Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse av mitokondriell tetthet og langsgående fordeling i levende skjelettfibre hos rotter ved konfokal mikroskopi

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65306
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3
1Experimental Medicine and Advanced Therapies, The Institute for Obesity Research, Tecnologico de Monterrey, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Preclinical Research Unit, Tecnologico de Monterrey

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å analysere endringer i mitokondriell tetthet og langsgående fordeling ved hjelp av levende skjelettmuskelavbildning ved hjelp av konfokalmikroskopi for mitokondriell nettverksskanning.

Abstract

Mitokondrien er en organell som kan forlenges, fragmenteres og renoveres i henhold til cellens metabolske krav. Ombyggingen av mitokondrienettverket gjør det mulig for sunne mitokondrier å møte cellulære krav; Tapet av denne kapasiteten har imidlertid vært relatert til utviklingen eller utviklingen av forskjellige patologier. I skjelettmuskulatur observeres mitokondriell tetthet og distribusjonsendringer i fysiologiske og patologiske forhold som trening, aldring og fedme, blant andre. Derfor kan studiet av mitokondrienettverket gi en bedre forståelse av mekanismer knyttet til disse forholdene.

Her beskrives en protokoll for mitokondrieavbildning av levende skjelettmuskelfibre fra rotter. Fibre dissekeres manuelt i en avslappende løsning og inkuberes med en fluorescerende levende cellebildeindikator for mitokondrier (tetrametylrhodaminetylester, TMRE). Mitokondriesignalet registreres ved konfokalmikroskopi ved hjelp av XYZ-skannemodus for å oppnå konfokale bilder av det intermyofibrillære mitokondrienettverket (IMF). Deretter behandles de konfokale bildene ved terskel og binarisering. Det binariserte konfokale bildet står for de positive pikslene for mitokondrier, som deretter telles for å oppnå mitokondriell tetthet. Det mitokondrielle nettverket i skjelettmuskulaturen er preget av en høy tetthet av IMF-befolkningen, som har en periodisk langsgående fordeling som ligner på T-tubuli (TT). Fast Fourier Transform (FFT) er en standard analyseteknikk utført for å evaluere distribusjonen av TT som gjør det mulig å finne distribusjonsfrekvensen og nivået på organisasjonen. I denne protokollen er implementeringen av FFT-algoritmen beskrevet for analyse av den langsgående mitokondrielle fordelingen i skjelettmuskulatur.

Introduction

Mitokondrier danner svært dynamiske nettverk som hovedsakelig reguleres av balansen mellom dens forlengelse (fusjon) og fragmentering (fisjon)1,2, som moduleres av ekspresjonen og aktiviteten til proteiner som Mitofusin 1 og 2 (Mfn1 og Mfn2) og optisk proteinatrofi 1 (Opa1), som regulerer fusjonen av den ytre mitokondriemembranen og indre membranen, henholdsvis 1,2. Dynaminrelatert protein (Drp1) regulerer hovedsakelig mitokondriell fisjon når det fosforyleres i Ser6163.

I skjelettmuskulatur er det godt fastslått at mitokondrienettverket er ordnet i strukturelt veldefinerte subpopulasjoner basert på deres nærhet til forskjellige celleregioner (myofibriller, sarcolemma og kjerner)4,5. De mitokondriene som ligger rett under sarcolemma kalles subsarcolemmale mitokondrier (SSM), de som ligger mellom kontraktile filamenter kalles intermyofibrillære mitokondrier (IMF), og mitokondriell subpopulasjon rundt kjernene kalles perinukleære mitokondrienettverk (PMN). Videre har det blitt foreslått at disse mitokondrielle subpopulasjonene har regionspesifikke funksjoner og er metabolsk spesialiserte 4,5.

Opprettholdelsen av cellulær energihomeostase, som tillater metabolsk og kontraktil funksjon, avhenger i stor grad av samspillet og kommunikasjonen på bestemte steder gjennom mitokondrienettverket (f.eks. IMF og SSM-interaksjon)4,6. I tillegg til mitokondrienettverksinteraksjoner kan mitokondrien også interagere med andre organeller, og danne strukturelle og funksjonelle komplekser. I denne forbindelse har det vist seg at IMF kan lokaliseres ved siden av sarkoplasmatisk retikulum (SR) og i nærheten av Ca2+ frigjøringsenhetene (CRU), dannet av tverrrørene (TT) 7. Dette faktum er relevant på grunn av rollen som mitokondrielt Ca2+ opptak i regulering av ATP-syntese og apoptose. Nylig har en potensiell rolle i regulering av cytosoliske Ca2+ transienter også blitt foreslått8.

TT er invaginasjoner av sarcolemma som har en periodisk fordeling langs lengdeaksen til kardiomyocytter og skjelettmuskelfibre 9,10, tilsvarende IMF-distribusjonen 5. Endringer i fordelingen av TT har viktige fysiologiske implikasjoner, gitt deres rolle i kontraktil funksjon. Disse endringene har imidlertid hovedsakelig blitt evaluert i kardiomyocytter. Ved hjelp av Fast Fourier Transform (FFT) analyse tillater konvertering av periodiske signaler fra avstandsdomenet til frekvensdomenet, noe som resulterer i et FFT-spektrum som indikerer frekvensen og regelmessigheten til signalet11,12,13. Selv om det er holdepunkter for at organiseringen av mitokondrienettverket i skjelettmuskelfibre er avgjørende for tilpasning til ulike metabolske tilstander, som ved regenerering etter muskelskade14,15, utføres de fleste analyser kvalitativt.

I tillegg, gitt at mitokondriell dysfunksjon har vært assosiert med flere skjelettmuskelrelaterte (f.eks. misbruksatrofi)2 og ikke-muskelsykdommer, spesielt metabolske sykdommer, og tilhørende tap av muskelmasse (dvs. atrofi)16, har den kvantitative evalueringen av mitokondrienettverket og distribusjonen i skjelettmuskulatur relevans. Nylig, en signifikant forskjell i den langsgående fordeling av mitokondrier av gastrocnemius muskelfibre mellom en overvektig gruppe (Ob; Zucker fa /fa rotter), og en mager gruppe (Lean; Zucker +/+ rotter) ble identifisert gjennom FFT17. Denne studien viste nytten av FFT i å analysere mitokondriefordelingen. Derfor presenterer denne protokollen en metodikk for å studere mitokondrier i levende skjelettmuskelfibre fra bilder oppnådd ved fluorescens konfokalmikroskopi. Mitokondriell tetthet kvantifiseres ved bakgrunnsterskelering, og analysen av langsgående mitokondriell fordeling ved FFT-analyse er også beskrevet. Et arbeidsflytskjema er presentert i figur 1.

Protocol

Alle dyreforsøksprosedyrer ble evaluert og godkjent av Animal Use and Care Committee (CICUAL) i Tecnologico de Monterrey (protokoll 2019-007). Mannlige Zucker (+/+ og fa/fa) rotter i alderen 12 til 13 uker ble brukt i denne studien. Dyrene ble holdt i standard dyrehold (12 timer / 12 t lys / mørk syklus, 40-60% fuktighet) og hadde tilgang til mat (standard rotte chow) og vann ad libitum.

1. Løsning sammensetning

  1. Tilbered fersk Relax-oppløsning ved å blande komponentene vist i tabell 1. Juster pH til 7,3 ved bruk av natriumhydroksid (NaOH).
  2. Beregn fri kalsiumkonsentrasjon i Relax-løsningen ved hjelp av et simuleringsprogram for bestemmelse av konsentrasjonen av fritt metall.
  3. Klargjør en 5 mM tetrametylrhodamin metylester (TMRE) lager i dimetylsulfoksid (DMSO) og en påfølgende fortynning på 0,1 mM i DMSO.

2. Disseksjon av gastrocnemius muskelfiberbunter

  1. Plasser dyret inne i induksjonskammeret og lukk lokket. Slå på oksygenkilden, sett gasstrømningshastigheten på 0,5 l/min, og still fordamperen på 4 % sevofluran for å indusere anestesi.
  2. Når rotta sover, plasser den utenfor kammeret i en liggende stilling mens du opprettholder anestesi. Klem tåen eller halen for å bekrefte mangelen på reflekser.
  3. Med saks, skjær gjennom magens hud og muskler. Deretter kutter du brystburet for å få tilgang til hjertet.
  4. For å utføre en hjertektomi, ta tak i hjertet fra de øverste venene og arteriene med tang og kutt blodkarene med saks. Fjern hjertet.
  5. Umiddelbart etter eutanasi, desinfiser bakbenet med etanol og barber det med en barberingsmaskin.
  6. Hold bakfoten og gjør et snitt med saks gjennom huden på nivå med akillessenen.
  7. Klipp bakbenet med saks på nivået av den proksimale tibia. Overfør den til en 60 mm petriskål som inneholder 3 ml iskald Relax-løsning i dorsalstilling. Dekk det med tilstrekkelig løsning for å forhindre at musklene tørker ut.
  8. Identifiser akillessenen, løft den forsiktig med tang og dissekere musklene vekk fra beinet med irissaks. Bruk et stereomikroskop fra dette trinnet og utover disseksjonen.
  9. Identifiser og separer hele gastrocnemius-muskelen, hoveddelen på baksiden av bakbenet.
  10. Dissekere og kast bindevevet og fettvevet som omgir muskelen med fintipptang. Overfør det laterale hodet på muskelen til en ny petriskål med iskald Relax-løsning (se figur 2A).
  11. Hold forsiktig muskelen med tang fra den ene enden og skill den forsiktig i bunter med mikrosaks. Manipuler alltid bunter ved å holde dem forsiktig i den ene enden med tang.
    MERK: Buntene er ca. 10 mm lange og 2 mm brede.
  12. Overfør fiberbuntene til en ny petriskål med 2 ml iskald Relax-løsning. Velg bare de som har et jevnt utseende, er fullstendige fra den ene enden til den andre og ikke forkortes (figur 2B).

3. Live-cell imaging oppkjøp av mitokondrier i skjelettmuskulatur ved konfokal mikroskopi

  1. Inkuber fibrene i 2,5 × 10-4 mM TMRE i Relax-løsning i 20 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Med de anbefalte arbeidskonsentrasjonene av TMRE, forventes det å være i en ikke-slukkende modus. Beskytt mot lyseksponering fra dette punktet og utover.
  2. Under inkubasjonstiden:
    1. Åpne standardprogramvaren for konfokalmikroskopet, velg konfigurasjonsrammen, og velg laser i dialogboksen for maskinvarekonfigurasjon og sjekk HeNe 543-alternativet.
    2. I anskaffelsesrammeverket velger du dialogboksen for anskaffelse, og i anskaffelsesmodus velger du XYZ-panelet.
    3. I XY-dialogboksen velger du 512 x 512-format, 400 Hz hastighet og merker av for pinhole-panelet. I dialogboksen som vises i knappenålshullet, velger du AU for enhet og legger til verdien 3 Airy for knappenålshullet.
      MERK: Vurder å redusere pinhole-størrelsen nærmest 1 Airy optimalt kriterium, hvis et tilstrekkelig fluorescenssignal er bevart.
    4. I dialogboksen Strålebaneinnstillinger velger du et mål for nedsenking i vann på 20x og numerisk blenderåpning (NA) på 0,7 (20x/0,7 IMM), og velger emisjonsbølgelengdevinduet på 576-700 nm. Velg DD488/543 og 15 % lasereffekt for 543-laseren.
      MERK: En objektivlinse for nedsenking i vann for live bildeskanning anbefales på det sterkeste (hvis tilgjengelig). Siden en lignende brytningsindeks for nedsenkningsmediet og inkubasjonsmediet oppnås.
  3. Etter 20 min inkubasjon, bytt inkubasjonsmediet to ganger. Sørg for at konfokalbildene er anskaffet innen 20-30 minutter etter inkubasjon.
  4. Forbered opptakskammeret med et 0,15 mm deksel av borosilikatglass.
    MERK: Velg tykkelsen på dekselet i henhold til det tilgjengelige opptakskammeret, med tanke på at tykkelsen vanligvis varierer fra 0,15 til 0,22 mm for optimal ytelse.
  5. Tilsett 200 μL Relax-løsning i opptakskammeret og overfør fiberbuntene.
  6. I konfokalmikroskopet, bruk brightfield-modus for å identifisere levedyktige fibre for fluorescerende opptak av mitokondrier. Levedyktige fibre er komplette, ikke kontraherte, og har et intakt stripemønster.
  7. Skill fiberbuntene fra hverandre og juster dem med tang. Velg de som er nærmest omslagsseddelen.
  8. Skann fluorescensen med live-knappen for å justere forsterkning og forskyvning i kontrollpanelkonsollen med tanke på følgende:
    1. Velg lave fluorescerende intensitetsverdier for en bakgrunn på nesten 0 vilkårlige enheter (A.U.).
    2. Velg et forsterkningsnivå mellom 100 og 200 A.U. for å unngå metning av opptakssystemet. Registrer derfor ikke de høyeste fluorescensnivåene.
    3. Velg en pikselstørrelse på 150-190 nm for å få fiberens fulle bredde, og juster zoomfaktoren i XY-dialogboksen .
      MERK: Vurder å bruke pikselstørrelsen nærmere Nyquist-kriteriene (90 nm), som tillater skanning av fiberens fulle bredde.
  9. I dialogboksen Z-stakk justerer du Z-avstanden for å hente fluorescenssignalet som starter ved en fiberdybde på 15 μm (startknapp) opp til 22 μm (sluttknapp). Velg 3 μm som Z-trinnstørrelse.
  10. Klikk på Start-knappen for å skaffe konfokalbildene. Få en Z-stack sammensatt av tre konfokale bilder oppnådd på 15, 18 og 21 μm dybde.

4. Analyse av mitokondriell tetthet

  1. I open source-plattformen for biologisk bildeanalyse18 åpner du Z-stack-filen og roterer bildene for å plassere fiberen horisontalt, som vist i figur 3B.
  2. Velg tilfeldig et rektangulært område av interesse (ROI) som inkluderer området okkupert av mitokondriene (ROImito). Velg ROImito størrelser fra 65 til 90 μm for X. For Y vil størrelsen avhenge av fiberbredden, og unngå periferien.
  3. Dupliser Z-stacken med den valgte ROImito og lagre den som en ny Z-stack (Mito-stack) i TIFF-format. Lagre ROImito-posisjonen som er valgt på den opprinnelige stabelen med ROI Manager-verktøyet .
  4. Beregn terskelen for bakgrunnssubtraksjon som følger:
    1. Bruk hurtigtasten Kommando+SKIFT+T for å åpne dialogboksen Terskelverdi .
    2. Velg terskelalgoritmen Otsu |B&W | Mørk bakgrunn alternativ. Vær oppmerksom på at bildet nå er binarisert.
    3. I dialogboksen Terskel observerer du histogrammet for fluorescensintensitetsfordelingen og terskelverdien som vises.
      MERK: Mitokondri-positive bildepunkter har fluorescensintensitetsverdier som er større enn terskelen, og vises som hvite bildepunkter i det binære bildet.
    4. Bruk terskelen på den binære bildestakken ved å velge Bruk. I dialogboksen Konverter stakk til binær som vises, velger du alternativene Beregn terskel for hvert bilde, Svart bakgrunn, Opprett ny stakk og klikker OK.
  5. Vær oppmerksom på at en stabel med de tre binære bildene genereres (BinDMito-stack). Lagre den i TIFF-format.
  6. Beregn mitokondriell tetthet i BinDMito-stakken som følger:
    1. Velg Analyser-menyen . Deretter klikker du Histogram. Klikk Ja i dialogboksen som vises i histogrammet, for å inkludere alle bildene i stakken for analyse.
    2. Klikk Liste i dialogboksen Histogram for stakk for å hente histogramdataene. Overføre histogramdataene til et regneark.
    3. I et regneark, identifiser Mito-piksler som er de med 255-verdien . Beregn mitokondriell tetthet ved hjelp av ligning (1):
      Mitokondriell tetthet = Equation 1 × 100 (1)
      Totalt antall bildepunkter identifiseres som N i dialogboksen Histogram eller beregnes ved å summere bildepunktantallet for histogrammet i regnearket.
    4. For å beregne arealet okkupert av mitokondrier (μm2), multipliser Mito-pikslene til BinDMito-stakken med pikselstørrelsen.

5. Analyse av mitokondriell fordeling ved Fast Fourier Transform

  1. I åpen kildekode-plattformen for biologisk bildeanalyse åpner du BinDMito-stakken og tegner en rektangulær avkastning på 256 piksler bredde og 5 μm høyde. Finn en ROI i en sentral posisjon og en annen i sidestilling, som vist i figur 4A, B.
  2. Bruk ROI Manager-verktøyet til å konfigurere avkastningen for FFT-analyse og lagre den.
    MERK: I henhold til nødvendighetene i analysen kan andre avkastninger velges i forskjellige posisjoner, og størrelsene deres kan endres. Likevel må bredden være lik 2n piksler for å utføre FFT (f.eks. 128, 256, 512 piksler).
  3. Hent plottprofilen til avkastningen ved hjelp av hurtigkommandoen + k og overfør dataene til et regneark.
  4. I regnearket fyller du B- og C-kolonner med dataene hentet fra plottprofilen. B-kolonnen inneholder avstanden i μm, og C-kolonnen den tilsvarende gråverdien av fluorescensintensiteten (A.U.).
  5. D-kolonnen tilsvarer FFT-frekvensen (hendelse/μm), som fylles som følger:
    1. Beregn samplingsfrekvensen (Fs): Fs = 1/Δ d, hvor Δd er avstandstrinnet (den andre verdien av B).
    2. Beregn Δ Fs: Δ Fs= Fs / N, hvor N er antall datapunkter til B (256).
    3. Beregn stoppverdien for FFT-frekvens (S): S = (N/2) ×ΔF.
    4. Fyll D-kolonnen som følger:
      1. Den første verdien i D-kolonnen er lik 0.
      2. Velg den andre cellen i D-kolonnen , gå til startmenyen, velg fyll og klikk serie. Velg kolonner. For intervallverdien bruker du den beregnede Δ Fs. For stoppverdien bruker du den beregnede S.
    5. Deretter fyller du E-kolonnen med FFT-komplekse verdier som følger:
      1. Sett inn 0 i den første cellen i C-kolonnen, fordi avstanden 0 må falle sammen med et signal 0 for beregning av FFT.
      2. Gå deretter til Data-menyen, klikk Dataanalyse og velg Fourieranalyse.
      3. I det nye vinduet velger du datapunktområdet for det fluorescerende signalet beskrevet i kolonne C for inngangsområdet.
        MERK: Antall datapunkter må være 2n (f.eks. 256 eller 128 datapunkter med fluorescerende signal).
      4. Velg det tilsvarende området for E for utdataområdet.
      5. Velg OK og la FFT-komplekse verdier fylles ut automatisk.
  6. Fyll F-kolonnen med FFT-størrelsen som følger:
    1. Bruk IMABS-funksjonen til å returnere absoluttverdien i F fra det komplekse tallet i E og multiplisere med 2/N for å normalisere (ligning (2)):
      FFT-størrelse = (IM.ABS (E1... En) × (2/N) (2)
  7. Plott FFT-spekteret ved hjelp av FFT-størrelsen i F, som en funksjon av FFT-frekvensen i D, til S. Finn punktet for den maksimale toppen og dens tilsvarende FFT-frekvens.
  8. Konverter FFT-frekvensen til den maksimale toppen til avstand med ligning (3). Denne beregnede avstanden representerer lengdeavstanden til mitokondriefordelingen.
    Avstand (μm) = 1/FFT-frekvens (3)
    MERK: På grunn av FFT-symmetri må du ikke plotte FFT-frekvensen utover S-verdien, som tilsvarer halvparten av datapunktene, og unngå duplisering av FFT-spekteret .

6. Valgfrie forbehandlingstrinn for å redusere bildestøy før bildeanalyse

  1. Bruk et medianfilter eller en 2D-dekonvolusjon som følger:
    1. For medianfilter:
      1. Velg prosess | Filtre og klikk på Median-alternativet .
      2. I dialogboksen Median som vises, velger du 2.0 for Radius og klikker OK. Velg Ja for å bruke prosessen på alle bildene i Mito-stacken.
      3. Vær oppmerksom på reduksjonen av støy i bildene.
    2. For 2D-dekonvolusjon:
      1. Generere en teoretisk punktspredningsfunksjon (PSF).
      2. Last ned plugin-PSF_Generator.jar og plasser filen i "Plugins" -mappen.
      3. I dialogboksen PSF-generator klikker du på alternativet Born &; Wolf 3D optisk modell, skriv inn nedsenkingsverdien for brytningsindeks på 1,33 som ble brukt under konfokalskanning, og velg Best for alternativet Nøyaktighetsberegning .
      4. Capture 576 nm for emisjonsbølgelengde, NA for objektivlinsen som brukes på 0,7, og Z-trinnet på 3,000 nm.
      5. Ta pikselstørrelsen XY på konfokalbildet som skal dekonvoluteres, samt størrelsen XYZ som indikerer antall piksler på X og Y og antall Z-trinn (3 for denne protokollen).
      6. I Display-menyen til PSF-generatoren klikker du på alternativet lineært, velger 8 bits oppløsning, og velger deretter gråtonalternativet for oppslagstabellen (LUT).
      7. Kjør PSF generator og lagre den teoretiske PSF opprettet i TIFF-format.
      8. Lag en sum av stykker av PSF opprettet ved å åpne Z Project-verktøyet for alternativet Stabler som ligger i Bilde-menyen .
      9. I dialogboksen ZProjection som vises, velger du Summer stykker for typen Projeksjon og klikker OK. Lagre den nye PSF i TIFF-format.
        MERK: En PSF oppnådd eksperimentelt ved konfokal skanning fluorescerende mikroperler med en kjent diameter kan brukes i stedet for den teoretiske PSF.
      10. Last ned pluginet "DeconvolutionLab_2.jar"19 og legg det i plugin-mappen.
      11. Klikk på menyen Plugins. Klikk deretter DeconvolutionLab2.
      12. Skill de konfokale bildene fra Mito-stabelen ved hjelp av verktøyet Bilder å stable fra Stabler-alternativet i Bilde-menyen og lagre det i TIFF-format.
      13. I dialogboksen DeconvolutionLab2 velger du ett av bildene hentet fra Mito-stacken. Velg den teoretiske PSF opprettet, og velg algoritmen Richardson-Lucy med 15 iterasjoner.
      14. Kjør DeconvolutionLab2, kontroller signalforbedring og støyreduksjon i bildet, og lagre det i TIFF-format.
  2. Fortsett med trinn 4.4 for bildeanalyse.
  3. For terskelverdien for de kronglete bildene, konverter dem til en 8-biters maske under terskelverdiprosessen. Opprett en stabel med binære og kronglete bilder ved å velge Bilder som skal stables i Stabler-verktøyet på Bilde-menyen .
  4. For FFT-analysen av deconvoluted bilder inneholder plottprofilen avstand i pikselenheter. Transformer bildepunktenhetene til μm på følgende måte:
    1. I regnearket, etter å ha fullført trinn 5.4, overfører du dataene fra B til A. Deretter fyller du B med avstanden i μm ved å multiplisere hvert pikselnummer fra A med pikselstørrelsen.

Representative Results

Etter denne protokollen kan analysen av tetthet og fordeling av mitokondrier oppnås i levende skjelettmuskulatur. Protokollen er delt inn i tre hovedfaser: Skjelettmuskulaturbuntdisseksjon, konfokalmikroskopiskanning og bildeanalyse. Oversikten over arbeidsflyten er vist i figur 1. Figur 2A viser en hel gastrocnemiusmuskel fra rotter i en petriskål, som markerer sidehodet som fibrene hentes fra, mens figur 2B viser fiberbuntene i Relax-løsningen. Ved konfokalmikroskopi kan mitokondriene registreres langs dybden av levende skjelettmuskelfiber ved hjelp av fluorescerende indikator TMRE. TMRE er en lipofil kationisk fluorofor som selektivt akkumuleres i mitokondrier i henhold til mitokondriemembranpotensialet20.

Et optimalt konfokalbilde av IMF kan oppnås ved å velge en Z-avstand over 15 μm dybde i fiberen (figur 3A). Figur 3B viser representative XY konfokale bilder av mitokondrier lastet med TMRE ervervet langs gastrocnemius muskelfibres Z-avstand (15 til 21 μm). De konfokale bildene ble behandlet ved terskel for å transformere dem til binære bilder for å tillate mitokondriell analyse. Figur 3B (venstre panel) viser en fiber fra en trent mager rotte. Det representerer en forventet konfokal registrering av skjelettmuskulatur fiber mitokondrier siden den har et konsistent mønster langs fiberen. Derimot valgte vi en fiber fra en Ob-rotte (figur 3B, høyre panel) som viser betydelige endringer i mitokondrieinnhold og distribusjon. Figur 3C viser kvantifiseringen av fiberområdet okkupert av mitokondriene uttrykt som mitokondriell tetthet, hentet fra hvert binarisert bilde (vist i panel B). Som forventet presenterte Ob-fiberen en lavere mitokondriell tetthet. Det ble kvantifisert konsekvent langs Z-avstanden som ble analysert, som også observeres i figur 3D når mitokondrietettheten beregnes per stabel som samsvarer med de tre konfokale bildene som er oppnådd ved 15, 18 og 21 μm.

I likhet med mitokondriell tetthetsanalyse, gjør konfokal skanning av en fluorescerende indikator for levende celleavbildning, som TMRE, det mulig å studere den langsgående organisasjonen av mitokondrier i levende skjelettmuskulatur. IMF presenterer en periodisk organisasjon i I-båndet nær TT7, som kan analyseres av FFT for å kvantifisere frekvensen av mitokondriesignalet og organisasjonsnivået17. Figur 4 viser forskjellene i organiseringen av IMF funnet i gastrocnemius avledet fra Lean og Ob rotter og hvordan FFT gjør det mulig å finne endringene i fordelingen av mitokondriesignalet. Figur 4A,B viser langsgående avkastning valgt i sentral og lateral posisjon i fiberen for FFT-analyse. Før du utfører FFT, beregnes terskelen for bakgrunnssubtraksjon. Deretter blir bildet binarisert; Disse prosedyrene eliminerer variasjonene i fluorescensintensitetsnivåer av mitokondriesignalet. Det binære bildet gir plottprofilen for fluorescensfordeling som er nødvendig for å utføre FFT.

Figur 4C,D viser de valgte avkastningene i panel A og B med deres plottprofiler (øvre paneler). Fra plottprofilene kan forskjeller i fluorescensfordelingen mellom fibrene avledet fra Lean og Ob-rotter observeres, samt variasjonene mellom avkastning innenfor samme fiber. For hver plottprofil presenteres deres respektive FFT-spektrum (nedre paneler). Toppen av det maksimale FFT-spekteret indikerer FFT-frekvensen (X-aksen) av mitokondriell signalfordeling langs lengdeaksen. Det kan omdannes til en avstandsverdi nær 2 μm i lateral og sentral avkastning fra den magre rotten. Spesielt er FFT-størrelsen på toppen en indeks for regelmessigheten av mitokondriesignalet, og endringer i denne amplituden avslører endringer i mitokondriefordelingen.

Figur 4E,F viser forskjellene i FFT-spekteret mellom magre og Ob-avledede fibre der henholdsvis laterale og sentrale avkastninger ble analysert. I laterale avkastninger (figur 4E) var frekvensen av mitokondriell langsgående fordeling lik i de magre og Ob-avledede fibrene; Likevel var amplituden til den maksimale FFT-toppen i Ob-avledede fibre høyere, noe som er i samsvar med den høyere regulariteten til signalet observert i bildet i figur 4B. Likevel er den sentrale avkastningen (figur 4F) av Ob observert som et eksempel på en kritisk reduksjon av FFT-toppen sammenlignet med Lean når en viktig endring av mitokondriefordelingen er tilstede.

Figure 1
Figur 1 Skjema for mitokondrieanalyse i skjelettmuskulatur ved konfokalmikroskopi. Denne ordningen oppsummerer protokollens hovedtrinn i tre separate faser. Den første fasen, disseksjon av gastrocnemius muskelfiberbunter, er delt inn i tre påfølgende trinn, gastrocnemius muskelisolasjon, etterfulgt av muskelmekanisk disseksjon i bunter for endelig å gjøre et visuelt utvalg av de levedyktige. Den andre fasen består av levende celleavbildning ved konfokalmikroskopi, som består av inkubering med fluoroforen (TMRE) i 20 minutter ved romtemperatur for å plassere fibrene i kammeret. Etterpå gjøres de riktige innstillingene i mikroskopet for å gjennomføre oppkjøpet av konfokalbildene. I tredje fase utføres konfokal bildebehandling og dataanalyse. Starter med bildebehandling, hvor det kreves en terskel for å generere binære bilder hvorfra mitokondrielle tetthetsberegninger og mitokondriell fordeling av FFT gjøres. Forkortelser: TMRE = tetrametylrhodamin etylester; FFT = Rask Fourier-transformasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Disseksjon av skjelettmuskulatur. (A) Dissekert rotte lateralt gastrocnemiushode (svart pil) i en petriskål med Relax-løsning. (B) Representativt bilde av gastrocnemius muskelfiberbunter i Relax-løsning før TMRE-belastning. Forkortelse: TMRE = tetrametylrhodamin etylester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Mitokondriell tetthetsanalyse. (A) Illustrasjon som representerer Z-avstanden som anbefales for konfokal skanning av IMF-mitokondrier i skjelettmuskelfibre. (B) Serie av konfokale bilder av mitokondrier lastet med TMRE i skjelettmuskelfibre, hentet fra en utøvd Zucker +/+ rotte (Lean) og fra en overvektig Zucker fa/fa rotte (Ob) registrert i Z-avstanden (fra 15 til 21 μm dybde). Bildene ble behandlet ved terskel og transformert til binære bilder. (C) Beregnet mitotetthet av konfokalskivene oppnådd ved forskjellige Z-avstander observert i panel B. (D) Mitotettheten oppnådd fra stakken komponert av bildene observert i panel B. Bilder i panel B er 65 x 50 μm. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: Mito-tetthet = Mitokondriell tetthet; IMF = intermyofibrillære mitokondrier; Ob = overvektig; SSM = subsarcolemmale mitokondrier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Mitokondriefordelingsanalyse ved FFT. Representative konfokale bilder av mitokondrier lastet med fluorescerende indikator TMRE ervervet ved 21 μm av dybden av skjelettmuskelfibre oppnådd fra en utøvd Zucker +/+ rotte (Lean, panel A) og fra en overvektig Zucker fa / fa rotte (Ob, panel B). Bildene ble behandlet ved terskel og transformert til binære bilder. Laterale og sentrale avkastninger fra panel A (panel C) og panel B (panel D) med sine respektive plottprofiler av fluorescensintensitet (øvre plott) og FFT-spektrum (nedre plott). FFT ble beregnet ut fra ROI med 256 pikslers bredde, noe som tilsvarer en ROI-størrelse på 39 x 5 μm i panel A og en ROI-størrelse på 50 x 5 μm i panel B. Panel E viser forskjellene i FFT-spekteret funnet mellom mitokondrier avledet fra magre og Ob-rotter i lateral ROI, mens panel F viser forskjellene i FFT-spekteret av sentral ROI. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: A.U. = vilkårlige enheter; FFT = rask Fourier-transformasjon; ROI = regioner av interesse; Ob = overvektig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reagent Endelig konsentrasjon i 100 ml Lager 
K-aspartat 100 mM
KCl 20 mM
HEPES 20 mM
L-glutaminsyre 3 mM
Malinsyre 3 mM
EGTA 0,1 mM 10 mM
MgCl2 1 ml fritt Mg2+
CaCl2 0,00002 mM fri Ca2+
Fosfokreatin di-Na 5 mM 500 mM
Kreatinfosfokinase 5 E/ml 200 U/ml
MgATP 5 mM
pH 7,3 (med NaOH)

Tabell 1: Slapp av løsningsreagenser og konsentrasjon.

Tilleggsfigur S1: Effekt av metoder for forbehandling av bilder. (A) Representative konfokale bilder av mitokondrier lastet med fluorescerende indikator TMRE ervervet på en dybde på 18 μm i skjelettmuskelfibre oppnådd fra en utøvd Zucker +/+ rotte (Lean, øvre panel) og fra en overvektig Zucker fa / fa rotte (nedre panel), sammen med deres respektive bilder oppnådd etter forbehandling ved bruk av Otsu 'terskel, median filter og Otsu 'terskel, og 2D deconvolution og Otsu 'terskel. (B) Plotprofil av mito-tetthet oppnådd fra konfokale bilder (panel A) etter forbehandling med forskjellige metoder. Bilder i panel A er 65 x 50 μm. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: 2D-Decon = 2D dekonvolusjon; Mito-tetthet = Mitokondriell tetthet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Mitokondrier er organeller med høy ombyggingskapasitet. Deres innhold, tetthet og distribusjon kan raskt modifiseres gjennom aktivering av mitokondriell fusjon og fisjonsmekanismer, kjent som mitokondriell dynamikk1, og balansen mellom mitokondrielle omsetningsmekanismer: mitokondriell biogenese og den spesialiserte mitokondrienedbrytningsveien, mitofagi21,22. Mitokondrieinnhold og morfologi kan variere i henhold til celletype og utviklingsstadium og kan remodelleres under forskjellige fysiologiske og patologiske stimuli 17,22,23,24. Derfor har studiet av mitokondriell morfologi vært relevant i over et halvt århundre25. Spesielt har analysen av mitokondrier gjennom elektronmikroskopi vært standardteknikken som ble brukt i flere studier26.

Fluorescerende studier ved konfokalmikroskopi har fått relevans de siste årene på grunn av deres evne til levende celleavbildning av mitokondrier på forskjellige fiberdybder, noe som kan bidra til bedre å forstå mitokondriens rolle i skjelettmuskulatur i forskjellige adaptive og maladaptive forhold27. I denne studien beskrives en metodikk for analyse av mitokondrietetthet og distribusjon i levende skjelettmuskelfibre ved konfokalmikroskopi. En av hovedutfordringene ved å jobbe med levende skjelettmuskelfibre er å unngå sammentrekning fra isolasjonsprosessene opp til mitokondriell konfokal registrering. For å oppnå dette målet brukes en høy Mg og ATP Relax-løsning17 for å holde fibrene avslappet i minst 2 timer, noe som gir nok tid til å utføre fiberisolasjonsprosessen, fluoroforbelastningen og oppkjøpet av mitokondrielt signal ved konfokalmikroskopi. Et kritisk punkt i protokollen er å skaffe fibrene mekanisk siden det krever høy presisjon og ferskt vev; Det er imidlertid mulig å oppnå levedyktige fiberbunter fra rottemuskel med denne tidligere brukte og rapporterte teknikken28. Oppnåelse av intakte fibre gjør det mulig å bevare sarcolemma og det intracellulære miljøet, og holde metabolsk og funksjonell crosstalk mellom cellestrukturer28,29.

I motsetning til å arbeide med vev eller faste celler, tillater oppkjøpet av levende celleavbildningsfluorescerende bilder ved konfokalmikroskopi sanntidsovervåking av effekten av ulike eksperimentelle forhold. Den nåværende protokollen kan brukes til å utforske endringer i mitokondriell tetthet og distribusjon i sanntid og utforske forskjeller mellom eksperimentelle grupper, som eksemplene presentert her mellom magre og Ob-avledede fibre (figur 3 og figur 4). Det bør alltid vurderes at levende celleavbildning innebærer standardisering av optimale arbeidsforhold med mindre celleskader. Arbeidstiden, kvaliteten på løsningene som brukes, innsamlingsparametrene og eksponeringen av lasere må finkontrolleres. Derfor er viktige hensyn nevnt nedenfor.

Mitokondrier av muskelfibre kan ikke registreres helt i lengderetningen ved konfokalmikroskopi på grunn av fiberens størrelse og skade på fiberen som kan skyldes lang lasereksponering. Likevel registreres en representativ prøve av fiberen under denne teknikken. Selv om det er mulig å registrere hele tykkelsen av skjelettmuskelfibrene til en rotte ved konfokalmikroskopi, innebærer dette en lengre opptakstid og eksponering for laserstrålen. Når det gjelder kontrollrotter, har det ikke oppstått problemer med disse opptakene. Imidlertid kan fibre fra patologiske forhold være mer utsatt for skade som observert i fibrene fra Ob-rotter. Følgelig foretrekkes det å anskaffe en stabel med representative konfokale bilder oppnådd på forskjellige Z-avstander. Når bare en del av fibertykkelsen registreres, anbefales det å ta stabelen på samme dybde på alle testede fibre, siden mitokondriell fordeling og tetthet kan variere i henhold til dens posisjon i fiberen. Innsamling av signalet på en dybde over 15 μm anbefales for å få representative konfokale bilder av IMF, og unngå SSM-populasjoner som ligger nær periferien.

Under konfokaloppkjøpet må det tas noen viktige hensyn. Først valget av nedsenkingsobjektivlinsen med tanke på forstørrelse, høy NA og nedsenkingsmedium. Siden celler opprettholdes i et hydrofilt inkubasjonsmedium, må brytningsindeksen for inkubasjons- og nedsenkningsmediet lignes for å oppnå et godt signal og skanne dypt inn i vevet. Oppnås vanligvis ved hjelp av en objektivlinse for nedsenking i vann. Konfokale bilder av figur 3 og figur 4 ble tatt med et 20x, 0.7 NA, vannnedsenkingsmål. Dette målet tillater registrering av fiberen i all sin dybde, men skanning ved 15, 18 og 21 μm ble bestemt siden representative konfokale bilder av IMF kan oppnås med høyt fluorescensintensitetssignal og mindre fiberskade. Annen forstørrelse, for eksempel 40x og olje som nedsenkningsmedium, kan vurderes, men må vurderes.

For det andre beregnes pikselstørrelsen for bildeinnsamling i henhold til Nyquists teorem, som gjør det mulig å velge en passende pikselstørrelse som unngår oversample (høyere lasereksponering) og underprøve (fører til mindre oppløsning)30. Beregningen avhenger av egenskapene til det valgte objektivobjektivet og bølgelengden (~ 90 nm). Den kan justeres med zoomen; Derfor gir bare én zoominnstilling en optimal pikselstørrelse30. Likevel, i praksis, avhenger zoomen også av området av prøven som skal analyseres. Dermed gjør det mulig å finne balanse å jobbe med en pikselstørrelse som er nærmest Nyquist-kriteriet, og som også passer til området som skal analyseres. Figur 3 og figur 4 ble anskaffet med en pikselstørrelse på 150 og 190 nm, noe som tillot analyse av fiberens fulle bredde som er ~ 50-80 μm.

For det tredje bør en passende pinhole diameter som hindrer ut-av-fokus lys fra å nå detektoren brukes. Vanligvis regnes 1 Airy som den optimale pinhole-størrelsen siden den tillater deteksjon av ~ 80% av fotoner som stammer fra fokusplanet30. Likevel krever noen fargede biologiske prøver som viser lave fluorescensnivåer en pinhole økning30. Konfokale bilder av figur 3 og figur 4 ble tatt med en knappenålsstørrelse på 3 Airy på grunn av et lavt signal fanget med en lavere Airy. Det er viktig å vurdere at økningen i signalintensiteten som følge av å øke pinhole-størrelsen fører til reduksjon av oppløsningen på grunn av økt ufokusert fanget lys. Av denne grunn anbefalte vi å bruke en pinhole størrelse så nær 1 luftig som mulig.

Når de er tilstrekkelig anskaffet, kan konfokale bilder behandles for å oppnå kvantitativ informasjon om mitokondriell tetthet og distribusjon. Uansett må det kritiske prosesseringsbildetrinnet med terskelverdi utføres før analyse for å forbedre kvantifiseringen av signalet. Under dette avgjørende trinnet defineres fluorescensintensitetsverdien som skiller de positive pikslene for mitokondrier fra bakgrunnen. Terskelen kan defineres av en gaussisk passform av toppen som representerer mitokondrier når histogrammet til bildet viser to topper, en som svarer til bakgrunnen og den andre til mitokondriene. Det oppnås imidlertid ikke alltid en bimodal fordeling i hvert av bildene, så andre terskelmetoder må brukes.

I denne protokollen beskrives implementeringen av Otsus terskelverdi, som er en ikke-parametrisk og ikke-overvåket metode designet for å finne terskelverdien når de to toppene ikke er atskilt, eller andre topper er til stede31. Otsu kan enkelt brukes ved hjelp av en åpen kildekode-plattform for biologisk bildeanalyse; Imidlertid kan andre terskelmetoder testes. Den samme terskelmetoden må brukes på alle konfokale bilder og må beregnes uavhengig for hvert konfokale bilde. Bruk av terskelen på en hel stabel fører til feil resultater. Når de binære bildene er oppnådd etter terskelprosessen, kan analysen av mitokondriell tetthet og FFT enkelt utføres ved å følge instruksjonene beskrevet i denne protokollen. Imidlertid bør man være forsiktig når man utfører begge analysene for å unngå å inkludere kjerner og kapillærer, da det vil føre til kvantifiseringsfeil. Når det gjelder tetthet, er det nok å trekke pikslene, eller området okkupert av kjernene eller kapillærene, fra pikslene eller det totale arealet som skal analyseres. I tillegg, når du utfører FFT-analysen, må det verifiseres at mitokondriesignalet er rett. Omvendt, når mitokondriesignalet er vippet, kan det produsere profiler som ikke representerer mitokondriell lengdefordeling, noe som gir feil FFT-spektrumdata. I tillegg kan et forbehandlingstrinn brukes for å redusere støyen i bildene. Denne protokollen beskriver to valgfrie forhåndsbehandlingstrinn ved hjelp av et medianfilter og 2D-dekonvolusjon. Effektene av disse forbehandlingsmetodene på bilde- og mitokondrietetthetsinnholdet er presentert i tilleggsfigur S1. Det er viktig å tenke på at selv om disse forprosessene kan forbedre bildekvaliteten, kan de også føre til tap av visse bildedetaljer. Derfor bør de brukes med forsiktighet og konsekvent brukes på alle bildene som analyseres.

Til tross for fordelene er konfokalmikroskopi begrenset av en lateral oppløsning (XY) på 180-250 nm når de optimale betingelsene for oppkjøp er implementert32. Mitokondriell diameter er ~ 200-700 nm, nær diffraksjonsgrensen for konfokal mikroskopi; Submitokondrielle strukturer kan derfor ikke påvises tilstrekkelig33 og kan ikke evalueres ved tetthets- og FFT-analyser vist i denne protokollen. Andre superoppløsningsteknikker for mikroskopi, som stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), stimulert utslippsuttømming (STED) nanoskopi eller strukturert belysningsmikroskopi (SIM), kan utforskes for å løse submitokondrielle strukturer32. I denne protokollen oppnås de konfokale bildene av mitokondrier ved bruk av fluoroforen TMRE, som avhenger av mitokondriemembranpotensialet. Derfor kan mitokondriell fluorescerende intensitet variere i henhold til deres membranpotensial. En terskelprosess utføres før dataanalysen for å løse dette problemet. Alle pikslene over en definert terskel anses som positive for mitokondriesignal uavhengig av fluorescensverdien. Likevel må det bemerkes at mitokondrier med svært lavt membranpotensial ikke kan løses med denne teknikken. Derfor anbefales komplementære studier av kvantifisering av mitokondrielt proteininnhold. En fordel med å bruke TMRE er at konfokale bilder også kan brukes til mitokondriemembranpotensialanalyse, men tilstrekkelige kontroller med frakoblingsmidler må utføres som karbonylcyanid-p-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP). I tillegg kan instruksjonene for mitokondriell tetthet og distribusjonsanalyse oppnås ved hjelp av grønne fluorescerende indikatorer for mitokondrier, som laster mitokondrier uavhengig av membranpotensialet, men inkubasjonsstrategi og konfokale oppkjøpsinnstillinger må standardiseres.

Gitt at mitokondriestrukturen er relatert til essensielle mitokondrielle og cellulære funksjoner, kan protokollen beskrevet her gi verdifull informasjon om deres remodellering under sykdom eller ved en bestemt stressfornærmelse. Det kan bidra til en bedre forståelse av nøkkelfunksjoner i skjelettmuskulaturen styrt av mitokondrier, for eksempel energiproduksjon, eller hvor mitokondrier spiller en viktig rolle i samspill med andre organeller, for eksempel sammentrekning-metabolismekobling. Å følge protokollinstruksjonene tillater estimering av mitokondriell tetthet og distribusjon i levende skjelettmuskulatur. Protokolltrinnene er delt inn i tre hovedfaser med fokus på disseksjon av skjelettmuskulaturbunter, konfokalmikroskopiskanning og bildeanalyse, der detaljerte instruksjoner og viktige hensyn er inkludert. Spesielt kan protokollen optimaliseres ytterligere for å utforske flere Z-trinn for full mitokondriell rekonstruksjon i fiberen i henhold til brukerens nødvendigheter. For eksempel kan konfokalbilde- og analysetrinnene testes for å studere cellulære strukturer med lignende fordeling, for eksempel TT i levende og faste prøver.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av School of Medicine og The Institute for Obesity Research of Tecnologico de Monterrey. Figur 3A ble opprettet med programvare for vitenskapelig bilde og illustrasjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A6419
Borosilicate glass coverslip Warner Instruments 64-0709
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670
Confocal microscope Leica TCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite  Leica 2.7.3.9723
Creatine Phosphokinase Sigma-Aldrich C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate Sigma-Aldrich 11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Forceps Miltex MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective  Leica 506517
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iris scissors Miltex 5-304
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
Maxchelator UC Davis Health https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm 
Micro scissors Miltex 18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji  Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji https://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ 
Recording chamber Warner Instruments RC-27N
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Spreadsheet Microsoft Excel Microsoft 
Stereo microscope Zeiss Stemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl ester Invitrogen T669

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
  2. De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. Skeletal muscle mitochondria in health and disease. Cell Calcium. 94, 102357 (2021).
  3. Chang, C. R., Blackstone, C. Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1. Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).
  4. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305 (2021).
  5. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role. Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).
  6. Díaz-Vegas, A. R., et al. Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism. Frontiers in Physiology. 9, 791 (2018).
  7. Boncompagni, S., et al. Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures. Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).
  8. Reggiani, C., Marcucci, L. A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers. The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167 (2022).
  9. Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).
  10. Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skeletal Muscle. 1 (1), 26 (2011).
  11. Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).
  12. Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes. Life Sciences. 264, 118700 (2021).
  13. Song, L. S., et al. Orphaned ryanodine receptors in the failing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).
  14. Houzelle, A., et al. Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity. Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).
  15. Call, J. A., et al. Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).
  16. Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging. Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).
  17. Rivera-Alvarez, I., et al. A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers. Life Sciences. 256, 117965 (2020).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).
  19. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  20. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  21. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  22. Meinild, L. A. -K., et al. Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis. Acta Physiologica. 222 (1), (2018).
  23. Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. Exercise and mitochondrial health. Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).
  24. Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases. Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).
  25. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  26. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  27. Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization. Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).
  28. Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
  29. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles. International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252 (2022).
  30. Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer, Boston, MA. (2006).
  31. Otsu, N. A. Threshold selection method from gray-level histogram. IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  32. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  33. Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. Light microscopy of mitochondria at the nanoscale. Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).

Tags

Biologi utgave 202
Analyse av mitokondriell tetthet og langsgående fordeling i levende skjelettfibre hos rotter ved konfokal mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pérez-Treviño, P.,… More

Pérez-Treviño, P., Nieblas, B., López-Vaquera, S. R., García, N. Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65306, doi:10.3791/65306 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter