, בחרו ' סכום פרוסות ' לסוג 'הקרנה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. שמור את PSF החדש בתבנית TIFF.
        הערה: PSF המתקבל באופן ניסיוני על ידי סריקה קונפוקלית של מיקרו-כדוריות פלואורסצנטיות בקוטר ידוע יכול לשמש במקום PSF התיאורטי.
      10. הורד את התוסף "DeconvolutionLab_2.jar"19 ומקם אותו בתיקיית התוסף.
      11. לחץ על התפריט תוספים. לאחר מכן, לחץ על DeconvolutionLab2.
      12. הפרידו את התמונות הקונפוקליות מהמחסנית האוטומטית בעזרת הכלי Images to stack מהאפשרות ' אוספים ' הממוקמת בתפריט ' תמונה' ושמרו אותה בתבנית TIFF.
      13. בתיבת הדו-שיח DeconvolutionLab2 , בחרו אחת מהתמונות המתקבלות מאוסף המיטו. בחר את PSF התיאורטי שנוצר, ובחר את האלגוריתם ריצ'רדסון-לוסי עם 15 חזרות.
      14. הפעל את DeconvolutionLab2, אמת את שיפור האות והפחתת הרעשים בתמונה ושמור אותה בתבנית TIFF.
  2. המשך לשלב 4.4 לניתוח תמונות.
  3. לסף התמונות המפותלות, המירו אותן למסיכה של 8 סיביות במהלך תהליך הסף. צרו אוסף עם התמונות הבינאריות והמפותלות באמצעות בחירה באפשרות ' תמונות לערימה ' בכלי אוספים מתפריט 'תמונה '.
  4. לניתוח FFT של תמונות לא מפותלות, פרופיל העלילה כולל מרחק ביחידות פיקסלים. המר את יחידות הפיקסלים למיקרומטר באופן הבא:
    1. בגיליון האלקטרוני, לאחר השלמת שלב 5.4 העבר את הנתונים מ- B ל- A. לאחר מכן, מלאו את B במרחק במיקרומטר על ידי הכפלת כל מספר פיקסל מ-A בגודל הפיקסל.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול הנוכחי, ניתן להשיג ניתוח של צפיפות ופיזור המיטוכונדריה בשרירי שלד חיים. הפרוטוקול מחולק לשלושה שלבים עיקריים: דיסקציה של צרור שרירי השלד, סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח תמונה. סקירת זרימת העבודה מוצגת באיור 1. איור 2A מראה שריר גסטרוקנמיוס שלם של חולדה בצלוחית פטרי, המסמן את הראש הצידי שממנו מתקבלים הסיבים, ואילו איור 2B מראה את צרורות הסיבים בתמיסת Relax. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ניתן לרשום את המיטוכונדריה לאורך עומק סיבי שריר השלד החי באמצעות מחוון הפלואורסצנטי TMRE. TMRE הוא פלואורופור קטיוני ליפופילי המצטבר באופן סלקטיבי בתוך המיטוכונדריה על פי פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית20.

ניתן לקבל תמונה קונפוקלית אופטימלית של קרן המטבע הבינלאומית על-ידי בחירת מרחק Z מעל 15 מיקרומטר של עומק בתוך הסיב (איור 3A). איור 3B מראה תמונות קונפוקליות מייצגות XY של מיטוכונדריה עמוסים ב-TMRE שנרכשו לאורך מרחק Z של סיבי שריר הגסטרוקנמיוס (15 עד 21 מיקרומטר). התמונות הקונפוקליות עובדו על ידי סף כדי להפוך אותן לתמונות בינאריות כדי לאפשר ניתוח מיטוכונדריאלי. איור 3B (פאנל שמאלי) מראה סיב מחולדה רזה שעברה פעילות גופנית. הוא מייצג תיעוד קונפוקלי צפוי של מיטוכונדריה של סיבי שריר השלד, שכן יש לו דפוס עקבי לאורך הסיבים. לעומת זאת, בחרנו סיב מחולדת Ob (איור 3B, פאנל ימני) שמראה שינויים משמעותיים בתכולת המיטוכונדריה ובפיזורה. איור 3C מראה את הכימות של אזור הסיבים התפוס על-ידי המיטוכונדריה המתבטא בצפיפות המיטוכונדריה, המתקבלת מכל תמונה בינארית (מוצגת בלוח B). כצפוי, סיבי Ob הציגו צפיפות מיטוכונדריאלית נמוכה יותר. הוא כומת באופן עקבי לאורך מרחק Z שנותח, שנצפה גם באיור 3D כאשר צפיפות המיטוכונדריה מחושבת לכל ערימה התואמת את שלוש התמונות הקונפוקליות שנרכשו ב-15, 18 ו-21 מיקרומטר.

בדומה לניתוח צפיפות המיטוכונדריה, סריקה קונפוקלית של אינדיקטור פלואורסצנטי לדימות תאים חיים, כגון TMRE, מאפשרת לחקור את הארגון האורכי של המיטוכונדריה בשרירי שלד חיים. קרן המטבע הבינלאומית מציגה ארגון מחזורי בתחום התדרים I-band קרוב ל-TT7, אותו ניתן לנתח באמצעות FFT כדי לכמת את תדירות האות המיטוכונדריאלי ואת רמת הארגון17. איור 4 מראה את ההבדלים בארגון קרן המטבע הבינלאומית שנמצאו בגסטרוקנמיוס שמקורו בחולדות Lean ו-Ob, וכיצד FFT מאפשר למצוא את השינויים בהתפלגות האות המיטוכונדריאלי. איור 4A,B מציג ROI אורכי שנבחר במיקום מרכזי ורוחבי בסיב לצורך ניתוח FFT. לפני ביצוע FFT, מחושב הסף לחיסור רקע. לאחר מכן, התמונה בינארית; הליכים אלה מבטלים את השינויים ברמות עוצמת הפלואורסצנטיות של האות המיטוכונדריאלי. התמונה הבינארית מספקת את פרופיל העלילה של התפלגות הפלואורסצנטיות הדרושה לביצוע FFT.

איור 4C,D מציג את החזר ההשקעה שנבחר בלוחות A ו-B עם פרופילי העלילה שלהם (לוחות עליונים). מפרופילי העלילה ניתן להבחין בהבדלים בהתפלגות הפלואורסצנטית בין הסיבים שמקורם בחולדות Lean ו-Ob, כמו גם בהבדלים בין החזר ההשקעה בתוך אותו סיב. עבור כל פרופיל מגרש, ספקטרום FFT המתאים שלהם מוצג (לוחות נמוכים יותר). שיא ספקטרום ה-FFT המרבי מציין את תדר ה-FFT (ציר X) של התפלגות האות המיטוכונדריאלי לאורך ציר האורך. ניתן להפוך אותו לערך מרחק הקרוב ל-2 מיקרומטר בהחזר ההשקעה הצידי והמרכזי מהחולדה הרזה. יש לציין כי גודל ה-FFT של הפסגה הוא מדד לסדירות האות המיטוכונדריאלי, ושינויים באמפליטודה זו חושפים שינויים בהתפלגות המיטוכונדריאלית.

איור 4E,F מראה את ההבדלים בספקטרום ה-FFT בין סיבים רזים וסיבים שמקורם ב-Ob, שבהם נותחו תשואות השקעה רוחביות ומרכזיות, בהתאמה. ב-ROI רוחבי (איור 4E) תדירות ההתפלגות האורכית של המיטוכונדריה הייתה דומה בסיבים רזים ובסיבים שמקורם ב-Ob; אף על פי כן, המשרעת של שיא ה-FFT המרבי בסיבים שמקורם ב-Ob הייתה גבוהה יותר, מה שתואם את הסדירות הגבוהה יותר של האות שנצפתה בתמונה באיור 4B. אף על פי כן, החזר ההשקעה המרכזי (איור 4F) של Ob נצפה כדוגמה להפחתה קריטית של שיא ה-FFT בהשוואה ל-Lean כאשר קיים שינוי חשוב בהתפלגות המיטוכונדריה.

Figure 1
איור 1: סכימה לניתוח מיטוכונדריאלי בשרירי השלד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. תוכנית זו מסכמת את השלבים העיקריים של הפרוטוקול בשלושה שלבים נפרדים. השלב הראשון, דיסקציה של צרורות סיבי שריר gastrocnemius, מחולק לשלושה שלבים עוקבים, בידוד שריר gastrocnemius, ואחריו דיסקציה מכנית שריר לצרורות כדי סוף סוף לבצע בחירה חזותית של אלה קיימא. השלב השני מורכב מרכישת הדמיה של תאים חיים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי, הכולל דגירה עם פלואורופור (TMRE) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי למקם את הסיבים בתא. לאחר מכן, ההגדרות המתאימות נעשות במיקרוסקופ כדי לבצע את רכישת התמונות הקונפוקליות. בשלב השלישי מתבצע עיבוד תמונה קונפוקלית וניתוח נתונים. החל מעיבוד תמונה, כאשר נדרש סף כדי ליצור תמונות בינאריות שמהן מתבצעים חישובי צפיפות מיטוכונדריאלית והתפלגות מיטוכונדריאלית על ידי FFT. קיצורים: TMRE = tetramethylrhodamine ethyl ester; FFT = התמרת פורייה מהירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיסקציה של צרור שרירי השלד. (A ) ראש גסטרוקנמיוס רוחבי של חולדה מנותח (חץ שחור) בצלוחית פטרי עם תמיסת Relax. (B) תמונה מייצגת של צרורות סיבי שריר gastrocnemius בתמיסת Relax לפני העמסת TMRE. קיצור: TMRE = tetramethylrhodamine ethyl ester. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח צפיפות מיטוכונדריה. (A) איור המייצג את מרחק Z המומלץ לסריקה קונפוקלית של מיטוכונדריה של IMF בסיבי שרירי השלד. (B) סדרה של תמונות קונפוקליות של מיטוכונדריה עמוסות TMRE בסיבי שרירי השלד, שהתקבלו מחולדת צוקר +/+ (רזה) ומחולדת פא/פה של צוקר (Ob) שמנה שתועדו במרחק Z (מעומק של 15 עד 21 מיקרומטר). התמונות עובדו על ידי סף והפכו לתמונות בינאריות. (C) צפיפות מיטו-מחושבת של פרוסות קונפוקליות המתקבלות במרחקי Z שונים שנצפו בלוח B. (D) צפיפות המיטו-צפיפות המתקבלת מהערימה שמורכבת מהתמונות שנצפו בלוח B. התמונות בלוח B הן בגודל 65 x 50 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: צפיפות מיטו-צפיפות = צפיפות מיטוכונדריאלית; IMF = מיטוכונדריה intermyofibrillar; Ob = השמנת יתר; SSM = מיטוכונדריה subsarcolemmal. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח התפלגות מיטוכונדריאלית על-ידי FFT. תמונות קונפוקליות מייצגות של מיטוכונדריה טעונות במחוון הפלואורסצנטי TMRE שנרכשו בעומק 21 מיקרומטר מעומק סיבי שריר השלד שהתקבלו מחולדת צוקר +/+ מאומצת (Lean, לוח A) ומחולדת פא /פא שמנה של צוקר (Ob, לוח B). התמונות עובדו על ידי סף והפכו לתמונות בינאריות. החזר השקעה רוחבי ומרכזי מלוח A (לוח C) ומלוח B (לוח D) עם פרופילי העלילה המתאימים שלהם של עוצמת פלואורסצנטיות (חלקה עליונה) וספקטרום FFT (חלקה תחתונה). FFT חושב מתוך ROI עם רוחב של 256 פיקסלים, המתאים לגודל ROI של 39 x 5 מיקרומטר בלוח A וגודל ROI של 50 x 5 מיקרומטר בלוח B. לוח E מראה את ההבדלים של ספקטרום FFT שנמצא בין מיטוכונדריה שמקורם בחולדות Lean ו-Ob בהחזר ההשקעה הצידי, ואילו לוח F מראה את ההבדלים של ספקטרום FFT של החזר השקעה מרכזי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: A.U. = יחידות שרירותיות; FFT = התמרת פורייה מהירה; ROI = אזורי עניין; Ob = השמנת יתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מגיב ריכוז סופי ב 100 מ"ל מניות 
קיי-אספרטט 100 מ"מ
KCl 20 מ"מ
HEPES 20 מ"מ
L-חומצה גלוטמית 3 מ"מ
חומצה מאלית 3 מ"מ
EGTA 0.1 מ"מ 10 מ"מ
MgCl2 1 mM חינם מ"ג2+
CaCl2 0.00002 mM חינם Ca2+
פוספוקריאטין די-נא 5 מ"מ 500 מ"מ
קריאטין פוספוקינאז 5 U/מ"ל 200 U/מ"ל
MgATP 5 מ"מ
pH 7.3 (עם NaOH)

טבלה 1: ריאגנטים של תמיסת הרפיה וריכוז.

איור משלים S1: השפעת שיטות עיבוד מקדים של תמונה. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של מיטוכונדריה טעונות במחוון הפלואורסצנטי TMRE שנרכשו בעומק של 18 מיקרומטר בסיבי שרירי השלד שהתקבלו מחולדת צוקר +/+ (רזה, פאנל עליון) ומחולדת פא/ פא שמנה של צוקר (פאנל תחתון), יחד עם התמונות שלהן שהתקבלו לאחר עיבוד מקדים באמצעות סף Otsu, מסנן החציון וסף Otsu, ודה-קונבולוציה דו-ממדית וסף אוטסו. (B) תרשים פרופיל של צפיפות מיטו-צפיפות המתקבלת מתמונות קונפוקליות (לוח A) לאחר עיבוד מקדים בשיטות שונות. גודל התמונות בלוח A הוא 65 x 50 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: 2D-Decon = 2D deconvolution; צפיפות מיטו-צפיפות = צפיפות מיטוכונדריאלית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

מיטוכונדריה הם אברונים עם יכולת שיפוץ גבוהה. ניתן לשנות במהירות את התוכן, הצפיפות והתפוצה שלהם באמצעות הפעלת מנגנוני האיחוי והביקוע של המיטוכונדריה, המכונים דינמיקה מיטוכונדריאלית1, והאיזון בין מנגנוני התחלופה של המיטוכונדריה: הביוגנזה המיטוכונדריאלית ומסלול פירוק המיטוכונדריה המיוחד, מיטופגיה21,22. התוכן והמורפולוגיה של המיטוכונדריה יכולים להשתנות בהתאם לסוג התא ולשלב ההתפתחות וניתן לעצב אותם מחדש תחת גירויים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים 17,22,23,24. לכן, המחקר של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית היה רלוונטי במשך יותר מחצי מאה25. יש לציין כי ניתוח מיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים היה הטכניקה הסטנדרטית שיושמה במחקרים רבים26.

מחקרים פלואורסצנטיים במיקרוסקופ קונפוקלי צברו רלוונטיות בשנים האחרונות בשל יכולתם להדמיית תאים חיים של מיטוכונדריה בעומקי סיבים שונים, מה שיכול לעזור להבין טוב יותר את תפקיד המיטוכונדריה בשרירי השלד בתנאים אדפטיביים ולא מסתגלים שונים27. במחקר זה מתוארת מתודולוגיה לניתוח צפיפות ופיזור המיטוכונדריה בסיבי שריר שלד חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. אחד האתגרים העיקריים בעבודה עם סיבי שריר שלד חיים הוא למנוע התכווצות מתהליכי הבידוד ועד לרישום הקונפוקלי של המיטוכונדריה. כדי להשיג מטרה זו, תמיסת Mg ו- ATP Relaxגבוהה 17 משמשת לשמירה על הסיבים רגועים למשך שעתיים לפחות, מה שנותן מספיק זמן לבצע את תהליך בידוד הסיבים, עומס הפלואורופור ורכישת אות מיטוכונדריאלי במיקרוסקופ קונפוקלי. נקודה קריטית בפרוטוקול היא השגת הסיבים באופן מכני מכיוון שהוא דורש דיוק גבוה ורקמות טריות; עם זאת, ניתן להשיג חבילות סיבים קיימא משריר חולדה עם טכניקה זו ששימשה בעבר ודווחה28. השגת סיבים שלמים מאפשרת לשמר את הסרקולמה ואת הסביבה התוך-תאית, תוך שמירה על האינטראקציה המטבולית והתפקודית בין מבני התא28,29.

שלא כמו עבודה עם רקמות או תאים קבועים, רכישת תמונות פלואורסצנטיות של הדמיה של תאים חיים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי מאפשרת ניטור בזמן אמת של ההשפעה של תנאי ניסוי מגוונים. הפרוטוקול הנוכחי יכול לשמש כדי לחקור שינויים בצפיפות ובחלוקה של המיטוכונדריה בזמן אמת ולחקור הבדלים בין קבוצות ניסוי, כמו למשל הדוגמאות שמוצגות כאן בין סיבים רזים לסיבים שמקורם ב-Ob (איור 3 ואיור 4). זה תמיד צריך להיחשב כי הדמיה של תאים חיים מרמז סטנדרטיזציה של תנאי עבודה אופטימליים עם נזק קל לתאים. זמן העבודה, איכות הפתרונות המשמשים, פרמטרי הרכישה וחשיפת הלייזרים חייבים להיות מבוקרים היטב. לפיכך, שיקולים מהותיים מוזכרים להלן.

מיטוכונדריה של סיבי שריר לא ניתן לרשום באופן אורכי לחלוטין על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי בשל גודל הסיב ואת הנזק של הסיב שיכול להיגרם על ידי חשיפה ארוכה לייזר. עם זאת, מדגם מייצג של הסיבים נרשם תחת טכניקה זו. למרות שניתן להקליט את כל עובי סיבי שריר השלד של חולדה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי, זה מרמז על זמן הקלטה ארוך יותר וחשיפה לקרן הלייזר. במקרה של חולדות ביקורת, לא נתקלו בבעיות עם הקלטות אלה. עם זאת, סיבים מתנאים פתולוגיים עשויים להיות רגישים יותר לנזק כפי שנצפה בסיבים מחולדות אוב. כתוצאה מכך, עדיף לרכוש ערימה של תמונות קונפוקליות מייצגות המתקבלות במרחקי Z שונים. כאשר נרשם רק קטע מעובי הסיבים, מומלץ לקחת את הערימה באותו עומק על כל הסיבים שנבדקו, שכן פיזור וצפיפות המיטוכונדריה יכולים להשתנות בהתאם למיקומו בתוך הסיב. רכישת האות בעומק מעל 15 מיקרומטר מומלצת לקבלת תמונות קונפוקליות מייצגות של קרן המטבע הבינלאומית, תוך הימנעות מאוכלוסיות SSM הממוקמות קרוב לפריפריה.

במהלך הרכישה הקונפוקלית יש לקחת בחשבון כמה שיקולים חשובים. ראשית, בחירת עדשת הטבילה האובייקטיבית בהתחשב בהגדלה, NA גבוה ומדיום טבילה. מכיוון שהתאים נשמרים בתווך דגירה הידרופילי, מדד השבירה של מדיום הדגירה והטבילה חייב להיות דומה כדי לקבל אות טוב ולסרוק עמוק לתוך הרקמה. מושגת בדרך כלל באמצעות עדשה אובייקטיבית טבילה במים. תמונות קונפוקליות של איור 3 ואיור 4 נרכשו עם יעד טבילה במים של 20x, 0.7 NA. מטרה זו מאפשרת תיעוד של הסיב בכל עומקו, אך הוחלט על סריקה ב-15, 18 ו-21 מיקרומטר, שכן ניתן לקבל תמונות קונפוקליות מייצגות של קרן המטבע הבינלאומית עם אות בעוצמה פלואורסצנטית גבוהה ונזק קל לסיבים. ניתן לשקול הגדלה אחרת, כגון פי 40 ושמן כמדיום טבילה, אך יש צורך להעריך אותה.

שנית, גודל הפיקסלים לרכישת הדמיה מחושב על פי משפט נייקוויסט, המאפשר בחירה של גודל פיקסל מתאים המונע דגימת יתר (חשיפה גבוהה יותר ללייזר) ותת-דגימה (מוביל לרזולוציה נמוכה יותר)30. החישוב תלוי במאפייני העדשה האובייקטיבית שנבחרה ובאורך הגל (~90 ננומטר). זה יכול להיות מותאם עם זום; לכן, הגדרת זום אחת בלבד מספקת גודל פיקסלאופטימלי 30. עם זאת, בפועל, הזום תלוי גם באזור הדגימה שיש לנתח. לכן, מציאת איזון מאפשרת עבודה עם גודל פיקסל הקרוב ביותר לקריטריון Nyquist וזה גם מתאים לאזור להיות מנותח. איור 3 ואיור 4 נרכשו בגודל פיקסלים של 150 ו-190 ננומטר, מה שאיפשר ניתוח של הרוחב המלא של הסיב שהוא ~50-80 מיקרומטר.

שלישית, יש להשתמש בקוטר חור סיכה מתאים המונע מאור שאינו ממוקד להגיע לגלאי. בדרך כלל, 1 איירי נחשב לגודל חור הסיכה האופטימלי מכיוון שהוא מאפשר זיהוי של ~80% מהפוטונים שמקורם במישור מיקוד30. עם זאת, כמה דגימות ביולוגיות מוכתמות המראות רמות פלואורסצנטיות נמוכות דורשות עלייה של חור סיכה30. תמונות קונפוקליות של איור 3 ואיור 4 נרכשו עם חור סיכה בגודל 3 איירי עקב אות נמוך שצולם עם אוורירי נמוך יותר. חשוב לקחת בחשבון כי העלייה בעוצמת האות הנובעת מהגדלת גודל חור הסיכה מובילה להפחתת הרזולוציה עקב עלייה באור שנלכד מחוץ לפוקוס. מסיבה זו, המלצנו להשתמש בגודל חור סיכה קרוב ככל האפשר לאוורירי אחד.

כאשר הן נרכשות כראוי, ניתן לעבד תמונות קונפוקליות כדי לקבל מידע כמותי על צפיפות ופיזור המיטוכונדריה. בכל מקרה, שלב תמונת העיבוד הקריטי של הסף צריך להתבצע לפני הניתוח כדי לשפר את כימות האות. במהלך שלב מכריע זה, מוגדר ערך עוצמת הפלואורסצנטיות המפריד בין הפיקסלים החיוביים במיטוכונדריה לבין אלה שברקע. ניתן להגדיר את הסף על ידי התאמה גאוסיאנית של הפסגה המייצגת מיטוכונדריה כאשר ההיסטוגרמה של התמונה מציגה שתי פסגות, אחת המתאימה לרקע והשנייה למיטוכונדריה. עם זאת, התפלגות בימודאלית לא תמיד מושגת בכל אחת מהתמונות, ולכן יש ליישם שיטות סף אחרות.

בפרוטוקול זה מתואר יישום הסף של אוטסו, שהוא שיטה לא פרמטרית ולא מפוקחת שנועדה למצוא את ערך הסף כאשר שתי הפסגות אינן מופרדות, או כאשר פסגות אחרות קיימות31. ניתן ליישם את Otsu בקלות באמצעות פלטפורמת קוד פתוח לניתוח ביולוגי-תמונה; עם זאת, ניתן לבדוק שיטות סף אחרות. אותה שיטת סף חייבת להיות מיושמת על כל התמונות הקונפוקליות ויש לחשב אותה באופן עצמאי עבור כל תמונה קונפוקלית. החלת הסף על ערימה שלמה מובילה לתוצאות שגויות. לאחר קבלת התמונות הבינאריות לאחר תהליך הסף, ניתוח צפיפות המיטוכונדריה ו- FFT יכול להתבצע בקלות על ידי ביצוע ההוראות המתוארות בפרוטוקול זה. עם זאת, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע שני הניתוחים כדי להימנע מהכללת גרעינים ונימים, שכן זה יוביל לטעויות כימות. לגבי צפיפות, זה מספיק כדי להחסיר את הפיקסלים, או את השטח הכבוש על ידי גרעינים או נימים, מן הפיקסלים או השטח הכולל להיות מנותח. בנוסף, בעת ביצוע ניתוח FFT, יש לוודא כי אות המיטוכונדריה הוא ישר. לעומת זאת, כאשר אות המיטוכונדריה מוטה, הוא יכול לייצר פרופילים שאינם מייצגים את התפלגות האורך של המיטוכונדריה, מה שמניב נתוני ספקטרום FFT שגויים. בנוסף, ניתן להחיל שלב עיבוד מראש כדי להפחית את הרעש בתמונות. פרוטוקול זה מתאר שני שלבים אופציונליים לעיבוד מקדים באמצעות מסנן חציוני ודה-ממד דה-ממד. ההשפעות של שיטות עיבוד מקדים אלה על התמונה ותכולת צפיפות המיטוכונדריה מוצגות באיור משלים S1. חשוב לקחת בחשבון שבעוד שתהליכים מקדימים אלה יכולים לשפר את איכות התמונה, הם יכולים גם לגרום לאובדן של פרטים מסוימים בתמונה. לכן, יש להשתמש בהם בזהירות ולהחיל באופן עקבי על כל התמונות המנותחות.

למרות יתרונותיו, מיקרוסקופ קונפוקלי מוגבל על ידי רזולוציה לרוחב (XY) של 180-250 ננומטר כאשר התנאים האופטימליים לרכישה מיושמים32. קוטר המיטוכונדריה הוא ~ 200-700 ננומטר, קרוב לגבול העקיפה של מיקרוסקופ קונפוקלי; לפיכך, מבנים תת-מיטוכונדריאליים אינם ניתנים לזיהוי הולם33 ולא ניתן להעריך אותם על ידי ניתוחי צפיפות ו-FFT המוצגים בפרוטוקול זה. ניתן לחקור טכניקות אחרות של מיקרוסקופיה ברזולוציית על, כגון מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), ננוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED) או מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), כדי לפתור מבנים תת-מיטוכונדריאליים32. בפרוטוקול זה, התמונות הקונפוקליות של המיטוכונדריה מתקבלות באמצעות פלואורופור TMRE, אשר תלוי בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. לכן, עוצמת הפלואורסצנטיות של המיטוכונדריה יכולה להשתנות בהתאם לפוטנציאל הממברנה שלהם. תהליך סף מתבצע לפני ניתוח הנתונים כדי להתגבר על בעיה זו. כל הפיקסלים מעל סף מוגדר נחשבים חיוביים לאות מיטוכונדריאלי ללא תלות בערך הפלואורסצנטי שלהם. עם זאת, יש לציין כי מיטוכונדריה עם פוטנציאל קרום נמוך מאוד לא ניתן לפתור עם טכניקה זו. לכן, מחקרים משלימים של כימות תכולת חלבון מיטוכונדריאלי מומלץ. יתרון בשימוש ב-TMRE הוא שניתן להשתמש בתמונות קונפוקליות גם לניתוח פוטנציאלי של קרום המיטוכונדריה, אך יש לבצע בקרות נאותות עם חומרי פירוק צימוד, כגון קרבוניל-ציאניד-p-טריפלואורומתוקסיפנילהידראזון (FCCP). בנוסף, ניתן להשיג את ההוראות לניתוח צפיפות ופיזור המיטוכונדריה באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים ירוקים למיטוכונדריה, אשר מעמיסים מיטוכונדריה ללא קשר לפוטנציאל הממברנה שלהם, אך אסטרטגיית הדגירה והגדרות הרכישה הקונפוקלית צריכות להיות סטנדרטיות.

בהתחשב בכך שמבנה המיטוכונדריה קשור לתפקודים מיטוכונדריאליים ותאיים חיוניים, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לספק מידע רב ערך על עיצובם מחדש במהלך מחלה או על ידי עלבון לחץ מסוים. זה יכול לתרום להבנה טובה יותר של תפקודים מרכזיים של שרירי השלד הנשלטים על ידי מיטוכונדריה, כגון ייצור אנרגיה, או שבהם מיטוכונדריה ממלאים תפקיד חשוב באינטראקציה עם אברונים אחרים, כגון צימוד כיווץ-מטבוליזם. ביצוע הוראות הפרוטוקול מאפשר להעריך את צפיפות ופיזור המיטוכונדריה בשרירי השלד החי. שלבי הפרוטוקול מחולקים לשלושה שלבים עיקריים המתמקדים בדיסקציה של צרור שרירי השלד, סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח תמונה, בהם נכללות הוראות מפורטות ושיקולים חשובים. יש לציין כי ניתן לבצע אופטימיזציה נוספת של הפרוטוקול כדי לחקור שלבי Z נוספים לשחזור מיטוכונדריאלי מלא בתוך הסיב בהתאם לצרכי המשתמש. לדוגמה, ניתן לבחון את התמונה הקונפוקלית ואת שלבי הניתוח כדי לחקור מבנים תאיים בעלי התפלגות דומה, כגון TT בדגימות חיות וקבועות.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר לרפואה והמכון לחקר השמנת יתר של Tecnologico de Monterrey. איור 3A נוצר באמצעות תוכנת Scientific Image and Illustration.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A6419
Borosilicate glass coverslip Warner Instruments 64-0709
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670
Confocal microscope Leica TCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite  Leica 2.7.3.9723
Creatine Phosphokinase Sigma-Aldrich C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate Sigma-Aldrich 11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Forceps Miltex MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective  Leica 506517
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iris scissors Miltex 5-304
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
Maxchelator UC Davis Health https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm 
Micro scissors Miltex 18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji  Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji https://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ 
Recording chamber Warner Instruments RC-27N
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Spreadsheet Microsoft Excel Microsoft 
Stereo microscope Zeiss Stemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl ester Invitrogen T669

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
  2. De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. Skeletal muscle mitochondria in health and disease. Cell Calcium. 94, 102357 (2021).
  3. Chang, C. R., Blackstone, C. Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1. Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).
  4. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305 (2021).
  5. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role. Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).
  6. Díaz-Vegas, A. R., et al. Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism. Frontiers in Physiology. 9, 791 (2018).
  7. Boncompagni, S., et al. Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures. Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).
  8. Reggiani, C., Marcucci, L. A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers. The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167 (2022).
  9. Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).
  10. Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skeletal Muscle. 1 (1), 26 (2011).
  11. Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).
  12. Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes. Life Sciences. 264, 118700 (2021).
  13. Song, L. S., et al. Orphaned ryanodine receptors in the failing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).
  14. Houzelle, A., et al. Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity. Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).
  15. Call, J. A., et al. Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).
  16. Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging. Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).
  17. Rivera-Alvarez, I., et al. A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers. Life Sciences. 256, 117965 (2020).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).
  19. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  20. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  21. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  22. Meinild, L. A. -K., et al. Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis. Acta Physiologica. 222 (1), (2018).
  23. Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. Exercise and mitochondrial health. Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).
  24. Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases. Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).
  25. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  26. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  27. Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization. Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).
  28. Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
  29. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles. International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252 (2022).
  30. Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer, Boston, MA. (2006).
  31. Otsu, N. A. Threshold selection method from gray-level histogram. IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  32. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  33. Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. Light microscopy of mitochondria at the nanoscale. Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 202
ניתוח צפיפות המיטוכונדריה והתפלגות האורך בסיבי שריר שלד חי של חולדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pérez-Treviño, P.,… More

Pérez-Treviño, P., Nieblas, B., López-Vaquera, S. R., García, N. Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65306, doi:10.3791/65306 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter