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Biology

Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा चूहे लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर में माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और अनुदैर्ध्य वितरण का विश्लेषण

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65306
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3
1Experimental Medicine and Advanced Therapies, The Institute for Obesity Research, Tecnologico de Monterrey, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Preclinical Research Unit, Tecnologico de Monterrey

Summary

यहां, हम माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्कैनिंग के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाइव-कंकाल मांसपेशी इमेजिंग द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और अनुदैर्ध्य वितरण में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियन एक अंग है जिसे कोशिकाओं की चयापचय आवश्यकताओं के अनुसार लम्बी, खंडित और पुनर्निर्मित किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की रीमॉडेलिंग स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया को सेलुलर मांगों को पूरा करने की अनुमति देती है; हालांकि, इस क्षमता का नुकसान विभिन्न विकृति विज्ञान के विकास या प्रगति से संबंधित रहा है। कंकाल की मांसपेशियों में, माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और वितरण परिवर्तन शारीरिक और रोग स्थितियों जैसे व्यायाम, उम्र बढ़ने और मोटापे में देखे जाते हैं। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का अध्ययन उन स्थितियों से संबंधित तंत्र की बेहतर समझ प्रदान कर सकता है।

यहां, चूहों से लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर के माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। फाइबर मैन्युअल रूप से एक आराम समाधान में विच्छेदित कर रहे हैं और mitochondria (tetramethylrhodamine एथिल एस्टर, TMRE) के एक फ्लोरोसेंट लाइव सेल इमेजिंग सूचक के साथ ऊष्मायन कर रहे हैं. माइटोकॉन्ड्रिया सिग्नल को इंटरमायोफिब्रिलर माइटोकॉन्ड्रियल (आईएमएफ) नेटवर्क की कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए एक्सवाईजेड स्कैन मोड का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा रिकॉर्ड किया जाता है। उसके बाद, कॉन्फोकल छवियों को थ्रेसहोल्डिंग और बिनाराइजेशन द्वारा संसाधित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया के लिए सकारात्मक पिक्सेल के लिए द्विरहित कॉन्फोकल छवि खाते हैं, जिन्हें तब माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व प्राप्त करने के लिए गिना जाता है। कंकाल की मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को आईएमएफ आबादी के उच्च घनत्व की विशेषता है, जिसमें टी-नलिकाओं (टीटी) के समान आवधिक अनुदैर्ध्य वितरण होता है। फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) एक मानक विश्लेषण तकनीक है जो टीटी के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए की जाती है जो वितरण आवृत्ति और उनके संगठन के स्तर को खोजने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में, एफएफटी एल्गोरिथ्म के कार्यान्वयन को कंकाल की मांसपेशी में अनुदैर्ध्य माइटोकॉन्ड्रियल वितरण के विश्लेषण के लिए वर्णित किया गया है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक गतिशील नेटवर्क बनाते हैं जो मुख्य रूप से इसके बढ़ाव (संलयन) और विखंडन (विखंडन)1,2के बीच संतुलन द्वारा विनियमित होते हैं, जो मिटोफसिन 1 और 2 (एमएफएन 1 और एमएफएन 2) जैसे प्रोटीन की अभिव्यक्ति और गतिविधि द्वारा संशोधित होते हैं, और ऑप्टिक प्रोटीन शोष 1 (Opa1), जो बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली और आंतरिक झिल्ली के संलयन को नियंत्रित करते हैं, क्रमशः 1,2। डायनामिन से संबंधित प्रोटीन (Drp1) मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन को नियंत्रित करता है जब इसे Ser6163 में फॉस्फोराइलेट किया जाता है।

कंकाल की मांसपेशी में, यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को विभिन्न सेल क्षेत्रों (मायोफिब्रिल, सरकोलेममा और नाभिक)4,5के निकटता के आधार पर संरचनात्मक रूप से अच्छी तरह से परिभाषित उप-जनसंख्या में व्यवस्थित किया गया है। सरकोलेममा के ठीक नीचे स्थित उन माइटोकॉन्ड्रिया को सबसरकोलेमल माइटोकॉन्ड्रिया (एसएसएम) कहा जाता है, जो सिकुड़ा हुआ फिलामेंट्स के बीच स्थित होते हैं उन्हें इंटरमायोफिब्रिलर माइटोकॉन्ड्रिया (आईएमएफ) कहा जाता है, और नाभिक के चारों ओर माइटोकॉन्ड्रियल उप-जनसंख्या को पेरिन्यूक्लियर माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क (पीएमएन) कहा जाता है। इसके अलावा, यह सुझाव दिया गया है कि इन माइटोकॉन्ड्रियल उप-जनसंख्या में क्षेत्र-विशिष्ट कार्य होते हैं और चयापचय रूप से विशिष्ट 4,5 होते हैं।

सेलुलर ऊर्जा होमियोस्टेसिस का रखरखाव, जो चयापचय और सिकुड़ा समारोह की अनुमति देता है, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क (जैसे, आईएमएफ और एसएसएम इंटरैक्शन)4,6के माध्यम से विशिष्ट साइटों पर बातचीत और संचार पर काफी हद तक निर्भर करता है। माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क इंटरैक्शन के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियन अन्य जीवों के साथ भी बातचीत कर सकता है, जिससे संरचनात्मक और कार्यात्मक परिसर बन सकते हैं। इस संबंध में, यह दिखाया गया है कि आईएमएफ सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) के निकट स्थित हो सकता है और अनुप्रस्थ नलिकाओं (टीटी) 7 द्वारा गठित सीए2+ रिलीज इकाइयों (सीआरयू) के निकटता में हो सकता है। एटीपी संश्लेषण और एपोप्टोसिस को विनियमित करने में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज की भूमिका के कारण यह तथ्य प्रासंगिक है। हाल ही में, साइटोसोलिक सीए को विनियमित करने में एक संभावित भूमिका 2+ यात्रियों को भी8 का सुझाव दिया गया है।

टीटी सरकोलेममा के आक्रमण हैं जिनका आईएमएफ वितरण5 के समान कार्डियोमायोसाइट्स और कंकाल मांसपेशी फाइबर 9,10 के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ आवधिक वितरण होता है। टीटी के वितरण में परिवर्तन के महत्वपूर्ण शारीरिक निहितार्थ हैं, जो सिकुड़ा समारोह में उनकी भूमिका को देखते हैं। हालांकि, इन परिवर्तनों का मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स में मूल्यांकन किया गया है। फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) विश्लेषण का उपयोग दूरी डोमेन से आवृत्ति डोमेन में आवधिक संकेतों के रूपांतरण की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप एक एफएफटी स्पेक्ट्रम होता है जो आवृत्ति और सिग्नल11,12,13की नियमितता को इंगित करता है। हालांकि वहाँ सबूत है कि कंकाल की मांसपेशी फाइबर में mitochondrial नेटवर्क के संगठन विभिन्न चयापचय स्थितियों के लिए अनुकूलन के लिए आवश्यक है, मांसपेशियों की चोट14,15 के बाद उत्थान के दौरान के रूप में, सबसे विश्लेषण गुणात्मक प्रदर्शन कर रहे हैं.

इसके अतिरिक्त, यह देखते हुए कि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई कंकाल की मांसपेशियों से संबंधित (जैसे, शोष का उपयोग न करें)2 और गैर-मांसपेशी रोगों, विशेष रूप से चयापचय रोगों, और मांसपेशियों के द्रव्यमान (यानी, शोष)16के संबद्ध नुकसान से जुड़ा हुआ है, कंकाल की मांसपेशी में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क और वितरण का मात्रात्मक मूल्यांकन प्रासंगिकता लेता है। हाल ही में, एक मोटे समूह के बीच गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी फाइबर के माइटोकॉन्ड्रिया के अनुदैर्ध्य वितरण में एक महत्वपूर्ण अंतर (ओबी; फ , और एक दुबला समूह (दुबला; जकर +/+ चूहों) की पहचान एफएफटी17 के माध्यम से की गई थी। इस अध्ययन ने माइटोकॉन्ड्रियल वितरण का विश्लेषण करने में एफएफटी की उपयोगिता का प्रदर्शन किया। इसलिए, इस प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त छवियों से रहते कंकाल मांसपेशी फाइबर में माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करता है. माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व को पृष्ठभूमि थ्रेसहोल्डिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है, और एफएफटी विश्लेषण द्वारा अनुदैर्ध्य माइटोकॉन्ड्रियल वितरण का विश्लेषण भी वर्णित है। एक वर्कफ़्लो योजना चित्रा 1 में प्रस्तुत की गई है।

Protocol

सभी पशु प्रयोग प्रक्रियाओं का मूल्यांकन और अनुमोदन Tecnologico de Monterrey (प्रोटोकॉल 2019-007) की पशु उपयोग और देखभाल समिति (CICUAL) द्वारा किया गया था। इस अध्ययन के लिए 12 से 13 सप्ताह की आयु के नर जकर (+/+ और एफए/एफए) चूहों का उपयोग किया गया था। जानवरों को मानक पालन स्थितियों (12 एच / 12 एच प्रकाश / अंधेरे चक्र, 40-60% आर्द्रता) में रखा गया था और भोजन (मानक चूहा चाउ) और पानी एड लिबिटम तक पहुंच थी।

1. समाधान संरचना

  1. तालिका 1 में दिखाए गए घटकों को मिलाकर ताजा आराम समाधान तैयार करें। सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) का उपयोग करके पीएच को 7.3 पर समायोजित करें।
  2. मुक्त धातु एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक सिमुलेशन कार्यक्रम का उपयोग करके आराम समाधान में मुक्त कैल्शियम एकाग्रता की गणना करें।
  3. डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में 5 एमएम टेट्रामेथिलरहोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरई) स्टॉक और डीएमएसओ में 0.1 एमएम के बाद के कमजोर पड़ने को तैयार करें।

2. गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी फाइबर बंडलों का विच्छेदन

  1. प्रेरण कक्ष के अंदर जानवर प्लेस और ढक्कन बंद. ऑक्सीजन स्रोत को चालू करें, गैस प्रवाह दर को 0.5 एल/मिनट पर सेट करें, और एनेस्थीसिया को प्रेरित करने के लिए वेपोराइज़र को 4% सेवोफ्लुरेन पर सेट करें।
  2. चूहे सो रहा है, जबकि संज्ञाहरण बनाए रखने के दौरान एक लापरवाह स्थिति में कक्ष के बाहर जगह है. सजगता की कमी को सत्यापित करने के लिए पैर की अंगुली या पूंछ को पिंच करें।
  3. कैंची के साथ, पेट की त्वचा और मांसपेशियों के माध्यम से कटौती। फिर, दिल तक पहुंच प्राप्त करने के लिए वक्ष पिंजरे को काट लें।
  4. एक Cardiectomy प्रदर्शन करने के लिए, ऊपरी नसों और संदंश के साथ धमनियों से दिल समझ और कैंची के साथ रक्त वाहिकाओं में कटौती. दिल को हटा दें।
  5. इच्छामृत्यु के तुरंत बाद, इथेनॉल के साथ हिंदलिंब कीटाणुरहित करें और शेविंग मशीन का उपयोग करके इसे शेव करें।
  6. हिंदफुट को पकड़ें और अकिलीज़ कण्डरा के स्तर पर त्वचा के माध्यम से कैंची से चीरा लगाएं।
  7. समीपस्थ टिबिया के स्तर पर कैंची के साथ hindlimb काटें। इसे 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 3 एमएल बर्फ-ठंडा आराम समाधान एक पृष्ठीय स्थिति में हो। मांसपेशियों को सूखने से रोकने के लिए इसे पर्याप्त घोल से ढक दें।
  8. Achilles कण्डरा की पहचान, ध्यान से संदंश के साथ यह बढ़ाने, और परितारिका कैंची के साथ हड्डी से दूर मांसपेशियों काटना. विच्छेदन के आगे इस कदम से एक stereomicroscope का प्रयोग करें.
  9. पूरे गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को पहचानें और अलग करें, जो कि हिंडलिंब के पीछे मुख्य थोक है।
  10. काटना और ठीक टिप संदंश के साथ मांसपेशियों के आसपास संयोजी और वसा ऊतक त्यागें. मांसपेशियों के पार्श्व सिर को बर्फ-ठंडा आराम समाधान के साथ एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें ( चित्र 2A देखें)।
  11. धीरे एक छोर से संदंश के साथ मांसपेशियों पकड़ और ध्यान से microscissors के साथ बंडलों में अलग. हमेशा धीरे संदंश के साथ एक छोर पर उन्हें पकड़ द्वारा बंडलों में हेरफेर.
    नोट: बंडल लगभग 10 मिमी लंबे और 2 मिमी चौड़े हैं।
  12. फाइबर बंडलों को बर्फ-ठंडा आराम समाधान के 2 एमएल के साथ एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। केवल उन लोगों का चयन करें जिनके पास एक चिकनी उपस्थिति है, एक छोर से दूसरे छोर तक पूर्ण हैं, और छोटा नहीं हैं (चित्र 2बी)।

3. कंकाल की मांसपेशी में माइटोकॉन्ड्रिया का लाइव-सेल इमेजिंग अधिग्रहण कंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा

  1. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए आराम समाधान में 2.5 × 10-4 मिमी टीएमआरई में फाइबर सेते हैं।
    नोट: टीएमआरई की अनुशंसित कामकाजी सांद्रता के साथ, यह एक गैर-शमन मोड में होने की उम्मीद है। इस बिंदु से प्रकाश जोखिम से बचाएं।
  2. इनक्यूबेशन समय के दौरान:
    1. कन्फोकल माइक्रोस्कोप मानक सॉफ़्टवेयर खोलें, कॉन्फ़िगरेशन फ़्रेमवर्क का चयन करें, और हार्डवेयर कॉन्फ़िगरेशन संवाद बॉक्स में लेज़र चुनें और HeNe 543 विकल्प की जाँच करें।
    2. अधिग्रहण ढांचे में, अधिग्रहण संवाद बॉक्स का चयन करें, और अधिग्रहण मोड में, XYZ पैनल का चयन करें।
    3. XY संवाद बॉक्स में, 512 x 512 प्रारूप, 400 हर्ट्ज गति का चयन करें और पिनहोल पैनल की जांच करें। प्रदर्शित पिनहोल संवाद बॉक्स में, इकाई के लिए AU चुनें और पिनहोल के लिए 3 हवादार का मान जोड़ें।
      नोट: 1 हवादार इष्टतम मानदंड के निकटतम पिनहोल आकार को कम करने पर विचार करें, यदि पर्याप्त प्रतिदीप्ति संकेत संरक्षित है।
    4. बीम पथ सेटिंग्स संवाद बॉक्स में, 20x के जल विसर्जन उद्देश्य और 0.7 (20x/0.7 IMM) के संख्यात्मक एपर्चर (NA) का चयन करें, और 576-700 एनएम की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य विंडो का चयन करें। 543 लेजर के लिए DD488/543 और 15% लेजर शक्ति का चयन करें।
      नोट: लाइव इमेजिंग स्कैनिंग के लिए एक जल विसर्जन उद्देश्य लेंस की जोरदार सिफारिश की जाती है (यदि उपलब्ध हो)। चूंकि विसर्जन माध्यम और इनक्यूबेशन माध्यम का एक समान अपवर्तक सूचकांक प्राप्त किया जाता है।
  3. 20 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, इनक्यूबेशन माध्यम को दो बार बदल दें। सुनिश्चित करें कि कन्फोकल छवियों को इनक्यूबेशन के बाद 20-30 मिनट के भीतर प्राप्त किया जाता है।
  4. बोरोसिलिकेट ग्लास के 0.15 मिमी कवरस्लिप के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष तैयार करें।
    नोट: उपलब्ध रिकॉर्डिंग कक्ष के अनुसार कवरस्लिप की मोटाई का चयन करें, यह देखते हुए कि मोटाई आमतौर पर इष्टतम प्रदर्शन के लिए 0.15 से 0.22 मिमी तक होती है।
  5. रिकॉर्डिंग कक्ष में आराम समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें और फाइबर बंडलों को स्थानांतरित करें।
  6. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में, माइटोकॉन्ड्रिया की फ्लोरोसेंट रिकॉर्डिंग के लिए व्यवहार्य फाइबर की पहचान करने के लिए ब्राइटफील्ड मोड का उपयोग करें। व्यवहार्य फाइबर पूर्ण हैं, अनुबंधित नहीं हैं, और एक अक्षुण्ण पट्टी पैटर्न है।
  7. फाइबर बंडलों को एक दूसरे से अलग करें और उन्हें संदंश के साथ संरेखित करें। उन लोगों का चयन करें जो कवरस्लिप के सबसे करीब हैं।
  8. निम्नलिखित पर विचार करते हुए नियंत्रण कक्ष कंसोल में लाभ और ऑफसेट को समायोजित करने के लिए लाइव बटन का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को स्कैन करें:
    1. लगभग 0 मनमानी इकाइयों (A.U.) की पृष्ठभूमि के लिए कम फ्लोरोसेंट तीव्रता मूल्यों का चयन करें.
    2. 100 और 200 A.U के बीच लाभ स्तर का चयन करेंरिकॉर्डिंग सिस्टम की संतृप्ति से बचने के लिए। इसलिए, उच्चतम प्रतिदीप्ति स्तर रिकॉर्ड नहीं करते हैं।
    3. फाइबर की पूरी चौड़ाई प्राप्त करने के लिए 150-190 एनएम के पिक्सेल आकार का चयन करें, XY संवाद बॉक्स में ज़ूम कारक का समायोजन.
      नोट: Nyquist मानदंड (90 एनएम) के करीब पिक्सेल आकार का उपयोग करने पर विचार करें, जो फाइबर की पूरी चौड़ाई की स्कैनिंग की अनुमति देता है।
  9. जेड स्टैक संवाद बॉक्स में, 22 माइक्रोन (अंत बटन) तक 15 माइक्रोन (शुरू बटन) की फाइबर गहराई से शुरू होने वाले प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने के लिए जेड दूरी को समायोजित करें। जेड-चरण आकार के रूप में 3 माइक्रोन का चयन करें।
  10. दबाएं शुरू कन्फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए बटन। गहराई के 15, 18, और 21 माइक्रोन पर अधिग्रहित तीन confocal छवियों से बना एक जेड स्टैक प्राप्त करें.

4. माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व का विश्लेषण

  1. जैविक छवि विश्लेषण18 के लिए ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म में जेड-स्टैक फ़ाइल खोलें और फाइबर को क्षैतिज रूप से रखने के लिए छवियों को घुमाएं, जैसा कि चित्र 3बी में दिखाया गया है।
  2. बेतरतीब ढंग से ब्याज के एक आयताकार क्षेत्र (आरओआई) का चयन करें जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया (आरओआईमिटो) के कब्जे वाला क्षेत्र शामिल है। एक्स के लिए 65 से 90 माइक्रोन तक आरओआईमिटो आकार का चयन करें। वाई के लिए, आकार फाइबर की चौड़ाई पर निर्भर करेगा, इसकी परिधि से परहेज करेगा।
  3. चयनित आरओआई मिटो के साथ जेड-स्टैक को डुप्लिकेट करें और इसे टीआईएफएफ प्रारूप में एक नए जेड-स्टैक (मिटो-स्टैक ) के रूप में सहेजें। ROI प्रबंधक उपकरण के साथ मूल स्टैक पर चयनित ROIमिटो स्थिति सहेजें।
  4. पृष्ठभूमि घटाव के लिए थ्रेशोल्ड की गणना निम्नानुसार करें:
    1. थ्रेशोल्ड संवाद बॉक्स खोलने के लिए शॉर्टकट आदेश+shift+t का उपयोग करें.
    2. थ्रेशोल्ड एल्गोरिथ्म का चयन करें Otsu |बी एंड डब्ल्यू | डार्क बैकग्राउंड विकल्प। ध्यान दें कि छवि अब binarized है।
    3. थ्रेशोल्ड संवाद बॉक्स में, प्रतिदीप्ति तीव्रता वितरण और प्रदर्शित होने वाले थ्रेशोल्ड मान के हिस्टोग्राम का निरीक्षण करें।
      नोट: माइटोकॉन्ड्रिया-पॉजिटिव पिक्सल में थ्रेशोल्ड से अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता मान होते हैं और बाइनरी छवि में सफेद पिक्सेल के रूप में दिखाई देते हैं।
    4. लागू करें का चयन करके बाइनरी छवि स्टैक पर थ्रेशोल्ड लागू करें। प्रदर्शित स्टैक को बाइनरी में कनवर्ट करें संवाद बॉक्स में, प्रत्येक छवि के लिए थ्रेशोल्ड की गणना करें, काली पृष्ठभूमि, नया स्टैक बनाएं और ठीक क्लिक करें विकल्पों का चयन करें.
  5. ध्यान दें कि तीन बाइनरी छवियों के साथ एक स्टैक उत्पन्न होता है (बिनडीएमइटो-स्टैक)। इसे TIFF प्रारूप में सहेजें।
  6. BinDMito-स्टैक में माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व की गणना निम्नानुसार करें:
    1. विश्लेषण मेनू का चयन करें . अगला, हिस्टोग्राम पर क्लिक करें। प्रदर्शित हिस्टोग्राम संवाद बॉक्स में, विश्लेषण के लिए स्टैक की सभी छवियों को शामिल करने के लिए हाँ क्लिक करें.
    2. स्टैक का हिस्टोग्राम संवाद बॉक्स में, हिस्टोग्राम डेटा प्राप्त करने के लिए सूची क्लिक करें. हिस्टोग्राम डेटा को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें।
    3. एक स्प्रेडशीट में, मिटो-पिक्सेल की पहचान करें जो 255 मान वाले हैं। समीकरण (1) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व की गणना करें:
      माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व = Equation 1 × 100 (1)
      कुल पिक्सेल हिस्टोग्राम संवाद बॉक्स में N के रूप में पहचाने जाते हैं या स्प्रेडशीट में हिस्टोग्राम की पिक्सेल गणना को जोड़कर परिकलित किए जाते हैं.
    4. माइटोकॉन्ड्रिया (माइक्रोन2) के कब्जे वाले क्षेत्र की गणना करने के लिए, पिक्सेल आकार से बिनडीएमइटो-स्टैक के मिटो-पिक्सल को गुणा करें।

5. फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल वितरण का विश्लेषण

  1. जैविक छवि विश्लेषण के लिए ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म में, बिनडीएमइटो-स्टैक खोलें और 256 पिक्सल चौड़ाई और 5 माइक्रोन ऊंचाई का आयताकार आरओआई बनाएं। एक केंद्रीय स्थिति में एक आरओआई का पता लगाएँ और एक पार्श्व स्थिति में दूसरा, जैसा कि चित्र 4ए, बी में दिखाया गया है।
  2. FFT विश्लेषण के लिए ROI को कॉन्फ़िगर करने और इसे सहेजने के लिए ROI प्रबंधक टूल का उपयोग करें।
    नोट: विश्लेषण की आवश्यकताओं के अनुसार, अन्य आरओआई को विभिन्न पदों पर चुना जा सकता है, और उनके आकार को संशोधित किया जा सकता है। फिर भी, एफएफटी करने के लिए चौड़ाई 2एन पिक्सल के बराबर होनी चाहिए (उदाहरण के लिए, 128, 256, 512 पिक्सेल)।
  3. शॉर्टकट कमांड + k का उपयोग करके ROI की प्लॉट प्रोफ़ाइल प्राप्त करें और डेटा को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें।
  4. स्प्रेडशीट में, प्लॉट प्रोफ़ाइल से प्राप्त डेटा के साथ B और C कॉलम भरें। बी कॉलम में माइक्रोन में दूरी होती है, और सी कॉलम प्रतिदीप्ति तीव्रता (एयू) के संबंधित ग्रे मान होता है।
  5. डी कॉलम एफएफटी आवृत्ति (घटना/माइक्रोन) से मेल खाता है, जिसे निम्नानुसार भरा जाएगा:
    1. प्रतिचयन आवृत्ति (Fs) की गणना करें: Fs = 1/Δ d, जहाँ Δ d दूरी चरण (B का दूसरा मान) है।
    2. Δ Fs की गणना करें: Δ Fs= Fs/N, जहाँ N B (256) के डेटा बिंदुओं की संख्या है।
    3. FFT आवृत्ति (S) के स्टॉप वैल्यू की गणना करें : S = (N/2) ×ΔFs।
    4. D स्तंभ निम्नानुसार भरें:
      1. D स्तंभ का पहला मान 0 के बराबर है.
      2. डी कॉलम में दूसरे सेल का चयन करें, होम मेनू पर जाएं, भरें का चयन करें और श्रृंखला पर क्लिक करें। स्तंभों का चयन करें. चरण मान के लिए, परिकलित Δ Fs का उपयोग करें। स्टॉप मान के लिए, परिकलित S का उपयोग करें।
    5. इसके बाद, ई कॉलम को एफएफटी कॉम्प्लेक्स मानों के साथ निम्नानुसार भरें:
      1. सी कॉलम के पहले सेल में 0 डालें, क्योंकि दूरी 0 को एफएफटी की गणना के लिए सिग्नल 0 के साथ मेल खाना चाहिए।
      2. फिर, डेटा मेनू पर जाएं, डेटा विश्लेषण क्लिक करें, और फूरियर विश्लेषण का चयन करें।
      3. नई विंडो में, इनपुट रेंज के लिए कॉलम सी में वर्णित फ्लोरोसेंट सिग्नल के डेटा बिंदुओं की श्रेणी का चयन करें।
        नोट: डेटा बिंदुओं की संख्या 2एन (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट सिग्नल के 256 या 128 डेटा बिंदु) होनी चाहिए।
      4. आउटपुट रेंज के लिए E की संबंधित सीमा का चयन करें।
      5. ठीक का चयन करें और FFT जटिल मानों को स्वचालित रूप से भरने दें।
  6. F कॉलम को FFT परिमाण से निम्नानुसार भरें:
    1. E में जटिल संख्या से F में निरपेक्ष मान लौटाने के लिए IMABS फ़ंक्शन का उपयोग करें और सामान्यीकरण करने के लिए 2/N से गुणा करें (समीकरण (2)):
      FFT परिमाण = (IM.ABS (E1... एन) × (2/एन) (2)
  7. एफ में एफएफटी परिमाण का उपयोग करके एफएफटी स्पेक्ट्रम को प्लॉट करें, डी में एफएफटी आवृत्ति के एक समारोह के रूप में, एस तक। अधिकतम शिखर और इसके संबंधित एफएफटी आवृत्ति का बिंदु खोजें।
  8. समीकरण (3) के साथ अधिकतम शिखर की एफएफटी आवृत्ति को दूरी में बदलें। यह गणना की गई दूरी माइटोकॉन्ड्रियल वितरण की अनुदैर्ध्य दूरी का प्रतिनिधित्व करती है।
    दूरी (μm) = 1/FFT आवृत्ति (3)
    नोट: एफएफटी समरूपता के कारण, एफएफटी स्पेक्ट्रम के दोहराव से बचने के लिए, एस मान से परे एफएफटी आवृत्ति को प्लॉट न करें, जो डेटा बिंदुओं के आधे से मेल खाती है।

6. छवि विश्लेषण से पहले छवि शोर को कम करने के लिए वैकल्पिक प्रीप्रोसेसिंग कदम

  1. एक माध्यिका फ़िल्टर या 2D deconvolution निम्नानुसार लागू करें:
    1. माध्यिका फ़िल्टर के लिए:
      1. प्रक्रिया का चयन करें | फिल्टर करें और मीडियन विकल्प पर क्लिक करें।
      2. प्रदर्शित माध्यिका संवाद बॉक्स में, त्रिज्या के लिए 2.0 का चयन करें और ठीक क्लिक करें. मिटो-स्टैक में सभी छवियों पर प्रक्रिया लागू करने के लिए हाँ चुनें।
      3. प्रतिबिंबों में शोर में कमी का प्रेक्षण कीजिए।
    2. 2D deconvolution के लिए:
      1. एक सैद्धांतिक प्वाइंट स्प्रेड फ़ंक्शन (PSF) जनरेट करें।
      2. प्लगइन PSF_Generator.jar डाउनलोड करें और फ़ाइल को "प्लगइन्स" फ़ोल्डर में रखें।
      3. PSF जनरेटर संवाद बॉक्स में, Born & Wolf 3D ऑप्टिकल मॉडल विकल्प पर क्लिक करें, कन्फ़ोकल स्कैनिंग के दौरान उपयोग किए जाने वाले 1.33 का अपवर्तक सूचकांक विसर्जन मान दर्ज करें, और सटीकता गणना विकल्प के लिए सर्वश्रेष्ठ चुनें।
      4. उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए 576 एनएम कैप्चर करें, 0.7 के उपयोग किए गए उद्देश्य लेंस का एनए, और 3,000 एनएम का जेड-चरण।
      5. deconvoluted किया जा करने के लिए confocal छवि के पिक्सेल आकार XY, साथ ही आकार XYZ एक्स और वाई के पिक्सेल की संख्या और जेड चरणों की संख्या (इस प्रोटोकॉल के लिए 3 ) का संकेत कैप्चर करें.
      6. PSF जनरेटर के प्रदर्शन मेनू में, विकल्प रैखिक पर क्लिक करें, 8 बिट रिज़ॉल्यूशन का चयन करें, और फिर लुकअप तालिका (LUT) के लिए ग्रे विकल्प चुनें।
      7. PSF जनरेटर चलाएँ और TIFF प्रारूप में बनाए गए सैद्धांतिक PSF को सहेजें।
      8. विकल्प के Z प्रोजेक्ट टूल को खोलकर बनाए गए PSF के स्लाइस का योग बनाएं ढेर जो छवि मेनू में स्थित है।
      9. प्रदर्शित ZProjection संवाद बॉक्स में, का चयन करें अनुमान प्रकार के लिए योग स्लाइस, और क्लिक करें OK. नए PSF को TIFF फॉर्मेट में सेव करें।
        नोट: एक ज्ञात व्यास के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स को स्कैन करके प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त एक पीएसएफ का उपयोग सैद्धांतिक पीएसएफ के बजाय किया जा सकता है।
      10. प्लगइन "DeconvolutionLab_2.jar"19 डाउनलोड करें और इसे प्लगइन फ़ोल्डर में रखें।
      11. मेनू प्लगइन्स पर क्लिक करें। अगला, DeconvolutionLab2 पर क्लिक करें।
      12. उपकरण का उपयोग करके मिटो-स्टैक से कॉन्फोकल छवियों को अलग करें छवि छवि मेनू में स्थित ढेर विकल्प से ढेर करने के लिए और इसे TIFF प्रारूप में सहेजें।
      13. DeconvolutionLab2 संवाद बॉक्स में, मिटो-स्टैक से प्राप्त छवियों में से एक का चयन करें। बनाए गए सैद्धांतिक पीएसएफ का चयन करें, और 15 पुनरावृत्तियों के साथ एल्गोरिथ्म रिचर्डसन-लुसी का चयन करें।
      14. DeconvolutionLab2 चलाएँ, छवि में सिग्नल सुधार और शोर में कमी की जाँच करें, और इसे TIFF प्रारूप में सहेजें।
  2. छवि विश्लेषण के लिए चरण 4.4 के साथ जारी रखें.
  3. deconvoluted छवियों की दहलीज के लिए, उन्हें थ्रेसहोल्डिंग प्रक्रिया के दौरान एक 8 बिट मुखौटा के लिए परिवर्तित. छवि मेनू के ढेर उपकरण में स्टैक करने के लिए छवियों का चयन करके बाइनरी और deconvoluted छवियों के साथ एक ढेर बनाएँ।
  4. deconvoluted छवियों के FFT विश्लेषण के लिए, प्लॉट प्रोफ़ाइल में पिक्सेल इकाइयों में दूरी होती है। पिक्सेल इकाइयों को माइक्रोन में निम्नानुसार रूपांतरित करें:
    1. स्प्रेडशीट में, चरण 5.4 पूरा करने के बाद डेटा को B से A में स्थानांतरित करें। इसके बाद, पिक्सेल आकार से ए से प्रत्येक पिक्सेल संख्या को गुणा करके माइक्रोन में दूरी के साथ बी भरें।

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल के बाद, घनत्व और mitochondria के वितरण के विश्लेषण रहते कंकाल की मांसपेशी में प्राप्त किया जा सकता है. प्रोटोकॉल तीन मुख्य चरणों में बांटा गया है: कंकाल मांसपेशी बंडल विच्छेदन, confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग, और छवि विश्लेषण. वर्कफ़्लो अवलोकन चित्र 1 में प्रस्तुत किया गया है। चित्रा 2 ए एक पेट्री डिश में एक पूरे चूहे गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी को दिखाता है, पार्श्व सिर को चिह्नित करता है जिसमें से फाइबर प्राप्त होते हैं, जबकि चित्रा 2 बी आराम समाधान में फाइबर बंडलों को दिखाता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा, माइटोकॉन्ड्रिया को फ्लोरोसेंट इंडिकेटर टीएमआरई का उपयोग करके लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर की गहराई के साथ दर्ज किया जा सकता है। टीएमआरई एक लिपोफिलिक धनायनित फ्लोरोफोर है जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता20 के अनुसार माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर चुनिंदा रूप से जमा होता है।

आईएमएफ की एक इष्टतम कॉन्फोकल छवि फाइबर (चित्रा 3 ए) के भीतर गहराई के 15 माइक्रोन से ऊपर जेड दूरी का चयन करके प्राप्त की जा सकती है। चित्रा 3 बी गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी फाइबर जेड दूरी (15 से 21 माइक्रोन) के साथ अधिग्रहित टीएमआरई के साथ लोड किए गए माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिनिधि एक्सवाई कॉन्फोकल छवियों को दिखाता है। माइटोकॉन्ड्रियल विश्लेषण की अनुमति देने के लिए उन्हें बाइनरी छवियों में बदलने के लिए कन्फोकल छवियों को थ्रेसहोल्ड करके संसाधित किया गया था। चित्रा 3 बी (बाएं पैनल) एक व्यायाम दुबला चूहे से एक फाइबर से पता चलता है. यह कंकाल की मांसपेशी फाइबर माइटोकॉन्ड्रिया के एक अपेक्षित कॉन्फोकल रिकॉर्ड का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि इसमें फाइबर के साथ एक सुसंगत पैटर्न होता है। इसके विपरीत, हमने एक ओब चूहा(चित्रा 3बी, दाएं पैनल) से एक फाइबर का चयन किया जो माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री और वितरण में पर्याप्त परिवर्तन दिखाता है। चित्रा 3 सी माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा कब्जा किए गए फाइबर क्षेत्र की मात्रा का ठहराव दिखाता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व के रूप में व्यक्त किया जाता है, जो प्रत्येक बिनाराइज्ड छवि (पैनल बी में दिखाया गया है) से प्राप्त होता है। जैसा कि अपेक्षित था, ओब फाइबर ने कम माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व प्रस्तुत किया। यह लगातार जेड दूरी का विश्लेषण किया गया था, जो चित्रा 3 डी में भी मनाया जाता है जब माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व 15, 18, और 21 माइक्रोन पर अधिग्रहित तीन confocal छवियों द्वारा अनुरूप स्टैक प्रति गणना की जाती है.

माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व विश्लेषण के समान, लाइव-सेल इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट संकेतक की कन्फोकल स्कैनिंग, जैसे कि टीएमआरई, लाइव-कंकाल की मांसपेशी में माइटोकॉन्ड्रिया के अनुदैर्ध्य संगठन का अध्ययन करने की अनुमति देता है। आईएमएफ टीटी7 के करीब आई-बैंड में एक आवधिक संगठन प्रस्तुत करता है, जिसका विश्लेषण एफएफटी द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल की आवृत्ति और संगठन17 के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 4 दुबला और ओब चूहों से व्युत्पन्न गैस्ट्रोकेनियस में पाए जाने वाले आईएमएफ के संगठन में अंतर दिखाता है और एफएफटी माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल के वितरण में परिवर्तन को खोजने की अनुमति देता है। चित्रा 4 ए, बी एफएफटी विश्लेषण के लिए फाइबर में एक केंद्रीय और पार्श्व स्थिति में चयनित अनुदैर्ध्य आरओआई प्रदर्शित करता है। एफएफटी करने से पहले, पृष्ठभूमि घटाव के लिए थ्रेसहोल्डिंग की गणना की जाती है। फिर, छवि को बिनाराइज्ड किया जाता है; ये प्रक्रियाएं माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल के प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर में भिन्नता को समाप्त करती हैं। बाइनरी छवि एफएफटी करने के लिए आवश्यक प्रतिदीप्ति वितरण की साजिश प्रोफ़ाइल प्रदान करती है।

चित्रा 4 सी, डी पैनल ए और बी में चयनित आरओआई को उनके प्लॉट प्रोफाइल (ऊपरी पैनल) के साथ दिखाते हैं। प्लॉट प्रोफाइल से, लीन और ओब चूहों से प्राप्त फाइबर के बीच प्रतिदीप्ति वितरण में अंतर देखा जा सकता है, साथ ही एक ही फाइबर के भीतर आरओआई के बीच भिन्नताएं भी देखी जा सकती हैं। प्रत्येक प्लॉट प्रोफाइल के लिए, उनके संबंधित एफएफटी स्पेक्ट्रम (निचले पैनल) प्रस्तुत किए जाते हैं। अधिकतम एफएफटी स्पेक्ट्रम का शिखर अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल वितरण की एफएफटी आवृत्ति (एक्स-अक्ष) को इंगित करता है। इसे दुबला चूहे से पार्श्व और केंद्रीय आरओआई में 2 माइक्रोन के करीब दूरी मूल्य में परिवर्तित किया जा सकता है। विशेष रूप से, चोटी का एफएफटी परिमाण माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल की नियमितता का एक सूचकांक है, और इस आयाम में परिवर्तन माइटोकॉन्ड्रियल वितरण में परिवर्तन प्रकट करता है।

चित्रा 4 ई, एफ दुबला और ओब-व्युत्पन्न फाइबर के बीच एफएफटी स्पेक्ट्रम में अंतर दिखाते हैं जहां पार्श्व और केंद्रीय आरओआई का क्रमशः विश्लेषण किया गया था। पार्श्व आरओआई (चित्रा 4ई) में माइटोकॉन्ड्रियल अनुदैर्ध्य वितरण की आवृत्ति दुबला और ओब-व्युत्पन्न फाइबर में समान थी; फिर भी, ओब-व्युत्पन्न फाइबर में अधिकतम एफएफटी शिखर का आयाम अधिक था, जो चित्रा 4 बी में छवि में देखे गए सिग्नल की उच्च नियमितता के साथ समझौते में है। फिर भी, ओब के केंद्रीय आरओआई (चित्रा 4 एफ) को दुबला की तुलना में एफएफटी शिखर की एक महत्वपूर्ण कमी के उदाहरण के रूप में देखा जाता है जब माइटोकॉन्ड्रियल वितरण का एक महत्वपूर्ण परिवर्तन मौजूद होता है।

Figure 1
चित्रा 1: कंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कंकाल की मांसपेशी में माइटोकॉन्ड्रियल विश्लेषण के लिए योजना। यह योजना प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों को तीन अलग-अलग चरणों में सारांशित करती है। पहला चरण, गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी फाइबर बंडलों का विच्छेदन, तीन बाद के चरणों में विभाजित है, गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी अलगाव, इसके बाद बंडलों में मांसपेशी यांत्रिक विच्छेदन अंत में व्यवहार्य लोगों का एक दृश्य चयन करने के लिए। दूसरे चरण में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव-सेल इमेजिंग अधिग्रहण होता है, जिसमें कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए फ्लोरोफोर (टीएमआरई) के साथ इनक्यूबेशन होते हैं ताकि फाइबर को कक्ष में रखा जा सके। बाद में, उचित सेटिंग्स confocal छवियों के अधिग्रहण का संचालन करने के लिए खुर्दबीन में किए जाते हैं. तीसरे चरण के दौरान, कॉन्फोकल इमेज प्रोसेसिंग और डेटा विश्लेषण आयोजित किया जाता है। छवि प्रसंस्करण के साथ शुरू, जहां बाइनरी छवियों को उत्पन्न करने के लिए एक सीमा की आवश्यकता होती है जिसमें से माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व गणना और एफएफटी द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल वितरण किया जाता है। संक्षिप्ताक्षर: टीएमआरई = टेट्रामेथिलरोडामाइन एथिल एस्टर; FFT = फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कंकाल की मांसपेशी बंडल विच्छेदन। (ए) आराम समाधान के साथ एक पेट्री डिश में विच्छेदित चूहा पार्श्व गैस्ट्रोकेनियस सिर (काला तीर)। (बी) टीएमआरई लोडिंग से पहले आराम समाधान में गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी फाइबर बंडलों की प्रतिनिधि छवि। संक्षिप्त: TMRE = tetramethylrhodamine एथिल एस्टर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व विश्लेषण। (ए) चित्रण जो कंकाल मांसपेशी फाइबर में आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रिया के कन्फोकल स्कैनिंग के लिए अनुशंसित जेड दूरी का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) कंकाल की मांसपेशी फाइबर में टीएमआरई के साथ लोड किए गए माइटोकॉन्ड्रिया की कॉन्फोकल छवियों की श्रृंखला, एक व्यायाम किए गए ज़कर +/- चूहे (दुबला) से प्राप्त होती है और जेड दूरी (15 से 21 माइक्रोन गहराई से) में दर्ज एक मोटे ज़कर एफए / फा चूहे (ओबी) से। छवियों को थ्रेसहोल्डिंग द्वारा संसाधित किया गया और बाइनरी छवियों में बदल दिया गया। (सी)पैनल बी में मनाया अलग जेड दूरी पर प्राप्त confocal स्लाइस के मिटो घनत्व की गणना की. (D) पैनल B में देखे गए चित्रों द्वारा रचित स्टैक से प्राप्त माइटो-घनत्व। पैनल बी में छवियाँ 65 x 50 माइक्रोन हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: मिटो-घनत्व = माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व; आईएमएफ = इंटरमायोफिब्रिलर माइटोकॉन्ड्रिया; ओब = मोटा; SSM = सबसर्कोलेमल माइटोकॉन्ड्रिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एफएफटी द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल वितरण विश्लेषण। फ्लोरोसेंट इंडिकेटर टीएमआरई के साथ लोड किए गए माइटोकॉन्ड्रिया की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां एक व्यायाम किए गए ज़कर +/+ चूहे (दुबला, पैनल ए) और एक मोटे ज़कर एफए / एफए चूहे (ओब, पैनल बी) से प्राप्त कंकाल की मांसपेशी फाइबर की गहराई के 21 माइक्रोन पर प्राप्त की गईं। छवियों को थ्रेसहोल्डिंग द्वारा संसाधित किया गया और बाइनरी छवियों में बदल दिया गया। पैनल ए (पैनल सी) और पैनल बी (पैनल डी) से पार्श्व और केंद्रीय आरओआई प्रतिदीप्ति तीव्रता (ऊपरी प्लॉट) और एफएफटी स्पेक्ट्रम (निचले प्लॉट) के अपने संबंधित प्लॉट प्रोफाइल के साथ। एफएफटी की गणना आरओआई से 256 पिक्सल चौड़ाई के साथ की गई थी, जो पैनल ए में 39 x 5 माइक्रोन के आरओआई आकार और पैनल बी में 50 x 5 माइक्रोन के आरओआई आकार से मेल खाती है। पैनल ई पार्श्व आरओआई में लीन और ओब चूहों से प्राप्त माइटोकॉन्ड्रिया के बीच पाए जाने वाले एफएफटी स्पेक्ट्रम के अंतर को दर्शाता है, जबकि पैनल एफ केंद्रीय आरओआई के एफएफटी स्पेक्ट्रम के अंतर को दर्शाता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: A.U. = मनमानी इकाइयाँ; एफएफटी = फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म; ROI = रुचि के क्षेत्र; ओब = मोटा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 100 एमएल में अंतिम एकाग्रता भंडार 
K-aspartate 100 मिमी
केसीएल 20 मिमी
हेप्स 20 मिमी
एल-ग्लूटामिक एसिड 3 मिमी
मैलिक एसिड 3 मिमी
ईजीटीए 0.1 मिमी 10 मिमी
एमजीसीएल2 1 मिमी मुक्त मिलीग्राम2+
सीएसीएल2 0.00002 मिमी मुक्त सीए 2 +
फॉस्फोक्रीटाइन डि-ना 5 मिमी 500 मिमी
क्रिएटिन फॉस्फोकाइनेज 5 यू/एमएल 200 यू/एमएल
एमजीएटीपी 5 मिमी
पीएच 7.3 (NaOH के साथ)

तालिका 1: समाधान अभिकर्मकों और एकाग्रता को आराम दें।

अनुपूरक चित्रा एस 1: छवि प्रीप्रोसेसिंग विधियों का प्रभाव। (ए) फ्लोरोसेंट इंडिकेटर टीएमआरई के साथ लोड किए गए माइटोकॉन्ड्रिया की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां एक व्यायाम किए गए ज़कर +/- + चूहे (दुबला, ऊपरी पैनल) से प्राप्त कंकाल मांसपेशी फाइबर में 18 माइक्रोन की गहराई पर प्राप्त की जाती हैं और एक मोटे ज़कर एफए / एफए चूहे (निचले पैनल) से, ओत्सु 'थ्रेसहोल्डिंग, मंझला फिल्टर और ओत्सु 'थ्रेसहोल्डिंग का उपयोग करके प्रीप्रोसेसिंग के बाद प्राप्त उनकी संबंधित छवियों के साथ, और 2D deconvolution और Otsu' थ्रेसहोल्डिंग। (बी) विभिन्न तरीकों से प्रीप्रोसेसिंग के बाद कॉन्फोकल छवियों (पैनल ए) से प्राप्त माइटो-घनत्व की प्लॉट प्रोफाइल। पैनल ए में छवियां 65 x 50 माइक्रोन हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: 2D-Decon = 2D deconvolution; मिटो-घनत्व = माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

माइटोकॉन्ड्रिया एक उच्च रीमॉडेलिंग क्षमता वाले अंग हैं। उनकी सामग्री, घनत्व और वितरण को माइटोकॉन्ड्रियल संलयन और विखंडन तंत्र के सक्रियण के माध्यम से तेजी से संशोधित किया जा सकता है, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल डायनेमिक्स1 के रूप में जाना जाता है, और माइटोकॉन्ड्रियल टर्नओवर तंत्र के बीच संतुलन: माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस और विशेष माइटोकॉन्ड्रिया गिरावट मार्ग, माइटोफैगी21,22. माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री और आकृति विज्ञान सेल प्रकार और विकास के चरण के अनुसार भिन्न हो सकते हैं और विभिन्न शारीरिक और रोग उत्तेजनाओं 17,22,23,24के तहत फिर से तैयार किया जा सकता है. इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का अध्ययन आधी सदी25 से अधिक के लिए प्रासंगिक रहा है। विशेष रूप से, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण कई अध्ययनों26 में लागू मानक तकनीक रहा है।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट अध्ययन ने विभिन्न फाइबर गहराई पर माइटोकॉन्ड्रिया के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए उनकी क्षमता के कारण पिछले कुछ वर्षों में प्रासंगिकता प्राप्त की है, जो विभिन्न अनुकूली औरदुर्भावनापूर्ण स्थितियों में कंकाल की मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकता है। इस अध्ययन में, माइटोकॉन्ड्रिया घनत्व के विश्लेषण और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर में वितरण के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है। लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर के साथ काम करने की मुख्य चुनौतियों में से एक माइटोकॉन्ड्रियल कॉन्फोकल रिकॉर्डिंग तक अलगाव प्रक्रियाओं से संकुचन से बचने के लिए है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, एक उच्च मिलीग्राम और एटीपी आराम समाधान17 का उपयोग फाइबर को कम से कम 2 घंटे के लिए आराम से रखने के लिए किया जाता है, जो फाइबर अलगाव प्रक्रिया, फ्लोरोफोर लोड और कंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल के अधिग्रहण के लिए पर्याप्त समय देता है। प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण बिंदु यंत्रवत् फाइबर प्राप्त कर रहा है क्योंकि इसके लिए उच्च परिशुद्धता और ताजा ऊतक की आवश्यकता होती है; हालांकि, यह इस पहले इस्तेमाल किया और रिपोर्ट तकनीक28 के साथ चूहे की मांसपेशियों से व्यवहार्य फाइबर बंडलों प्राप्त करने के लिए संभव है. बरकरार फाइबर प्राप्त करने से सरकोलेममा और इंट्रासेल्युलर वातावरण को संरक्षित करने की अनुमति मिलती है, सेल संरचनाओं28,29 के बीच चयापचय और कार्यात्मक क्रॉसस्टॉक को बनाए रखता है।

ऊतकों या निश्चित कोशिकाओं के साथ काम करने के विपरीत, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव-सेल इमेजिंग फ्लोरोसेंट छवियों का अधिग्रहण विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के प्रभाव की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग वास्तविक समय में माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और वितरण में परिवर्तन का पता लगाने और प्रयोगात्मक समूहों के बीच अंतर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि दुबला और ओब-व्युत्पन्न फाइबर (चित्रा 3 और चित्रा 4) के बीच यहां प्रस्तुत उदाहरण। यह हमेशा माना जाना चाहिए कि लाइव-सेल इमेजिंग मामूली सेल क्षति के साथ इष्टतम काम करने की स्थिति मानकीकरण का तात्पर्य है. काम करने का समय, उपयोग किए गए समाधानों की गुणवत्ता, अधिग्रहण पैरामीटर और लेज़रों के जोखिम को बारीक रूप से नियंत्रित किया जाना चाहिए। इसलिए, आवश्यक विचारों का उल्लेख नीचे किया गया है।

मांसपेशी फाइबर के माइटोकॉन्ड्रिया को फाइबर के आकार और फाइबर की क्षति के कारण कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पूरी तरह से अनुदैर्ध्य रूप से दर्ज नहीं किया जा सकता है जो लंबे लेजर एक्सपोजर के कारण हो सकता है। फिर भी, इस तकनीक के तहत फाइबर का एक प्रतिनिधि नमूना दर्ज किया जाता है। यद्यपि यह confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एक चूहे के कंकाल मांसपेशी फाइबर की पूरी मोटाई रिकॉर्ड करने के लिए संभव है, यह एक लंबे समय तक रिकॉर्डिंग समय और लेजर बीम के संपर्क का तात्पर्य है. नियंत्रण चूहों के मामले में, इन रिकॉर्डिंग के साथ मुद्दों का सामना नहीं किया गया है. हालांकि, रोग स्थितियों से फाइबर क्षति के लिए अतिसंवेदनशील हो सकते हैं जैसा कि ओब चूहों से तंतुओं में देखा गया है। नतीजतन, विभिन्न Z दूरी पर प्राप्त प्रतिनिधि confocal छवियों का एक ढेर प्राप्त करना पसंद किया जाता है। जब फाइबर मोटाई का केवल एक खंड दर्ज किया जाता है, तो परीक्षण किए गए सभी तंतुओं पर स्टैक को एक ही गहराई पर लेने की सिफारिश की जाती है क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल वितरण और घनत्व फाइबर के भीतर अपनी स्थिति के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। 15 माइक्रोन से ऊपर की गहराई पर सिग्नल के अधिग्रहण की सिफारिश आईएमएफ के प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए की जाती है, जो परिधि के करीब स्थित एसएसएम आबादी से बचती है।

कन्फोकल अधिग्रहण के दौरान, कुछ महत्वपूर्ण विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, आवर्धन, उच्च एनए और विसर्जन माध्यम पर विचार करते हुए विसर्जन उद्देश्य लेंस का चयन। चूंकि कोशिकाओं को हाइड्रोफिलिक इनक्यूबेशन माध्यम में बनाए रखा जाता है, इसलिए इनक्यूबेशन और विसर्जन माध्यम का अपवर्तक सूचकांक एक अच्छा संकेत प्राप्त करने और ऊतक में गहराई से स्कैन करने के लिए समान होना चाहिए। आमतौर पर एक पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग करके हासिल किया जाता है। चित्रा 3 और चित्रा 4 की कन्फोकल छवियों को 20x, 0.7 एनए, पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ अधिग्रहित किया गया था। यह उद्देश्य फाइबर के रिकॉर्ड को इसकी सभी गहराई में अनुमति देता है, लेकिन 15, 18 और 21 माइक्रोन पर स्कैनिंग का निर्णय लिया गया था क्योंकि आईएमएफ की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियों को उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेत और मामूली फाइबर क्षति के साथ प्राप्त किया जा सकता है। अन्य आवर्धन, जैसे कि 40x और एक विसर्जन माध्यम के रूप में तेल, पर विचार किया जा सकता है लेकिन इसका मूल्यांकन करने की आवश्यकता है।

दूसरा, इमेजिंग अधिग्रहण के लिए पिक्सेल आकार की गणना Nyquist प्रमेय के अनुसार की जाती है, जो एक उपयुक्त पिक्सेल आकार के चयन की अनुमति देता है जो अधिक नमूना (उच्च लेजर एक्सपोजर) और अंडर-सैंपल (कम रिज़ॉल्यूशन की ओर जाता है)30से बचा जाता है। गणना चयनित उद्देश्य लेंस और तरंग दैर्ध्य (~ 90 एनएम) की विशेषताओं पर निर्भर करती है। इसे ज़ूम के साथ समायोजित किया जा सकता है; इसलिए, केवल एक ज़ूम सेटिंग एक इष्टतम पिक्सेल आकार30 प्रदान करती है। फिर भी, व्यवहार में, ज़ूम विश्लेषण किए जाने वाले नमूने के क्षेत्र पर भी निर्भर करता है। इस प्रकार, संतुलन खोजने से एक पिक्सेल आकार के साथ काम करने की अनुमति मिलती है जो Nyquist मानदंड के सबसे करीब है और यह विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र में भी फिट बैठता है। चित्रा 3 और चित्रा 4 ~ 50-80 माइक्रोन है जो फाइबर की पूरी चौड़ाई के विश्लेषण के लिए अनुमति दी जो 150 और 190 एनएम के एक पिक्सेल आकार के साथ अधिग्रहित किए गए थे.

तीसरा, एक उपयुक्त पिनहोल व्यास जो आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को डिटेक्टर तक पहुंचने से रोकता है, का उपयोग किया जाना चाहिए। आमतौर पर, 1 हवादार को इष्टतम पिनहोल आकार माना जाता है क्योंकि यह फोकस30 के विमान से उत्पन्न होने वाले ~ 80% फोटॉन का पता लगाने की अनुमति देता है। फिर भी, कुछ दाग जैविक नमूने है कि कम प्रतिदीप्ति का स्तर दिखाने के लिए एक पिनहोल वृद्धि30 की आवश्यकता होती है. चित्रा 3 और चित्रा 4 की कन्फोकल छवियों को कम हवादार के साथ कब्जा कर लिया गया कम संकेत के कारण 3 हवादार के पिनहोल आकार के साथ अधिग्रहित किया गया था। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि पिनहोल आकार में वृद्धि के परिणामस्वरूप सिग्नल की तीव्रता में वृद्धि से फोकस से कैप्चर किए गए प्रकाश में वृद्धि के कारण रिज़ॉल्यूशन में कमी आती है। इस कारण से, हमने यथासंभव 1 हवादार के करीब एक पिनहोल आकार का उपयोग करने की सिफारिश की।

जब पर्याप्त रूप से अधिग्रहण किया जाता है, तो माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और वितरण पर मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल छवियों को संसाधित किया जा सकता है। भले ही, थ्रेसहोल्डिंग के महत्वपूर्ण प्रसंस्करण छवि कदम को सिग्नल की मात्रा का ठहराव में सुधार करने के लिए विश्लेषण से पहले प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। इस महत्वपूर्ण कदम के दौरान, प्रतिदीप्ति तीव्रता मान है कि पृष्ठभूमि के उन लोगों से mitochondria के लिए सकारात्मक पिक्सल अलग परिभाषित किया गया है. थ्रेशोल्ड को माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिनिधित्व करने वाले शिखर के एक गाऊसी फिट द्वारा परिभाषित किया जा सकता है जब छवि का हिस्टोग्राम दो चोटियों को प्रदर्शित करता है, एक पृष्ठभूमि के अनुरूप और दूसरा माइटोकॉन्ड्रिया के लिए। हालांकि, प्रत्येक छवि में एक बिमोडल वितरण हमेशा प्राप्त नहीं होता है, इसलिए अन्य थ्रेसहोल्डिंग विधियों को लागू करना पड़ता है।

इस प्रोटोकॉल में, ओत्सु की थ्रेसहोल्डिंग के कार्यान्वयन का वर्णन किया गया है, जो एक गैर-पैरामीट्रिक और असुरक्षित विधि है जिसे थ्रेशोल्ड मान खोजने के लिए डिज़ाइन किया गया है जब दो चोटियों को अलग नहीं किया जाता है, या अन्य चोटियों31 मौजूद हैं। ओत्सु को जैविक-छवि विश्लेषण के लिए ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म का उपयोग करके आसानी से लागू किया जा सकता है; हालांकि, अन्य थ्रेसहोल्डिंग विधियों का परीक्षण किया जा सकता है। एक ही थ्रेसहोल्डिंग विधि को सभी कॉन्फोकल छवियों पर लागू किया जाना चाहिए और प्रत्येक कॉन्फोकल छवि के लिए स्वतंत्र रूप से गणना की जानी चाहिए। थ्रेशोल्ड को पूरे स्टैक पर लागू करने से गलत परिणाम मिलते हैं। थ्रेसहोल्डिंग प्रक्रिया के बाद बाइनरी छवियां प्राप्त होने के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और एफएफटी का विश्लेषण इस प्रोटोकॉल में वर्णित निर्देशों का पालन करके आसानी से किया जा सकता है। हालांकि, नाभिक और केशिकाओं को शामिल करने से बचने के लिए दोनों विश्लेषण करते समय देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि इससे परिमाणीकरण त्रुटियां होंगी। घनत्व के संबंध में, पिक्सेल, या नाभिक या केशिकाओं द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को पिक्सल या कुल क्षेत्र से विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, एफएफटी विश्लेषण करते समय, यह सत्यापित किया जाना चाहिए कि माइटोकॉन्ड्रिया संकेत सीधा है। इसके विपरीत, जब माइटोकॉन्ड्रिया सिग्नल झुका हुआ होता है, तो यह प्रोफाइल का उत्पादन कर सकता है जो माइटोकॉन्ड्रियल अनुदैर्ध्य वितरण का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, जिससे गलत एफएफटी स्पेक्ट्रम डेटा मिलता है। इसके अलावा, छवियों में शोर को कम करने के लिए एक प्रीप्रोसेसिंग चरण लागू किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक माध्यिका फिल्टर और 2 डी deconvolution का उपयोग कर दो वैकल्पिक preprocessing चरणों का वर्णन करता है. छवि और माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व सामग्री पर इन प्रीप्रोसेसिंग विधियों के प्रभाव पूरक चित्रा एस 1 में प्रस्तुत किए गए हैं। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि जबकि ये प्रीप्रोसेस छवि गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं, वे कुछ छवि विवरणों के नुकसान का परिणाम भी दे सकते हैं। इसलिए, उनका उपयोग सावधानी के साथ किया जाना चाहिए और विश्लेषण की जा रही सभी छवियों पर लगातार लागू किया जाना चाहिए।

इसके फायदे के बावजूद, confocal माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण के लिए इष्टतम शर्तों32 लागू कर रहे हैं जब 180-250 एनएम के एक पार्श्व संकल्प (XY) द्वारा सीमित है. माइटोकॉन्ड्रियल व्यास ~ 200-700 एनएम है, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा के करीब है; इस प्रकार, उप mitochondrial संरचनाओं पर्याप्त रूप से33 का पता लगाया नहीं जा सकता है और घनत्व और एफएफटी इस प्रोटोकॉल में दिखाया विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है. इस तरह के स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान), उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीईडी) नैनोस्कोपी, या संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) के रूप में माइक्रोस्कोपी के अन्य सुपर संकल्प तकनीकों, उप माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाओं32 को हल करने के लिए पता लगाया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, माइटोकॉन्ड्रिया की कॉन्फोकल छवियां फ्लोरोफोर टीएमआरई का उपयोग करके प्राप्त की जाती हैं, जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर निर्भर करती हैं। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरोसेंट तीव्रता उनकी झिल्ली क्षमता के अनुसार भिन्न हो सकती है। इस समस्या को दूर करने के लिए डेटा विश्लेषण से पहले एक थ्रेसहोल्डिंग प्रक्रिया की जाती है। एक परिभाषित सीमा से ऊपर के सभी पिक्सेल को उनके प्रतिदीप्ति मूल्य से स्वतंत्र माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल के लिए सकारात्मक माना जाता है। फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बहुत कम झिल्ली क्षमता वाले माइटोकॉन्ड्रिया को इस तकनीक से हल नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सामग्री मात्रा का ठहराव के पूरक अध्ययन की सिफारिश की जाती है। टीएमआरई का उपयोग करने का एक फायदा यह है कि कंफोकल छवियों का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन अयुग्मन एजेंटों के साथ पर्याप्त नियंत्रण करने की आवश्यकता होती है जैसे कार्बोनिलसाइनाइड-पी-ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सीफेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी)। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और वितरण विश्लेषण के निर्देशों को माइटोकॉन्ड्रिया के लिए हरे फ्लोरोसेंट संकेतकों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया को उनकी झिल्ली क्षमता की परवाह किए बिना लोड करते हैं, लेकिन रणनीति और इनक्यूबेशन कंफोकल अधिग्रहण सेटिंग्स को मानकीकृत करने की आवश्यकता होती है।

यह देखते हुए कि माइटोकॉन्ड्रिया संरचना आवश्यक माइटोकॉन्ड्रियल और सेलुलर कार्यों से संबंधित है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल बीमारी के दौरान या किसी विशेष तनाव अपमान से उनके रीमॉडेलिंग के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकता है। यह माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा शासित कंकाल की मांसपेशियों के प्रमुख कार्यों की बेहतर समझ में योगदान दे सकता है, जैसे कि ऊर्जा उत्पादन, या जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया अन्य जीवों के साथ बातचीत करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे कि संकुचन-चयापचय युग्मन। प्रोटोकॉल निर्देशों के बाद माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और लाइव-कंकाल की मांसपेशी में वितरण का अनुमान लगाने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल कदम कंकाल मांसपेशी बंडल विच्छेदन, confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग, और छवि विश्लेषण, जहां विस्तृत निर्देश और महत्वपूर्ण विचार शामिल हैं पर केंद्रित तीन मुख्य चरणों में विभाजित कर रहे हैं. विशेष रूप से, उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुसार फाइबर के भीतर पूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल पुनर्निर्माण के लिए अतिरिक्त जेड चरणों का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल को और अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कॉन्फोकल छवि और विश्लेषण चरणों को समान वितरण के साथ सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है, जैसे कि लाइव और निश्चित नमूनों में टीटी।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को स्कूल ऑफ मेडिसिन और द इंस्टीट्यूट फॉर ओबेसिटी रिसर्च ऑफ टेक्नोलॉजिको डी मॉन्टेरी द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 3 ए वैज्ञानिक छवि और चित्रण सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A6419
Borosilicate glass coverslip Warner Instruments 64-0709
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670
Confocal microscope Leica TCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite  Leica 2.7.3.9723
Creatine Phosphokinase Sigma-Aldrich C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate Sigma-Aldrich 11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Forceps Miltex MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective  Leica 506517
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iris scissors Miltex 5-304
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
Maxchelator UC Davis Health https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm 
Micro scissors Miltex 18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji  Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji https://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ 
Recording chamber Warner Instruments RC-27N
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Spreadsheet Microsoft Excel Microsoft 
Stereo microscope Zeiss Stemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl ester Invitrogen T669

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Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा चूहे लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर में माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और अनुदैर्ध्य वितरण का विश्लेषण
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Pérez-Treviño, P., Nieblas, B., López-Vaquera, S. R., García, N. Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65306, doi:10.3791/65306 (2023).

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