Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل كثافة الميتوكوندريا والتوزيع الطولي في ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية للفئران بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65306
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3
1Experimental Medicine and Advanced Therapies, The Institute for Obesity Research, Tecnologico de Monterrey, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Preclinical Research Unit, Tecnologico de Monterrey

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحليل التغيرات في كثافة الميتوكوندريا والتوزيع الطولي عن طريق تصوير العضلات والهيكل العظمي الحي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لمسح شبكة الميتوكوندريا.

Abstract

الميتوكوندريا هي عضية يمكن استطالها وتجزئتها وتجديدها وفقا لمتطلبات التمثيل الغذائي للخلايا. تسمح إعادة تشكيل شبكة الميتوكوندريا للميتوكوندريا الصحية بتلبية المتطلبات الخلوية. ومع ذلك ، فقد ارتبط فقدان هذه القدرة بتطوير أو تطور أمراض مختلفة. في العضلات الهيكلية ، لوحظت تغيرات في كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في الحالات الفسيولوجية والمرضية مثل التمارين الرياضية والشيخوخة والسمنة وغيرها. لذلك ، قد توفر دراسة شبكة الميتوكوندريا فهما أفضل للآليات المتعلقة بهذه الظروف.

هنا ، يتم وصف بروتوكول لتصوير الميتوكوندريا لألياف العضلات والهيكل العظمي الحية من الفئران. يتم تشريح الألياف يدويا في محلول مريح ويتم تحضينها بمؤشر تصوير الخلايا الحية الفلورية للميتوكوندريا (إستر إيثيل رباعي ميثيل رودامين ، TMRE). يتم تسجيل إشارة الميتوكوندريا بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام وضع المسح XYZ للحصول على صور متحدة البؤر لشبكة الميتوكوندريا بين الليفي العضلي (IMF). بعد ذلك ، تتم معالجة الصور متحدة البؤر عن طريق العتبة و binarization. تمثل الصورة متحدة البؤر ثنائية البؤر وحدات البكسل الموجبة للميتوكوندريا ، والتي يتم عدها بعد ذلك للحصول على كثافة الميتوكوندريا. تتميز شبكة الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية بكثافة عالية من سكان صندوق النقد الدولي ، والتي لها توزيع طولي دوري مشابه لتوزيع الأنابيب التائية (TT). تحويل فورييه السريع (FFT) هو تقنية تحليل قياسية يتم إجراؤها لتقييم توزيع TT الذي يسمح بإيجاد تردد التوزيع ومستوى مؤسستهم. في هذا البروتوكول ، يتم وصف تنفيذ خوارزمية FFT لتحليل توزيع الميتوكوندريا الطولية في العضلات الهيكلية.

Introduction

تشكل الميتوكوندريا شبكات ديناميكية للغاية يتم تنظيمها بشكل أساسي من خلال التوازن بين استطالة (الانصهار) والتجزئة (الانشطار)1,2 ، والتي يتم تعديلها من خلال التعبير عن ونشاط البروتينات مثل Mitofusin 1 و 2 (Mfn1 و Mfn2) ، وضمور البروتين البصري 1 (Opa1) ، والتي تنظم اندماج غشاء الميتوكوندريا الخارجي والغشاء الداخلي ، على التوالي 1,2. ينظم البروتين المرتبط بالدينامين (Drp1) في الغالب انشطار الميتوكوندريا عندما يتم فسفرته في Ser6163.

في العضلات الهيكلية ، ثبت جيدا أن شبكة الميتوكوندريا مرتبة في مجموعات فرعية محددة جيدا من الناحية الهيكلية بناء على قربها من مناطق الخلايا المختلفة (اللييفات العضلية ، الساركوليما ، والنوى)4,5. تسمى تلك الميتوكوندريا الموجودة أسفل الساركوليما مباشرة الميتوكوندريا تحت اللقمة (SSM) ، وتسمى تلك الموجودة بين خيوط الانقباض الميتوكوندريا بين الليفي (IMF) ، وتسمى مجموعة الميتوكوندريا الفرعية حول النوى شبكة الميتوكوندريا المحيطة بالنواة (PMN). علاوة على ذلك ، فقد اقترح أن هذه المجموعات الفرعية للميتوكوندريا لها وظائف خاصة بالمنطقة وهي متخصصة في التمثيل الغذائي 4,5.

يعتمد الحفاظ على توازن الطاقة الخلوية ، والذي يسمح بوظيفة التمثيل الغذائي والانقباض ، إلى حد كبير على التفاعل والتواصل في مواقع محددة من خلال شبكة الميتوكوندريا (على سبيل المثال ، تفاعل IMF و SSM)4,6. بالإضافة إلى تفاعلات شبكة الميتوكوندريا ، يمكن أن تتفاعل الميتوكوندريا أيضا مع العضيات الأخرى ، وتشكل مجمعات هيكلية ووظيفية. في هذا الصدد ، تبين أن صندوق النقد الدولي يمكن أن يكون بجوار الشبكة الساركوبلازمية (SR) وعلى مقربة من وحدات إطلاق الكالسيوم2+ (CRU) ، التي تشكلها الأنابيب المستعرضة (TT)7. هذه الحقيقة ذات صلة بسبب دور امتصاص الميتوكوندريا Ca2+ في تنظيم تخليق ATP وموت الخلايا المبرمج. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح دور محتمل في تنظيم عابري Ca2+ الخلوي8.

TT هي غزوات الساركوليما التي لها توزيع دوري على طول المحور الطولي لخلايا عضلة القلب وألياف العضلات الهيكلية 9,10 ، على غرار توزيع صندوق النقد الدولي5. التغييرات في توزيع TT لها آثار فسيولوجية مهمة ، نظرا لدورها في وظيفة انقباض. ومع ذلك ، فقد تم تقييم هذه التغييرات بشكل رئيسي في خلايا عضلة القلب. يسمح استخدام تحليل تحويل فورييه السريع (FFT) بتحويل الإشارات الدورية من مجال المسافة إلى مجال التردد ، مما ينتج عنه طيف FFT يشير إلى تردد وانتظام الإشارة11،12،13. على الرغم من وجود أدلة على أن تنظيم شبكة الميتوكوندريا في ألياف العضلات الهيكلية أمر ضروري للتكيف مع الظروف الأيضية المختلفة ، كما هو الحال أثناء التجديد بعد إصابة العضلات14,15 ، يتم إجراء معظم التحليلات نوعيا.

بالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى أن الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا قد ارتبط بالعديد من الأمراض المرتبطة بالعضلات والهيكل العظمي (على سبيل المثال، ضمور الإهمال)2 والأمراض غير العضلية، وخاصة الأمراض الأيضية، وما يرتبط بها من فقدان كتلة العضلات (أي الضمور)16، فإن التقييم الكمي لشبكة الميتوكوندريا وتوزيعها في العضلات الهيكلية له أهميته. في الآونة الأخيرة ، هناك اختلاف كبير في التوزيع الطولي للميتوكوندريا من ألياف العضلات gastrocnemius بين مجموعة السمنة (Ob; Zucker fa/fa rats) ، ومجموعة هزيلة (Lean; زوكر +/+ الجرذان) من خلال FFT17. أظهرت هذه الدراسة فائدة FFT في تحليل توزيع الميتوكوندريا. لذلك ، يقدم هذا البروتوكول منهجية لدراسة الميتوكوندريا في ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية من الصور التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر البؤري الفلوري. يتم تحديد كثافة الميتوكوندريا من خلال عتبة الخلفية ، كما يتم وصف تحليل توزيع الميتوكوندريا الطولية بواسطة تحليل FFT. يتم تقديم مخطط سير العمل في الشكل 1.

Protocol

تم تقييم جميع إجراءات التجارب على والموافقة عليها من قبل لجنة استخدام ورعايتها (CICUAL) التابعة لشركة Tecnologico de Monterrey (بروتوكول 2019-007). تم استخدام ذكور Zucker (+/+ و fa / fa) الذين تتراوح أعمارهم بين 12 و 13 أسبوعا لهذه الدراسة. تم الاحتفاظ بالحيوانات في ظروف تربية قياسية (12 ساعة / 12 ساعة دورة الضوء / الظلام ، رطوبة 40-60٪) وكان لديها إمكانية الوصول إلى الطعام (تشاو الفئران القياسي) والماء الإعلاني.

1. تكوين الحل

  1. تحضير محلول الاسترخاء الطازج عن طريق خلط المكونات الموضحة في الجدول 1. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
  2. احسب تركيز الكالسيوم الحر في محلول الاسترخاء باستخدام برنامج محاكاة لتحديد تركيز المعدن الحر.
  3. تحضير مخزون 5 مللي متر رباعي ميثيل رودامين إستر ميثيل (TMRE) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتخفيف لاحق قدره 0.1 مللي متر في DMSO.

2. تشريح حزم الألياف العضلية gastrocnemius

  1. ضع داخل غرفة الحث وأغلق الغطاء. قم بتشغيل مصدر الأكسجين ، واضبط معدل تدفق الغاز على 0.5 لتر / دقيقة ، واضبط المرذاذ على 4٪ سيفوفلوران للحث على التخدير.
  2. بمجرد أن ينام الجرذ ، ضعه خارج الغرفة في وضع ضعيف مع الحفاظ على التخدير. قرصة إصبع القدم أو الذيل للتحقق من عدم وجود ردود الفعل.
  3. مع مقص ، وقطع من خلال جلد البطن والعضلات. ثم ، قطع القفص الصدري للوصول إلى القلب.
  4. لإجراء عملية استئصال القلب ، أمسك القلب من الأوردة والشرايين العلوية بالملقط واقطع الأوعية الدموية بالمقص. إزالة القلب.
  5. مباشرة بعد القتل الرحيم ، قم بتطهير الطرف الخلفي بالإيثانول وحلقه باستخدام آلة الحلاقة.
  6. امسك مؤخرة القدم وقم بعمل شق بالمقص عبر الجلد على مستوى وتر العرقوب.
  7. قطع الطرف الخلفي بمقص على مستوى الساق القريبة. انقله إلى طبق بتري 60 مم يحتوي على 3 مل من محلول الاسترخاء المثلج البارد في الوضع الظهري. قم بتغطيته بمحلول كاف لمنع العضلات من الجفاف.
  8. حدد وتر العرقوب ، وارفعه بعناية بالملقط ، وقم بتشريح العضلات بعيدا عن العظم بمقص القزحية. استخدم مجهرا مجسما من هذه الخطوة فصاعدا من التشريح.
  9. تحديد وفصل عضلة الساق بأكملها ، الجزء الأكبر الرئيسي في الجزء الخلفي من الطرف الخلفي.
  10. تشريح وتجاهل النسيج الضام والدهون المحيطة بالعضلات بالملقط الرفيع. انقل الرأس الجانبي للعضلة إلى طبق بتري جديد بمحلول استرخاء بارد (انظر الشكل 2 أ).
  11. امسك العضلات برفق بالملقط من أحد طرفيها وافصلها بعناية إلى حزم باستخدام مقص صغير. تعامل دائما مع الحزم عن طريق إمساكها برفق في أحد طرفيها بالملقط.
    ملاحظة: يبلغ طول الحزم حوالي 10 مم وعرضها 2 مم.
  12. انقل حزم الألياف إلى طبق بتري جديد مع 2 مل من محلول الاسترخاء المثلج. حدد فقط تلك التي لها مظهر سلس ، وكاملة من طرف إلى آخر ، ولا يتم تقصيرها (الشكل 2 ب).

3. اكتساب تصوير الخلايا الحية للميتوكوندريا في العضلات الهيكلية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر

  1. احتضان الألياف في 2.5 × 10-4 mM TMRE في محلول الاسترخاء لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: مع تركيزات العمل الموصى بها من TMRE ، من المتوقع أن تكون في وضع عدم التبريد. يحفظ بعيدا عن التعرض للضوء من هذه النقطة فصاعدا.
  2. خلال فترة الحضانة:
    1. افتح برنامج المجهر القياسي متحد البؤر ، وحدد إطار التكوين ، وفي مربع حوار تكوين الأجهزة ، حدد الليزر وحدد خيار HeNe 543 .
    2. في إطار الاستحواذ، حدد مربع حوار الاستحواذ، وفي وضع الاستحواذ، حدد لوحة XYZ.
    3. في مربع الحوار XY ، حدد تنسيق 512 × 512 ، وسرعة 400 هرتز ، وتحقق من لوحة الثقب. في مربع الحوار الثقب المعروض، حدد AU للوحدة وأضف قيمة 3 Airy للثقب.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك تقليل حجم الثقب الأقرب إلى المعيار الأمثل 1 Airy ، إذا تم الحفاظ على إشارة مضان كافية.
    4. في شاشة إعدادات مسار الحزمة ، حدد هدف غمر الماء 20x وفتحة رقمية (NA) 0.7 (20x/0.7 IMM)، وحدد نافذة الطول الموجي للانبعاث 576-700 نانومتر. حدد DD488 / 543 و 15٪ من طاقة الليزر لليزر 543.
      ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام عدسة هدف الغمر في الماء للمسح الضوئي للتصوير المباشر (إذا كانت متوفرة). منذ تحقيق معامل انكسار مماثل لوسط الغمر ووسط الحضانة.
  3. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، استبدل وسط الحضانة مرتين. تأكد من الحصول على الصور متحدة البؤر في غضون 20-30 دقيقة بعد الحضانة.
  4. قم بإعداد غرفة التسجيل بغطاء 0.15 مم من زجاج البورسليكات.
    ملاحظة: حدد سمك غطاء الغطاء وفقا لغرفة التسجيل المتاحة ، مع الأخذ في الاعتبار أن السماكة تتراوح عادة من 0.15 إلى 0.22 مم للحصول على الأداء الأمثل.
  5. أضف 200 ميكرولتر من محلول الاسترخاء إلى غرفة التسجيل وانقل حزم الألياف.
  6. في المجهر متحد البؤر ، استخدم وضع برايتفيلد لتحديد الألياف القابلة للحياة لتسجيل الفلورسنت للميتوكوندريا. الألياف القابلة للحياة كاملة ، غير متعاقدة ، ولها نمط تشقق سليم.
  7. افصل حزم الألياف عن بعضها البعض وقم بمحاذاتها مع الملقط. حدد تلك الأقرب إلى قسيمة الغطاء.
  8. امسح التألق ضوئيا باستخدام الزر المباشر لضبط الكسب والإزاحة في وحدة تحكم لوحة التحكم مع مراعاة ما يلي:
    1. حدد قيم كثافة الفلورسنت المنخفضة لخلفية ما يقرب من 0 وحدة عشوائية (A.U.).
    2. حدد مستوى كسب بين 100 و 200 A.U. لتجنب تشبع نظام التسجيل. وبالتالي ، لا تسجل أعلى مستويات مضان.
    3. حدد حجم بكسل 150-190 نانومتر للحصول على العرض الكامل للألياف ، واضبط عامل التكبير / التصغير في شاشة XY .
      ملاحظة: ضع في اعتبارك استخدام حجم البكسل أقرب إلى معايير Nyquist (90 نانومتر) ، مما يسمح بمسح العرض الكامل للألياف.
  9. في مربع حوار مكدس Z ، اضبط مسافة Z للحصول على إشارة مضان تبدأ من عمق ألياف 15 ميكرومتر (زر البدء) حتى 22 ميكرومتر (زر الإنهاء). حدد 3 ميكرومتر كحجم الخطوة Z.
  10. انقر فوق الزر "ابدأ" للحصول على الصور متحدة البؤر. احصل على مكدس Z يتكون من ثلاث صور متحدة البؤر تم الحصول عليها بعمق 15 و 18 و 21 ميكرومتر.

4. تحليل كثافة الميتوكوندريا

  1. في النظام الأساسي مفتوح المصدر لتحليل الصور البيولوجية18 افتح ملف Z-stack وقم بتدوير الصور لوضع الألياف أفقيا ، كما هو موضح في الشكل 3B.
  2. حدد عشوائيا منطقة مستطيلة ذات أهمية (ROI) تتضمن المنطقة التي تشغلها الميتوكوندريا (ROImito). حدد أحجام ميتو عائد الاستثمار التي تتراوح من 65 إلى 90 ميكرومتر ل X. بالنسبة ل Y ، سيعتمد الحجم على عرض الألياف ، وتجنب محيطها.
  3. قم بتكرار مكدس Z مع عائد الاستثمار المحدد ميتو واحفظه كمكدس Z جديد (Mito-stack) بتنسيق TIFF. احفظ موضع عائد الاستثمار ميتو المحدد في المكدس الأصلي باستخدام أداة مدير عائد الاستثمار.
  4. احسب عتبة طرح الخلفية كما يلي:
    1. استخدم أمر الاختصار+ العالي+t لفتح شاشة العتبة .
    2. حدد خوارزمية العتبة أوتسو |أبيض وأسود | خيار الخلفية الداكنة . لاحظ أن الصورة أصبحت الآن ثنائية.
    3. في مربع الحوار العتبة ، لاحظ الرسم البياني لتوزيع شدة التألق وقيمة العتبة التي يتم عرضها.
      ملاحظة: تحتوي وحدات البكسل الموجبة للميتوكوندريا على قيم شدة مضان أكبر من العتبة وتظهر كوحدات بكسل بيضاء في الصورة الثنائية.
    4. قم بتطبيق الحد على رصة الصور الثنائية بتحديد تطبيق. في مربع الحوار تحويل المكدس إلى ثنائي المعروض ، حدد الخيارات حساب الحد لكل صورة، خلفية سوداء، إنشاء مكدس جديد، وانقر فوق موافق.
  5. لاحظ أنه يتم إنشاء مكدس بالصور الثنائية الثلاثة (BinDMito-stack). احفظه بتنسيق TIFF.
  6. احسب كثافة الميتوكوندريا في مكدس BinDMito على النحو التالي:
    1. حدد القائمة تحليل . بعد ذلك ، انقر فوق الرسم البياني. في مربع الحوار مدرج تكراري معروض، انقر فوق نعم لتضمين كافة صور المكدس للتحليل.
    2. في مربع الحوار الرسم البياني للمكدس ، انقر فوق قائمة للحصول على بيانات الرسم البياني. نقل بيانات المدرج التكراري إلى جدول بيانات.
    3. في جدول بيانات، حدد وحدات البكسل Mito التي تحتوي على القيمة 255 . احسب كثافة الميتوكوندريا باستخدام المعادلة (1):
      كثافة الميتوكوندريا = Equation 1 × 100 (1)
      يتم تعريف إجمالي وحدات البكسل على أنها N في شاشة الرسم البياني أو يتم حسابها عن طريق جمع عدد وحدات البكسل في الرسم البياني في جدول البيانات.
    4. لحساب المساحة التي تشغلها الميتوكوندريا (ميكرومتر2) ، اضرب وحدات البكسل Mito في مكدس BinDMito في حجم البكسل.

5. تحليل توزيع الميتوكوندريا بواسطة تحويل فورييه السريع

  1. في النظام الأساسي مفتوح المصدر لتحليل الصور البيولوجية ، افتح مكدس BinDMito وارسم عائد استثمار مستطيل يبلغ عرضه 256 بكسل وارتفاعه 5 ميكرومتر. حدد موقع عائد الاستثمار في موضع مركزي وآخر في موضع جانبي ، كما هو موضح في الشكل 4 أ ، ب.
  2. استخدم أداة مدير عائد الاستثمار لتكوين عائد الاستثمار لتحليل FFT وحفظه.
    ملاحظة: وفقا لضرورات التحليل ، يمكن اختيار عائد استثمار آخر في مواضع مختلفة ، ويمكن تعديل أحجامها. ومع ذلك ، يجب أن يساوي العرض 2n بكسل لأداء FFT (على سبيل المثال ، 128 ، 256 ، 512 بكسل).
  3. احصل على ملف تعريف الرسم لعائد الاستثمار باستخدام الأمر المختصر + k وانقل البيانات إلى جدول بيانات.
  4. في جدول البيانات ، املأ العمودين B و C بالبيانات التي تم الحصول عليها من ملف تعريف المؤامرة. يحتوي العمود B على المسافة بالميكرومتر ، ويحتوي العمود C على القيمة الرمادية المقابلة لشدة التألق (A.U.).
  5. يتوافق العمود D مع تردد FFT (حدث / ميكرومتر) ، والذي سيتم ملؤه على النحو التالي:
    1. احسب تردد أخذ العينات (Fs): Fs = 1 / Δ d ، حيث Δd هي خطوة المسافة (القيمة الثانية ل B).
    2. احسب Δ Fs: Δ Fs= Fs / N ، حيث N هو عدد نقاط بيانات B (256).
    3. احسب قيمة التوقف لتردد (S) FFT: S = (N / 2) ×ΔFs.
    4. املأ العمود D كما يلي:
      1. القيمة الأولى للعمود D تساوي 0.
      2. حدد الخلية الثانية في العمود D ، وانتقل إلى القائمة الرئيسية ، وحدد تعبئة ، وانقر فوق سلسلة. حدد الأعمدة. بالنسبة لقيمة الخطوة ، استخدم Δ Fs المحسوبة. بالنسبة لقيمة الإيقاف ، استخدم S المحسوبة.
    5. بعد ذلك ، املأ العمود E بقيم FFT المعقدة كما يلي:
      1. أدخل 0 في الخلية الأولى من العمود C ، لأن المسافة 0 يجب أن تتزامن مع إشارة 0 لحساب FFT.
      2. ثم انتقل إلى قائمة البيانات ، وانقر فوق تحليل البيانات، وحدد تحليل فورييه.
      3. في النافذة الجديدة ، حدد نطاق نقاط البيانات لإشارة الفلورسنت الموضحة في العمود C لنطاق الإدخال.
        ملاحظة: يجب أن يكون عدد نقاط البيانات 2n (على سبيل المثال ، 256 أو 128 نقطة بيانات لإشارة الفلورسنت).
      4. حدد النطاق المقابل ل E لنطاق الإخراج.
      5. حدد موافق ودع قيم FFT المعقدة يتم ملؤها تلقائيا.
  6. املأ العمود F بحجم FFT كما يلي:
    1. استخدم الدالة IMABS لإرجاع القيمة المطلقة في F من العدد المركب في E واضربها في 2 / N للتطبيع (المعادلة (2)):
      حجم FFT = (IM.ABS (E1 ... En) × (2 / N) (2)
  7. ارسم طيف FFT باستخدام مقدار FFT في F ، كدالة لتردد FFT في D ، حتى S. أوجد نقطة الذروة القصوى وتردد FFT المقابل لها.
  8. حول تردد FFT للذروة القصوى إلى مسافة باستخدام المعادلة (3). تمثل هذه المسافة المحسوبة المسافة الطولية لتوزيع الميتوكوندريا.
    المسافة (ميكرومتر) = 1 / تردد FFT (3)
    ملاحظة: نظرا لتماثل FFT ، لا ترسم تردد FFT بما يتجاوز قيمة S ، والتي تتوافق مع نصف نقاط البيانات ، وتجنب تكرار طيف FFT.

6. خطوات المعالجة المسبقة الاختيارية لتقليل ضوضاء الصورة قبل تحليل الصورة

  1. قم بتطبيق مرشح متوسط أو فك التفاف 2D على النحو التالي:
    1. بالنسبة إلى الفلتر المتوسط:
      1. حدد العملية | تصفية وانقر على خيار الوسيط .
      2. في شاشة الوسيط المعروضة، حدد 2.0 لنصف القطر وانقر موافق. اختر نعم لتطبيق العملية على جميع الصور في مكدس Mito.
      3. لاحظ تقليل الضوضاء في الصور.
    2. لفك الالتفاف 2D:
      1. إنشاء دالة انتشار النقطة النظرية (PSF).
      2. قم بتنزيل PSF_Generator.jar المكون الإضافي وضع الملف في مجلد "المكونات الإضافية".
      3. في مربع حوار مولد PSF ، انقر فوق الخيار Born &Wolf 3D النموذج البصري ، وأدخل قيمة غمر معامل الانكسار 1.33 المستخدمة أثناء المسح البؤري ، وحدد الأفضل لحساب الدقة اختيار.
      4. التقط 576 نانومتر لطول موجة الانبعاث ، و NA للعدسة الشيئية المستخدمة 0.7 ، والخطوة Z البالغة 3000 نانومتر.
      5. التقط حجم البكسل XY للصورة متحدة البؤر المراد فك الالتفاف ، بالإضافة إلى الحجم XYZ الذي يشير إلى عدد وحدات البكسل X و Y وعدد خطوات Z (3 لهذا البروتوكول).
      6. في قائمة العرض الخاصة بمنشئ PSF ، انقر فوق الخيار خطي ، وحدد دقة 8 بت ، ثم حدد خيار الرمادي لجدول البحث (LUT).
      7. قم بتشغيل مولد PSF واحفظ PSF النظري الذي تم إنشاؤه بتنسيق TIFF.
      8. قم بعمل مجموع شرائح PSF التي تم إنشاؤها عن طريق فتح أداة Z Project للخيار مكدسات الموجودة في قائمة الصورة .
      9. في شاشة ZProjection المعروضة، حدد مجموع الشرائح لنوع الإسقاط، وانقر موافق. احفظ PSF الجديد بتنسيق TIFF.
        ملاحظة: يمكن استخدام PSF الذي تم الحصول عليه تجريبيا عن طريق مسح الميكروبيدات الفلورية ذات القطر المعروف بدلا من PSF النظري.
      10. قم بتنزيل المكون الإضافي "DeconvolutionLab_2.jar"19 وضعه في مجلد البرنامج المساعد.
      11. انقر فوق القائمة الإضافات. بعد ذلك ، انقر فوق DeconvolutionLab2.
      12. افصل الصور متحدة البؤر عن مكدس Mito باستخدام الأداة صور للتكديس من خيار Stacks الموجود في قائمة الصور واحفظه بتنسيق TIFF.
      13. في مربع الحوار DeconvolutionLab2 ، حدد إحدى الصور التي تم الحصول عليها من مكدس Mito. حدد PSF النظري الذي تم إنشاؤه ، وحدد خوارزمية ريتشاردسون-لوسي مع 15 تكرارا.
      14. قم بتشغيل DeconvolutionLab2 ، وتحقق من تحسين الإشارة وتقليل الضوضاء في الصورة ، واحفظها بتنسيق TIFF.
  2. تابع مع الخطوة 4.4 لتحليل الصور.
  3. لتحديد عتبة الصور غير الملتوية ، قم بتحويلها إلى قناع 8 بت أثناء عملية العتبة. قم بإنشاء رصة بالصور الثنائية وغير الملتوية بتحديد صور للتكديس في أداة الرصات من قائمة الصورة .
  4. لتحليل FFT للصور غير الملتوية ، يحتوي ملف تعريف الرسم على المسافة بوحدات البكسل. قم بتحويل وحدات البكسل إلى ميكرومتر على النحو التالي:
    1. في جدول البيانات ، بعد الانتهاء من الخطوة 5.4 ، انقل البيانات من B إلى A. بعد ذلك ، املأ B بالمسافة بالميكرومتر بضرب كل رقم بكسل من A في حجم البكسل.

Representative Results

باتباع البروتوكول الحالي ، يمكن تحقيق تحليل كثافة وتوزيع الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية الحية. ينقسم البروتوكول إلى ثلاث مراحل رئيسية: تشريح حزمة العضلات والهيكل العظمي ، والمسح المجهري متحد البؤر ، وتحليل الصور. يتم تقديم نظرة عامة على سير العمل في الشكل 1. يوضح الشكل 2 أ عضلة ساق الساق الكاملة للفئران في طبق بتري ، مع تحديد الرأس الجانبي الذي يتم الحصول على الألياف منه ، بينما يوضح الشكل 2 ب حزم الألياف في محلول الاسترخاء. بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، يمكن تسجيل الميتوكوندريا على طول عمق الألياف العضلية الهيكلية الحية باستخدام مؤشر الفلورسنت TMRE. TMRE هو فلوروفور كاتيوني محب للدهون يتراكم بشكل انتقائي داخل الميتوكوندريا وفقا لغشاء الميتوكوندرياالمحتمل 20.

يمكن الحصول على صورة متحدة البؤر مثالية لصندوق النقد الدولي عن طريق اختيار مسافة Z أعلى من 15 ميكرومتر من العمق داخل الألياف (الشكل 3A). يوضح الشكل 3B صورا تمثيلية XY متحدة البؤر للميتوكوندريا محملة ب TMRE المكتسبة على طول المسافة Z لألياف عضلات الساق (15 إلى 21 ميكرومتر). تمت معالجة الصور متحدة البؤر عن طريق العتبة لتحويلها إلى صور ثنائية للسماح بتحليل الميتوكوندريا. يوضح الشكل 3B (اللوحة اليسرى) أليافا من فأر هزيل ممارس. وهو يمثل سجلا متحد البؤر متوقعا لميتوكوندريا الألياف العضلية الهيكلية نظرا لأنه يحتوي على نمط ثابت على طول الألياف. في المقابل ، اخترنا أليافا من فأر Ob (الشكل 3B ، اللوحة اليمنى) تظهر تغيرات كبيرة في محتوى الميتوكوندريا وتوزيعها. يوضح الشكل 3C القياس الكمي لمساحة الألياف التي تشغلها الميتوكوندريا معبرا عنها بكثافة الميتوكوندريا ، والتي تم الحصول عليها من كل صورة ثنائية (كما هو موضح في اللوحة B). كما هو متوقع ، قدمت ألياف Ob كثافة ميتوكوندريا أقل. تم قياسه كميا باستمرار على طول المسافة Z التي تم تحليلها ، والتي لوحظت أيضا في الشكل 3D عندما يتم حساب كثافة الميتوكوندريا لكل كومة تتوافق مع الصور الثلاث متحدة البؤر التي تم الحصول عليها عند 15 و 18 و 21 ميكرومتر.

على غرار تحليل كثافة الميتوكوندريا ، يسمح المسح البؤري لمؤشر الفلورسنت لتصوير الخلايا الحية ، مثل TMRE ، بدراسة التنظيم الطولي للميتوكوندريا في العضلات الهيكلية الحية. يقدم صندوق النقد الدولي تنظيما دوريا في النطاق I بالقرب من TT7 ، والذي يمكن تحليله بواسطة FFT لتحديد تردد إشارة الميتوكوندريا ومستوى التنظيم17. يوضح الشكل 4 الاختلافات في تنظيم صندوق النقد الدولي الموجودة في gastrocnemius المشتقة من الفئران العجاف و Ob وكيف يسمح FFT بإيجاد التغييرات في توزيع إشارة الميتوكوندريا. يوضح الشكل 4A ، B عائد استثمار طولي تم اختياره في موضع مركزي وجانبي في الألياف لتحليل FFT. قبل إجراء FFT ، يتم حساب عتبة طرح الخلفية. ثم ، يتم تقسيم الصورة. تقضي هذه الإجراءات على الاختلافات في مستويات شدة التألق لإشارة الميتوكوندريا. توفر الصورة الثنائية ملف تعريف الرسم لتوزيع التألق اللازم لأداء FFT.

يوضح الشكل 4C ، D عائد الاستثمار المحدد في اللوحتين A و B مع ملفات تعريف المؤامرة الخاصة بهما (اللوحات العلوية). من ملفات تعريف الحبكة ، يمكن ملاحظة الاختلافات في توزيع التألق بين الألياف المشتقة من الفئران الخالية من الدهون و Ob ، بالإضافة إلى الاختلافات بين عائد الاستثمار داخل نفس الألياف. لكل ملف تعريف مؤامرة ، يتم تقديم طيف FFT الخاص بهم (اللوحات السفلية). تشير ذروة أقصى طيف FFT إلى تردد FFT (المحور X) لتوزيع إشارة الميتوكوندريا على طول المحور الطولي. يمكن تحويله إلى قيمة مسافة قريبة من 2 ميكرومتر في عائد الاستثمار الجانبي والمركزي من الفئران العجاف. والجدير بالذكر أن حجم FFT للذروة هو مؤشر على انتظام إشارة الميتوكوندريا ، والتغيرات في هذه السعة تكشف عن تغيرات في توزيع الميتوكوندريا.

يوضح الشكل 4E ، F الاختلافات في طيف FFT بين الألياف المشتقة من Lean و Ob حيث تم تحليل عائد الاستثمار الجانبي والمركزي ، على التوالي. في عائد الاستثمار الجانبي (الشكل 4E) كان تواتر التوزيع الطولي للميتوكوندريا مشابها في الألياف الخالية من الدهون والمشتقة من Ob. ومع ذلك ، كانت سعة أقصى ذروة FFT في الألياف المشتقة من Ob أعلى ، وهو ما يتفق مع الانتظام الأعلى للإشارة التي لوحظت في الصورة في الشكل 4B. ومع ذلك ، لوحظ عائد الاستثمار المركزي (الشكل 4F) ل Ob كمثال على الانخفاض الحرج في ذروة FFT مقارنة ب Lean عند وجود تغيير مهم في توزيع الميتوكوندريا.

Figure 1
الشكل 1: مخطط لتحليل الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. يلخص هذا المخطط الخطوات الرئيسية للبروتوكول في ثلاث مراحل منفصلة. تنقسم المرحلة الأولى ، تشريح حزم الألياف العضلية gastrocnemius ، إلى ثلاث خطوات لاحقة ، عزل عضلات gastrocnemius ، تليها تشريح ميكانيكي للعضلات إلى حزم لإجراء اختيار مرئي للحزم القابلة للحياة في النهاية. تتكون المرحلة الثانية من الحصول على تصوير الخلايا الحية بواسطة المجهر متحد البؤر ، والذي يتكون من الحضانة مع الفلوروفور (TMRE) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لوضع الألياف في الغرفة. بعد ذلك ، يتم إجراء الإعدادات المناسبة في المجهر لإجراء الحصول على الصور متحدة البؤر. خلال المرحلة الثالثة ، يتم إجراء معالجة الصور متحدة البؤر وتحليل البيانات. بدءا من معالجة الصور ، حيث يلزم وجود عتبة لتوليد صور ثنائية يتم من خلالها إجراء حسابات كثافة الميتوكوندريا وتوزيع الميتوكوندريا بواسطة FFT. الاختصارات: TMRE = رباعي ميثيل رودامين إيثيل استر؛ FFT = تحويل فورييه السريع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تشريح حزمة العضلات الهيكلية. (أ ) تشريح رأس الساق الجانبي للفئران (سهم أسود) في طبق بتري بمحلول الاسترخاء. (ب) صورة تمثيلية لحزم الألياف العضلية gastrocnemius في محلول الاسترخاء قبل تحميل TMRE. اختصار: TMRE = رباعي ميثيل رودامين إيثيل استر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل كثافة الميتوكوندريا. (A) رسم توضيحي يمثل المسافة Z الموصى بها للمسح البؤري للميتوكوندريا IMF في ألياف العضلات الهيكلية. (ب) سلسلة من الصور متحدة البؤر للميتوكوندريا المحملة ب TMRE في ألياف العضلات الهيكلية ، تم الحصول عليها من فأر Zucker +/+ (Lean) ومن فأر Zucker fa / fa البدين (Ob) المسجل في مسافة Z (من 15 إلى 21 ميكرومتر من العمق). تمت معالجة الصور عن طريق العتبة وتحويلها إلى صور ثنائية. (ج) الكثافة الميتو المحسوبة للشرائح متحدة البؤر التي تم الحصول عليها على مسافات Z مختلفة لوحظت في اللوحة B. (د) كثافة الميتو التي تم الحصول عليها من المكدس المكون من الصور التي لوحظت في اللوحة ب. الصور في اللوحة B هي 65 × 50 ميكرومتر. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: كثافة الميتو = كثافة الميتوكوندريا. IMF = الميتوكوندريا الليفية العضلية ؛ أوب = السمنة. SSM = الميتوكوندريا تحت الساركوليم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل توزيع الميتوكوندريا بواسطة FFT. صور تمثيلية متحدة البؤر للميتوكوندريا محملة بمؤشر الفلورسنت TMRE المكتسبة عند 21 ميكرومتر من عمق ألياف العضلات الهيكلية التي تم الحصول عليها من فأر Zucker +/+ المرن (Lean ، اللوحة A) ومن فأر Zucker fa / fa البدين (Ob ، اللوحة B). تمت معالجة الصور عن طريق العتبة وتحويلها إلى صور ثنائية. عائد الاستثمار الجانبي والمركزي من اللوحة A (اللوحة C) واللوحة B (اللوحة D) مع ملفات تعريف المؤامرة الخاصة بكل منهما لشدة التألق (المخطط العلوي) وطيف FFT (المخطط السفلي). تم حساب FFT من عائد الاستثمار بعرض 256 بكسل ، وهو ما يتوافق مع حجم عائد استثمار يبلغ 39 × 5 ميكرومتر في اللوحة A وحجم عائد استثمار يبلغ 50 × 5 ميكرومتر في اللوحة B. توضح اللوحة E الاختلافات في طيف FFT الموجود بين الميتوكوندريا المشتقة من الفئران العجاف و Ob في عائد الاستثمار الجانبي ، بينما توضح اللوحة F الاختلافات في طيف FFT لعائد الاستثمار المركزي. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: A.U. = وحدات تعسفية ؛ FFT = تحويل فورييه السريع ؛ عائد الاستثمار = مناطق الاهتمام ؛ أوب = السمنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكاشف التركيز النهائي في 100 مل رصيد 
ك-الأسبارتات 100 مللي متر
ككل 20 مللي متر
هيبس 20 مللي متر
L- حمض الجلوتاميك 3 مللي متر
حمض الماليك 3 مللي متر
إي جي تي ايه 0.1 مللي متر 10 مللي متر
مغ سي سي ال2 1 مللي متر مجانا ملغ2+
كلوريد متعدد الكلور2 0.00002 مللي متر مجانا Ca2+
فوسفوكرياتين دي نا 5 مللي متر 500 مللي متر
الكرياتين فسفوكيناز 5 وحدة / مل 200 وحدة / مل
مغاتب 5 مللي متر
درجة الحموضة 7.3 (مع هيدروكسيد الصوديوم)

الجدول 1: استرخاء كواشف المحلول والتركيز.

الشكل التكميلي S1: تأثير طرق المعالجة المسبقة للصور. (أ) صور تمثيلية متحدة البؤر للميتوكوندريا محملة بمؤشر الفلورسنت TMRE المكتسبة على عمق 18 ميكرومتر في ألياف العضلات الهيكلية التي تم الحصول عليها من فأر Zucker +/+ المدرب (Lean ، اللوحة العلوية) ومن فأر Zucker fa / fa البدين (اللوحة السفلية) ، جنبا إلى جنب مع الصور الخاصة بكل منها التي تم الحصول عليها بعد المعالجة المسبقة باستخدام عتبة Otsu والمرشح المتوسط وعتبة Otsu ، و 2D deconvolution وعتبة أوتسو. (B) رسم ملف تعريف كثافة الميتو التي تم الحصول عليها من الصور متحدة البؤر (اللوحة A) بعد المعالجة المسبقة بطرق مختلفة. الصور في اللوحة A هي 65 × 50 ميكرومتر. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: 2D-Decon = 2D deconvolution; الكثافة الصخرية = كثافة الميتوكوندريا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

الميتوكوندريا هي عضيات ذات قدرة عالية على إعادة البناء. يمكن تعديل محتواها وكثافتها وتوزيعها بسرعة من خلال تنشيط آليات اندماج الميتوكوندريا والانشطار ، والمعروفة باسم ديناميكيات الميتوكوندريا1 ، والتوازن بين آليات دوران الميتوكوندريا: التكوين الحيوي للميتوكوندريا ومسار تحلل الميتوكوندريا المتخصص ، الميتوفاجي21,22. يمكن أن يختلف محتوى الميتوكوندريا والتشكل وفقا لنوع الخلية ومرحلة التطور ويمكن إعادة تشكيلها تحت محفزات فسيولوجية ومرضية مختلفة17،22،23،24. لذلك ، كانت دراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا ذات صلة لأكثر من نصف قرن25. والجدير بالذكر أن تحليل الميتوكوندريا من خلال المجهر الإلكتروني كان التقنية القياسية المطبقة في دراسات متعددة26.

اكتسبت دراسات الفلورسنت بواسطة المجهر متحد البؤر أهمية في السنوات القليلة الماضية بسبب قدرتها على تصوير الخلايا الحية للميتوكوندريا في أعماق الألياف المختلفة ، والتي يمكن أن تساعد في فهم دور الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية بشكل أفضل في ظروف التكيف وعدم التكيفالمختلفة 27. في هذه الدراسة ، تم وصف منهجية لتحليل كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. أحد التحديات الرئيسية للعمل مع ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية هو تجنب الانكماش من عمليات العزل حتى تسجيل الميتوكوندريا متحد البؤر. لتحقيق هذا الهدف ، يتم استخدام محلول Mg و ATP Relaxعالي 17 للحفاظ على استرخاء الألياف لمدة 2 ساعة على الأقل ، مما يعطي وقتا كافيا لتنفيذ عملية عزل الألياف ، وحمل الفلوروفور ، واكتساب إشارة الميتوكوندريا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. النقطة الحرجة في البروتوكول هي الحصول على الألياف ميكانيكيا لأنها تتطلب دقة عالية وأنسجة جديدة. ومع ذلك ، فمن الممكن الحصول على حزم ألياف قابلة للحياة من عضلات الفئران باستخدام هذه التقنية المستخدمة سابقا والمبلغ عنها28. يسمح الحصول على ألياف سليمة بالحفاظ على الساركوليما والبيئة داخل الخلايا ، مع الحفاظ على الحديث المتبادل الأيضي والوظيفي بين هياكل الخلايا28,29.

على عكس العمل مع الأنسجة أو الخلايا الثابتة ، فإن الحصول على صور الفلورسنت لتصوير الخلايا الحية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر يسمح بالمراقبة في الوقت الفعلي لتأثير الظروف التجريبية المتنوعة. يمكن استخدام البروتوكول الحالي لاستكشاف التغيرات في كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في الوقت الفعلي واستكشاف الاختلافات بين المجموعات التجريبية ، مثل الأمثلة المعروضة هنا بين الألياف المشتقة من Lean و Ob (الشكل 3 والشكل 4). يجب دائما مراعاة أن تصوير الخلايا الحية يعني توحيد ظروف العمل المثلى مع تلف طفيف في الخلايا. يجب التحكم بدقة في وقت العمل وجودة الحلول المستخدمة ومعلمات الاستحواذ والتعرض لأشعة الليزر. ومن ثم ، فإن الاعتبارات الأساسية مذكورة أدناه.

لا يمكن تسجيل الميتوكوندريا من ألياف العضلات طوليا بالكامل بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر بسبب حجم الألياف وتلف الألياف التي يمكن أن تسببها التعرض الطويل لليزر. ومع ذلك ، يتم تسجيل عينة تمثيلية من الألياف تحت هذه التقنية. على الرغم من أنه من الممكن تسجيل سمك كامل للألياف العضلية الهيكلية للفأر عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، فإن هذا يعني وقت تسجيل أطول والتعرض لشعاع الليزر. في حالة الفئران الضابطة ، لم تتم مواجهة مشكلات في هذه التسجيلات. ومع ذلك ، قد تكون الألياف من الحالات المرضية أكثر عرضة للتلف كما لوحظ في الألياف من فئران أوب. وبالتالي ، يفضل الحصول على مجموعة من الصور البؤرية التمثيلية التي تم الحصول عليها على مسافات Z مختلفة. عندما يتم تسجيل جزء فقط من سمك الألياف ، يوصى بأخذ المكدس بنفس العمق على جميع الألياف التي تم اختبارها نظرا لأن توزيع الميتوكوندريا وكثافتها يمكن أن تختلف وفقا لموقعها داخل الألياف. يوصى بالحصول على الإشارة على عمق يزيد عن 15 ميكرومتر للحصول على صور تمثيلية متحدة البؤر لصندوق النقد الدولي ، وتجنب مجموعات SSM الموجودة بالقرب من الأطراف.

أثناء الاستحواذ البؤري ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات المهمة. أولا ، اختيار عدسة هدف الغمر مع مراعاة التكبير و NA العالي ووسط الغمر. نظرا لأنه يتم الاحتفاظ بالخلايا في وسط حضانة محبة للماء ، يجب أن يكون معامل الانكسار لوسط الحضانة والغمر مشابها للحصول على إشارة جيدة والمسح الضوئي العميق في الأنسجة. يتحقق عادة باستخدام عدسة موضوعية للغمر في الماء. تم الحصول على صور متحدة البؤر للشكل 3 والشكل 4 بهدف غمر الماء 20x ، 0.7 NA. يسمح هذا الهدف بتسجيل الألياف بكل عمقها ، ولكن تم تحديد المسح عند 15 و 18 و 21 ميكرومتر حيث يمكن الحصول على صور تمثيلية متحدة البؤر لصندوق النقد الدولي مع إشارة شدة مضان عالية وتلف طفيف في الألياف. يمكن النظر في التكبير الآخر ، مثل 40x والزيت كوسيط غمر ، ولكن يجب تقييمه.

ثانيا ، يتم حساب حجم البكسل لاكتساب التصوير وفقا لنظرية Nyquist ، والتي تسمح باختيار حجم بكسل مناسب يتجنب الإفراط في العينة (التعرض العالي لليزر) ونقص العينة (يؤدي إلى دقة أقل)30. يعتمد الحساب على خصائص العدسة الموضوعية المختارة والطول الموجي (~ 90 نانومتر). يمكن تعديله مع التكبير ؛ لذلك ، يوفر إعداد تكبير واحد فقط حجم بكسل مثالي30. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، يعتمد التكبير أيضا على مساحة العينة المراد تحليلها. وبالتالي ، فإن إيجاد التوازن يسمح بالعمل بحجم بكسل أقرب إلى معيار Nyquist ويناسب أيضا المنطقة المراد تحليلها. تم الحصول على الشكل 3 والشكل 4 بحجم بكسل 150 و 190 نانومتر ، مما سمح بتحليل العرض الكامل للألياف وهو ~ 50-80 ميكرومتر.

ثالثا ، يجب استخدام قطر ثقب مناسب يمنع الضوء خارج التركيز من الوصول إلى الكاشف. عادة ، يعتبر 1 Airy حجم الثقب الأمثل لأنه يسمح باكتشاف ~ 80٪ من الفوتونات الناشئة عن مستوى التركيز30. ومع ذلك ، فإن بعض العينات البيولوجية الملطخة التي تظهر مستويات مضان منخفضة تتطلب زيادة الثقب30. تم الحصول على صور متحدة البؤر من الشكل 3 والشكل 4 بحجم ثقب 3 Airy بسبب إشارة منخفضة تم التقاطها مع انخفاض Airy. من المهم مراعاة أن الارتفاع في شدة الإشارة الناتج عن زيادة حجم الثقب يؤدي إلى تقليل الدقة بسبب زيادة الضوء الملتقط خارج نطاق التركيز. لهذا السبب ، نوصي باستخدام حجم ثقب أقرب ما يمكن إلى 1 جيد التهوية.

عند الحصول على الصور متحدة البؤر بشكل كاف ، يمكن معالجتها للحصول على معلومات كمية عن كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها. بغض النظر ، يجب تنفيذ خطوة صورة المعالجة الحرجة للعتبات قبل التحليل لتحسين القياس الكمي للإشارة. خلال هذه الخطوة الحاسمة ، يتم تحديد قيمة شدة التألق التي تفصل وحدات البكسل الموجبة للميتوكوندريا عن تلك الموجودة في الخلفية. يمكن تحديد العتبة من خلال ملاءمة غاوسية للقمة التي تمثل الميتوكوندريا عندما يعرض الرسم البياني للصورة قمتين ، واحدة تتوافق مع الخلفية والأخرى للميتوكوندريا. ومع ذلك ، لا يتم تحقيق التوزيع ثنائي النمط دائما في كل صورة من الصور ، لذلك يجب تطبيق طرق عتبة أخرى.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف تنفيذ عتبة Otsu ، وهي طريقة غير معلمية وغير خاضعة للإشراف مصممة للعثور على قيمة العتبة عندما لا يتم فصل القمتين ، أو وجود قمم أخرى31. يمكن تطبيق Otsu بسهولة باستخدام منصة مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية. ومع ذلك ، يمكن اختبار طرق العتبة الأخرى. يجب تطبيق نفس طريقة العتبة على جميع الصور متحدة البؤر ويجب حسابها بشكل مستقل لكل صورة متحدة البؤر. يؤدي تطبيق الحد على مكدس كامل إلى نتائج غير صحيحة. بمجرد الحصول على الصور الثنائية بعد عملية العتبة ، يمكن إجراء تحليل كثافة الميتوكوندريا و FFT بسهولة باتباع التعليمات الموضحة في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند إجراء كلا التحليلين لتجنب تضمين النوى والشعيرات الدموية ، لأنها قد تؤدي إلى أخطاء في القياس الكمي. فيما يتعلق بالكثافة ، يكفي طرح وحدات البكسل ، أو المساحة التي تشغلها النوى أو الشعيرات الدموية ، من وحدات البكسل أو المساحة الكلية المراد تحليلها. بالإضافة إلى ذلك ، عند إجراء تحليل FFT ، يجب التحقق من أن إشارة الميتوكوندريا مستقيمة. على العكس من ذلك ، عندما تميل إشارة الميتوكوندريا ، يمكن أن تنتج ملفات تعريف لا تمثل التوزيع الطولي للميتوكوندريا ، مما ينتج عنه بيانات طيف FFT غير صحيحة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق خطوة المعالجة المسبقة لتقليل الضوضاء في الصور. يصف هذا البروتوكول خطوتين اختياريتين للمعالجة المسبقة باستخدام مرشح متوسط وفك التفاف 2D. يتم عرض تأثيرات طرق المعالجة المسبقة هذه على الصورة ومحتوى كثافة الميتوكوندريا في الشكل التكميلي S1. من المهم مراعاة أنه على الرغم من أن هذه العمليات المسبقة يمكن أن تحسن جودة الصورة ، إلا أنها يمكن أن تؤدي أيضا إلى فقدان بعض تفاصيل الصورة. لذلك ، يجب استخدامها بحذر وتطبيقها باستمرار على جميع الصور التي يتم تحليلها.

على الرغم من مزاياه ، فإن الفحص المجهري متحد البؤر محدود بدقة جانبية (XY) من 180-250 نانومتر عند تنفيذ الظروف المثلى للاستحواذ32. قطر الميتوكوندريا ~ 200-700 نانومتر ، بالقرب من حد الحيود للفحص المجهري متحد البؤر ؛ وبالتالي ، لا يمكن اكتشاف الهياكل الفرعية للميتوكوندريا بشكل كاف33 ولا يمكن تقييمها من خلال تحليلات الكثافة و FFT الموضحة في هذا البروتوكول. يمكن استكشاف تقنيات أخرى فائقة الدقة للفحص المجهري ، مثل الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، أو التنظير النانوي لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، أو الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية (SIM) ، لحل هياكل الميتوكوندريا الفرعية32. في هذا البروتوكول ، يتم الحصول على الصور متحدة البؤر للميتوكوندريا باستخدام الفلوروفور TMRE ، والذي يعتمد على إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لذلك ، يمكن أن تختلف شدة الفلورسنت الميتوكوندريا وفقا لإمكانات غشائها. يتم تنفيذ عملية تحديد العتبة قبل تحليل البيانات للتغلب على هذه المشكلة. تعتبر جميع وحدات البكسل فوق عتبة محددة موجبة لإشارة الميتوكوندريا بغض النظر عن قيمتها الفلورية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الميتوكوندريا ذات إمكانات الغشاء المنخفضة جدا لا يمكن حلها بهذه التقنية. وبالتالي ، يوصى بإجراء دراسات تكميلية لقياس محتوى بروتين الميتوكوندريا. ومن مزايا استخدام TMRE أنه يمكن أيضا استخدام الصور متحدة البؤر لتحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا، ولكن يلزم إجراء ضوابط كافية مع عوامل الفصل مثل كاربونيل سيانيد-p-ثلاثي فلورو روميثوكسي فينيل هيدرازون (FCCP). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق تعليمات كثافة الميتوكوندريا وتحليل التوزيع باستخدام مؤشرات الفلورسنت الخضراء للميتوكوندريا ، والتي تحمل الميتوكوندريا بغض النظر عن إمكانات الغشاء ، ولكن يجب توحيد استراتيجية الحضانة وإعدادات الاستحواذ متحد البؤر.

بالنظر إلى أن بنية الميتوكوندريا مرتبطة بوظائف الميتوكوندريا والخلوية الأساسية ، فإن البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن يوفر معلومات قيمة حول إعادة تشكيلها أثناء المرض أو عن طريق إهانة إجهاد معينة. يمكن أن يساهم في فهم أفضل للوظائف الرئيسية للعضلات الهيكلية التي تحكمها الميتوكوندريا ، مثل إنتاج الطاقة ، أو التي تلعب فيها الميتوكوندريا دورا مهما في التفاعل مع العضيات الأخرى ، مثل اقتران الانكماش والتمثيل الغذائي. يسمح اتباع تعليمات البروتوكول بتقدير كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في العضلات الهيكلية الحية. تنقسم خطوات البروتوكول إلى ثلاث مراحل رئيسية تركز على تشريح حزمة العضلات الهيكلية ، والمسح المجهري متحد البؤر ، وتحليل الصور ، حيث يتم تضمين تعليمات مفصلة واعتبارات مهمة. والجدير بالذكر أنه يمكن تحسين البروتوكول بشكل أكبر لاستكشاف خطوات Z إضافية لإعادة بناء الميتوكوندريا بالكامل داخل الألياف وفقا لاحتياجات المستخدم. على سبيل المثال ، يمكن اختبار خطوات الصورة والتحليل متحد البؤر لدراسة الهياكل الخلوية ذات التوزيع المماثل ، مثل TT في العينات الحية والثابتة.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل كلية الطب ومعهد أبحاث السمنة في Tecnologico de Monterrey. تم إنشاء الشكل 3A باستخدام برنامج الصور العلمية والتوضيح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A6419
Borosilicate glass coverslip Warner Instruments 64-0709
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670
Confocal microscope Leica TCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite  Leica 2.7.3.9723
Creatine Phosphokinase Sigma-Aldrich C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate Sigma-Aldrich 11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Forceps Miltex MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective  Leica 506517
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iris scissors Miltex 5-304
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
Maxchelator UC Davis Health https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm 
Micro scissors Miltex 18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji  Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji https://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ 
Recording chamber Warner Instruments RC-27N
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Spreadsheet Microsoft Excel Microsoft 
Stereo microscope Zeiss Stemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl ester Invitrogen T669

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
  2. De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. Skeletal muscle mitochondria in health and disease. Cell Calcium. 94, 102357 (2021).
  3. Chang, C. R., Blackstone, C. Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1. Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).
  4. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305 (2021).
  5. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role. Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).
  6. Díaz-Vegas, A. R., et al. Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism. Frontiers in Physiology. 9, 791 (2018).
  7. Boncompagni, S., et al. Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures. Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).
  8. Reggiani, C., Marcucci, L. A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers. The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167 (2022).
  9. Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).
  10. Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skeletal Muscle. 1 (1), 26 (2011).
  11. Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).
  12. Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes. Life Sciences. 264, 118700 (2021).
  13. Song, L. S., et al. Orphaned ryanodine receptors in the failing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).
  14. Houzelle, A., et al. Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity. Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).
  15. Call, J. A., et al. Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).
  16. Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging. Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).
  17. Rivera-Alvarez, I., et al. A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers. Life Sciences. 256, 117965 (2020).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).
  19. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  20. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  21. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  22. Meinild, L. A. -K., et al. Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis. Acta Physiologica. 222 (1), (2018).
  23. Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. Exercise and mitochondrial health. Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).
  24. Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases. Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).
  25. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  26. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  27. Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization. Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).
  28. Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
  29. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles. International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252 (2022).
  30. Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer, Boston, MA. (2006).
  31. Otsu, N. A. Threshold selection method from gray-level histogram. IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  32. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  33. Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. Light microscopy of mitochondria at the nanoscale. Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 202،
تحليل كثافة الميتوكوندريا والتوزيع الطولي في ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية للفئران بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pérez-Treviño, P.,… More

Pérez-Treviño, P., Nieblas, B., López-Vaquera, S. R., García, N. Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65306, doi:10.3791/65306 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter