Summary
在这里，我们提出了一种协议，通过使用共聚焦显微镜进行线粒体网络扫描，通过活骨骼肌成像来分析线粒体密度和纵向分布的变化。
Abstract
线粒体是一种细胞器，可以根据细胞的代谢要求进行拉长、碎片化和翻新。线粒体网络的重塑使健康的线粒体能够满足细胞需求;然而，这种能力的丧失与不同病理的发展或进展有关。在骨骼肌中，在运动、衰老和肥胖等生理和病理条件下观察到线粒体密度和分布变化。因此，对线粒体网络的研究可以更好地了解与这些条件相关的机制。
在这里，描述了用于大鼠活骨骼肌纤维的线粒体成像的方案。将纤维在松弛溶液中手动解剖，并与线粒体（四甲基罗丹明乙酯，TMRE）的荧光活细胞成像指示剂一起孵育。线粒体信号通过使用XYZ扫描模式的共聚焦显微镜记录，以获得肌原纤维间线粒体（IMF）网络的共聚焦图像。之后，通过阈值和二值化处理共聚焦图像。二值共聚焦图像考虑了线粒体的正像素，然后对其进行计数以获得线粒体密度。骨骼肌中的线粒体网络以高密度的IMF群体为特征，其具有类似于T小管（TT）的周期性纵向分布。快速傅里叶变换 （FFT） 是一种标准分析技术，用于评估 TT 的分布，可以找到分布频率和组织水平。在该协议中，描述了FFT算法的实现，用于分析骨骼肌中的纵向线粒体分布。
Introduction
线粒体形成高度动态的网络，主要受其伸长（融合）和碎裂（裂变）1,2 之间的平衡调节，这些平衡受线粒体蛋白 1 和 2（Mfn1 和 Mfn2）和视蛋白萎缩 1 （Opa1） 等蛋白质的表达和活性的调节，这些蛋白调节线粒体外膜和内膜的融合， 分别为 1,2。动力蛋白相关蛋白 （Drp1） 在 Ser6163 中被磷酸化时主要调节线粒体裂变。
在骨骼肌中，已经确定线粒体网络根据它们与不同细胞区域（肌原纤维、肌原纤维和细胞核）的接近程度排列在结构明确的亚群中4,5。位于肌瘤正下方的线粒体称为肌瘤下线粒体 （SSM），位于收缩丝之间的线粒体称为肌原纤维间线粒体 （IMF），细胞核周围的线粒体亚群称为核周线粒体网络 （PMN）。此外，有人认为这些线粒体亚群具有区域特异性功能，并且代谢特化 4,5。
细胞能量稳态的维持，允许代谢和收缩功能，在很大程度上取决于通过线粒体网络在特定位点上的相互作用和通信（例如，IMF 和 SSM 相互作用）4,6。除了线粒体网络相互作用外，线粒体还可以与其他细胞器相互作用，形成结构和功能复合物。在这方面，已经表明 IMF 可以位于肌浆网 （SR） 附近，并靠近由横小管 （TT）7 形成的 Ca2+ 释放单元 （CRU）。由于线粒体 Ca2+ 摄取在调节 ATP 合成和细胞凋亡中的作用，这一事实是相关的。最近，还提出了在调节胞质 Ca2+ 瞬变中的潜在作用8.
TT 是肌瘤的内陷，沿心肌细胞和骨骼肌纤维的纵轴呈周期性分布9,10，类似于 IMF 分布5。鉴于 TT 在收缩功能中的作用，TT 分布的变化具有重要的生理意义。然而，这些变化主要在心肌细胞中进行评估。使用快速傅里叶变换 （FFT） 分析可以将周期信号从距离域转换为频域，从而产生指示信号11,12,13 的频率和规律性的 FFT 频谱。尽管有证据表明骨骼肌纤维中线粒体网络的组织对于适应不同的代谢条件至关重要，因为在肌肉损伤后的再生过程中14,15，大多数分析都是定性的。
此外，鉴于线粒体功能障碍与几种骨骼肌相关（例如，废用性萎缩）2 和非肌肉疾病（尤其是代谢疾病）以及相关的肌肉质量损失（即萎缩）16 相关，因此对骨骼肌中线粒体网络和分布的定量评估具有相关性。最近，肥胖组之间腓肠肌纤维线粒体的纵向分布存在显着差异（Ob;Zucker fa/fa rats）和精益组（Lean;Zucker +/+ 大鼠）通过 FFT17 鉴定。这项研究证明了FFT在分析线粒体分布方面的有用性。因此，该协议提出了一种从荧光共聚焦显微镜获得的图像中研究活骨骼肌纤维中线粒体的方法。通过背景阈值对线粒体密度进行量化，并描述了通过FFT分析对纵向线粒体分布的分析。工作流方案如 图 1 所示。
Protocol
所有动物实验程序均由蒙特雷技术委员会动物使用和护理委员会 （CICUAL） 评估和批准（协议 2019-007）。本研究使用年龄在 12 至 13 周的雄性 Zucker（+/+ 和 fa/fa）大鼠。将动物饲养在标准饲养条件下（12小时/12小时光/暗循环，湿度40-60%），并可以随意获得食物（标准大鼠食物）和水。
1.溶液组成
- 通过混合 表1中所示的组分来制备新鲜的Relax溶液。使用氢氧化钠 （NaOH） 将 pH 值调节至 7.3。
- 使用用于确定游离金属浓度的模拟程序计算松弛溶液中的游离钙浓度。
- 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 5 mM 四甲基罗丹明甲酯 （TMRE） 储备液，随后在 DMSO 中稀释 0.1 mM。
2.腓肠肌纤维束的解剖
- 将动物放入诱导室并盖上盖子。打开氧源，将气体流速设置为0.5 L/min，将蒸发器设置为4%七氟醚以诱导麻醉。
- 一旦大鼠睡着了，将其以仰卧位放在腔室外，同时保持麻醉。捏住脚趾或尾巴以验证是否缺乏反射。
- 用剪刀切开腹部的皮肤和肌肉。然后，切开胸廓以保持进入心脏。
- 要进行心脏切除术，请用镊子从最上面的静脉和动脉抓住心脏，然后用剪刀剪断血管。取出心脏。
- 安乐死后，立即用乙醇消毒后肢，然后使用剃须机剃须。
- 握住后足，用剪刀在跟腱水平的皮肤上切开一个切口。
- 用剪刀在胫骨近端水平剪断后肢。将其转移到含有 3 mL 冰冷 Relax 溶液的 60 mm 培养皿中，处于背部位置。用足够的溶液覆盖它，以防止肌肉变干。
- 识别跟腱，用镊子小心地将其抬起，然后用虹膜剪刀将肌肉从骨头上解剖。从解剖的这一步开始使用立体显微镜。
- 识别并分离整个腓肠肌，这是后肢后部的主要块。
- 用细尖镊子解剖并丢弃肌肉周围的结缔组织和脂肪组织。将肌肉的侧头转移到装有冰冷Relax溶液的新培养皿中（见 图2A）。
- 用镊子从一端轻轻握住肌肉，然后用微型剪刀小心地将其分成一束。始终用镊子轻轻地握住束的一端来操纵束。
注意： 捆束长约 10 毫米，宽约 2 毫米。 - 将纤维束转移到装有 2 mL 冰冷 Relax 溶液的新培养皿中。只选择外观光滑、从一端到另一端完整且不缩短的（图 2B）。
3.通过共聚焦显微镜获取骨骼肌线粒体的活细胞成像
- 在室温下将纤维在 2.5 × 10-4 mM TMRE 的 Relax 溶液中孵育 20 分钟。
注意：在TMRE的推荐工作浓度下，预计它处于非淬火模式。从现在开始避免暴露在光线下。 - 在孵育期间：
- 打开共聚焦显微镜标准软件，选择配置框架，在硬件配置对话框中选择激光，勾选氦氖543选项。
- 在采集框架中，选择采集对话框，在采集模式下，选择“XYZ”面板。
- 在 XY 对话框中，选择 512 x 512 格式，400 Hz 速度，然后检查 针孔面板。在弹出的针孔对话框中，选择 “AU ”作为单位，并为针孔添加值“ 3 Airy ”。
注意：如果有足够的荧光信号守恒，请考虑减小最接近 1 Airy 最佳标准的针孔尺寸。 - 在“ 光束路径设置 ”对话框中，选择20倍的水浸物镜和0.7（20倍/0.7 IMM）的数值孔径（NA），并选择576-700 nm的发射波长窗口。选择 DD488/543 和 15% 的激光功率作为 543 激光器。
注意：强烈建议使用用于实时成像扫描的水浸物镜（如果有）。由于浸没培养基和孵育培养基的折射率相似。
- 孵育20分钟后，交换孵育培养基两次。确保在孵育后 20-30 分钟内获取共聚焦图像。
- 用 0.15 mm 硼硅酸盐玻璃盖玻片准备记录室。
注意： 考虑到厚度通常在 0.15 到 0.22 毫米之间以获得最佳性能，请根据可用的记录室选择盖玻片的厚度。 - 向记录室中加入 200 μL Relax 溶液并转移纤维束。
- 在共聚焦显微镜中，使用明场模式来识别用于线粒体荧光记录的活纤维。活纤维是完整的，没有收缩，并且具有完整的条纹图案。
- 将纤维束彼此分开并用镊子对齐。选择最接近盖玻片的那些。
- 使用 实时按钮 扫描荧光，以在控制面板控制台中调整增益和偏移，考虑以下几点：
- 为接近 0 任意单位 （A.U.） 的背景选择低荧光强度值。
- 选择介于 100 和 200 A.U 之间的增益级别以避免录音系统饱和。因此，不要记录最高的荧光水平。
- 选择 150-190 nm 的像素大小以获取光纤的全宽，并在 XY 对话框中调整缩放系数。
注意：考虑使用更接近奈奎斯特标准 （90 nm） 的像素大小，这允许扫描光纤的整个宽度。
- 在 Z 堆栈对话框中，调整 Z 距离以采集从 15 μm 光纤深度（开始按钮）到 22 μm（结束按钮）的荧光信号。选择 3 μm 作为 Z 步长。
- 单击 “开始 ”按钮以获取共聚焦图像。获得由在 15、 18 和 21 μm 深度采集的三个共聚焦图像组成的 Z 堆栈。
4. 线粒体密度分析
- 在用于生物图像分析的开源平台18中，打开Z-stack文件并旋转图像以水平放置光纤，如 图3B所示。
- 随机选择一个感兴趣的矩形区域 （ROI），其中包括线粒体 （ROImito） 占据的区域。为 X 选择 ROImito 大小范围为 65 至 90 μm。对于 Y，尺寸将取决于光纤宽度，避免其外围。
- 复制具有选定 ROImito 的 Z 堆栈，并将其保存为 TIFF 格式的新 Z 堆栈 （Mito-stack）。使用 ROI 管理器工具保存在原始堆栈上选择的 ROImito 位置。
- 按如下方式计算背景减法的阈值：
- 使用快捷 键 command+shift+t 打开“ 阈值 ”对话框。
- 选择阈值算法 Otsu |黑白 |深色背景 选项。观察图像现在已二值化。
- 在“阈值”对话框中，观察荧光强度分布的直方图和显示的 阈值 。
注意：线粒体阳性像素的荧光强度值大于阈值，并在二值图像中显示为白色像素。 - 通过选择 Apply，将阈值应用于二进制映像堆栈。在弹出的 “将堆栈转换为二进制 ”对话框中，选择“ 计算每个图像的阈值”、“黑色背景”、“创建新堆栈”选项，然后单击 “确定”。
- 观察生成了包含三个二进制映像的堆栈 （BinDMito-stack）。 将其保存为 TIFF 格式。
- 计算 BinDMito堆 栈中的线粒体密度，如下所示：
- 选择 “分析 ”菜单。接下来，单击 直方图。在弹出的直方图对话框中，单击 “是 ”，将堆栈的所有图像都包含进去分析。
- 在“ 堆栈直方 图”对话框中，单击 “列表 ”，获取直方图数据。将直方图数据传输到电子表格。
- 在电子表格中，识别值为 255 的 Mito 像素。使用公式（1）计算线粒体密度：
线粒体密度 =
× 100 （1）
总像素在“直方图”对话框中标识为 N ，或通过在电子表格中对直方图的像素计数求和来计算。 - 要计算线粒体占据的面积 （μm2），请将 BinDMito 堆栈的线粒体像素乘以像素大小。
× 100 （1）5. 快速傅里叶变换分析线粒体分布
- 在用于生物图像分析的开源平台中，打开 BinDMito 堆栈并绘制一个宽 256 像素、高 5 μm 的矩形 ROI。将一个 ROI 定位在中心位置，另一个定位在横向位置，如图 4A，B 所示。
- 使用 ROI 管理器工具配置 FFT 分析的 ROI 并保存。
注意：根据分析的需要，可以在不同的位置选择其他ROI，并且可以修改其大小。然而，宽度必须等于 2n 像素才能执行 FFT（例如，128、256、512 像素）。 - 使用快捷 命令 + k 获取 ROI 的绘图配置文件，并将数据传输到电子表格。
- 在电子表格中，使用从绘图剖面图获得的数据填充 B 列和 C 列。 B 柱包含以 μm为单位的距离， C 柱包含荧光强度（A.U.）的相应灰度值。
- D 列对应于 FFT 频率 （event/μm），其填充方式如下：
- 计算采样频率（Fs）：Fs=1/Δ d，其中Δd是距离步长（B的第二个值）。
- 计算 Δ Fs：Δ Fs= Fs/N，其中 N 是 B 的数据点数 （256）。
- 计算FFT频率（S）的停止值： S = （N/2） ×ΔFs。
- 按如下方式填写 D 列：
- D 列的第一个值等于 0。
- 选择 D 列中的第二个单元格，转到主菜单，选择填充，然后单击系列。选择列。对于步长值，使用计算出的 Δ Fs。对于止损值，请使用计算出的 S。
- 接下来，用 FFT 复数值填充 E 列，如下所示：
- 在 C 列的第一个单元格中插入 0，因为距离 0 必须与信号 0 重合才能计算 FFT。
- 然后，转到“数据”菜单，单击“数据分析”，然后选择“傅里叶分析”。
- 在新窗口中，为输入范围选择 C 列中描述的荧光信号的数据点范围。
注意： 数据点数必须为 2n （例如，荧光信号的 256 或 128 个数据点）。 - 为输出范围选择 E 的相应范围。
- 选择 “确定” ，让 FFT 复数值自动填充。
- 用FFT幅度填充 F 列，如下所示：
- 使用 IMABS 函数 从 E 中的复数返回 F 中的绝对值，然后乘以 2/N 进行归一化（等式 （2））：
FFT 幅度 = （IM.ABS （E1...E n） × （2/n） （2）
- 使用 IMABS 函数 从 E 中的复数返回 F 中的绝对值，然后乘以 2/N 进行归一化（等式 （2））：
- 使用 F 中的 FFT 幅度绘制 FFT 频谱，作为 D 中 FFT 频率的函数，直到 S. 找到最大峰值的点及其相应的 FFT 频率。
- 用公式（3）将最大峰值的FFT频率转换为距离。这个计算出的距离代表线粒体分布的纵向距离。
距离 （μm） = 1/FFT 频率 （3）
注意：由于 FFT 对称性，请勿绘制超过 S 值的 FFT 频率， 该 值对应于数据点的一半，避免 FFT 频谱重复。
6. 可选的预处理步骤，以减少图像分析前的图像噪声
- 应用中值滤波器或二维反卷积，如下所示：
- 对于中值滤波器：
- 选择 “流程”|”筛选器 ，然后单击 中位数 选项。
- 在弹出的“中位数”对话框中，选择“半径”为“2.0”，然后单击“确定”。选择 Yes （是） 将该过程应用于 Mito 堆栈中的所有映像。
- 观察图像中噪点的减少。
- 对于 2D 反卷积：
- 生成理论点扩散函数 （PSF）。
- 下载插件PSF_Generator.jar并将文件放入“Plugins”文件夹中。
- 在PSF发生器对话框中，单击“Born & Wolf 3D光学模型”选项，输入共聚焦扫描期间使用的“折射率浸入值1.33”，然后为“精度计算”选项选择“最佳”。
- 捕获 576 nm 的发射波长，使用的物镜的 NA 为 0.7，Z 步长为 3,000 nm。
- 捕获要去卷积的共聚焦图像的像素 大小XY ，以及表示X和Y像素数以及Z步数的大小 XYZ （此协议为3 ）。
- 在 PSF 生成器的“显示”菜单中，单击选项“线性”，选择“8 位分辨率”，然后选择查找表 （LUT） 的“灰色”选项。
- 运行 PSF 生成器 并保存以 TIFF 格式创建的理论 PSF。
- 对通过打开位于“图像”菜单中的“堆栈”选项的“Z 项目”工具创建的 PSF 切片求和。
- 在弹出的“投影”对话框中，选择“投影类型求和切片”，然后单击“确定”。以 TIFF 格式保存新的 PSF。
注意：可以使用通过共聚焦扫描获得的具有已知直径的荧光微珠实验获得的 PSF 代替理论上的 PSF。 - 下载插件“DeconvolutionLab_2.jar”19 并将其放入插件文件夹中。
- 单击菜单 插件。接下来，单击 DeconvolutionLab2。
- 使用工具将共聚焦图像与 Mito 堆栈分离 图像堆叠 从位于 图像 菜单中的 堆栈 选项 选项，并将其保存为 TIFF 格式。
- 在 DeconvolutionLab2 对话框中，选择从 Mito 堆栈获取的映像之一。选择创建的理论 PSF，然后选择具有 15 次迭代的算法 Richardson-Lucy。
- 运行 DeconvolutionLab2，验证图像中的信号改善和降噪，并将其保存为 TIFF 格式。
- 对于中值滤波器：
- 继续执行步骤 4.4 进行图像分析。
- 对于去卷积图像的阈值，请在阈值过程中将其转换为 8 位掩码。通过在“图像”菜单的“堆栈”工具中选择“要堆叠的图像”，使用二进制和反卷积图像创建堆栈。
- 对于去卷积图像的 FFT 分析，绘图剖面包含以像素为单位的距离。将像素单位转换为 μm ，如下所示：
- 在电子表格中，完成步骤 5.4 后，将数据从 B 传输到 A。接下来，通过将 A 的每个像素数乘以像素大小，用以 μm 为单位的距离填充 B。
Representative Results
按照本方案，线粒体的密度和分布的分析可以在活骨骼肌中实现。该协议分为三个主要阶段：骨骼肌束解剖、共聚焦显微镜扫描和图像分析。工作流概述如 图 1 所示。 图2A 显示了培养皿中的整个大鼠腓肠肌，标记了从中获得纤维的侧头，而 图2B 显示了Relax溶液中的纤维束。通过共聚焦显微镜，可以使用荧光指示剂TMRE沿着活骨骼肌纤维的深度记录线粒体。TMRE是一种亲脂性阳离子荧光团，根据线粒体膜电位20选择性地在线粒体内积累。
通过选择纤维内深度高于 15 μm 的 Z 距离，可以获得 IMF 的最佳共聚焦图像（图 3A）。 图3B 显示了沿腓肠肌纤维的Z距离（15至21μm）获得的载有TMRE的线粒体的代表性XY共聚焦图像。通过阈值处理共聚焦图像，将其转换为二进制图像，以便进行线粒体分析。图 3B （左图）显示了来自锻炼的瘦大鼠的纤维。它代表了骨骼肌纤维线粒体的预期共聚焦记录，因为它沿纤维具有一致的模式。相比之下，我们从Ob大鼠中选择了一种纤维（图3B，右图），该纤维显示出线粒体含量和分布的实质性改变。图 3C 显示了线粒体所占的纤维面积的量化，表示为线粒体密度，从每个二值化图像中获得（如图 B所示）。正如预期的那样，鄂毕纤维呈现出较低的线粒体密度。它沿着分析的Z距离一致地量化，当计算由在15、18和21μm处采集的三个共聚焦图像符合的每个堆栈的线粒体密度时，也可以在 图3D 中观察到这一点。
与线粒体密度分析类似，用于活细胞成像的荧光指示剂（如TMRE）的共聚焦扫描可以研究活骨骼肌中线粒体的纵向组织。IMF 在接近 TT7 的 I 波段中呈现周期性组织，可以通过 FFT 对其进行分析以量化线粒体信号的频率和组织水平17。 图 4 显示了在来自瘦大鼠和产科大鼠的腓肠肌中发现的 IMF 组织的差异，以及 FFT 如何发现线粒体信号分布的变化。 图 4A，B 显示了在光纤的中心和侧面位置选择的用于 FFT 分析的纵向 ROI。 在执行 FFT 之前，计算背景减法的阈值。然后，对图像进行二值化;这些程序消除了线粒体信号荧光强度水平的变化。二值图像提供了执行FFT所需的荧光分布图谱。
图 4C，D 显示了面板 A 和 B 中选定的 ROI 及其绘图剖面图（上图）。 从图谱中，可以观察到来自瘦大鼠和Ob大鼠的纤维之间荧光分布的差异，以及同一纤维内ROI之间的变化。对于每个绘图剖面图，都显示了它们各自的 FFT 频谱（下图）。最大FFT谱的峰值表示线粒体信号沿纵轴分布的FFT频率（X轴）。它可以转化为与瘦大鼠的侧向和中央ROI接近2μm的距离值。值得注意的是，峰值的FFT幅度是线粒体信号规律性的指标，该振幅的变化揭示了线粒体分布的变化。
图 4E，F 显示了分别分析横向和中心 ROI 的瘦纤维和 Ob 衍生纤维之间 FFT 光谱的差异。在横向ROI中（图4E），线粒体纵向分布的频率在瘦纤维和Ob衍生纤维中相似;尽管如此，Ob衍生光纤中最大FFT峰的幅度较高，这与图4B中图像中观察到的信号的较高规律性一致。然而，当存在线粒体分布的重要改变时，观察到 Ob 的中心 ROI（图 4F）作为与 Lean 相比 FFT 峰临界降低的一个例子。
图1：通过共聚焦显微镜分析骨骼肌线粒体的方案。 该方案将协议的主要步骤总结为三个独立的阶段。第一阶段，腓肠肌纤维束的解剖，细分为三个后续步骤，腓肠肌分离，然后是肌肉机械解剖成束，最终对可行的束进行视觉选择。第二阶段包括通过共聚焦显微镜采集活细胞成像，其中包括在室温下与荧光团 （TMRE） 孵育 20 分钟以将纤维置于腔室中。之后，在显微镜中进行适当的设置以进行共聚焦图像的采集。在第三阶段，进行共聚焦图像处理和数据分析。从图像处理开始，需要一个阈值来生成二进制图像，从中通过FFT进行线粒体密度计算和线粒体分布。缩写：TMRE=四甲基罗丹明乙酯;FFT = 快速傅里叶变换。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：骨骼肌束解剖。（A） 在培养皿中解剖大鼠外侧腓肠肌头（黑色箭头）与Relax溶液。 （B） TMRE加载前Relax溶液中腓肠肌纤维束的代表性图像。缩写：TMRE=四甲基罗丹明乙酯。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：线粒体密度分析。 （A） 表示骨骼肌纤维中 IMF 线粒体共聚焦扫描推荐的 Z 距离的图示。（B） 骨骼肌纤维中负载有 TMRE 的线粒体的一系列共聚焦图像，从锻炼的 Zucker +/+ 大鼠 （Lean） 和肥胖的 Zucker fa/fa 大鼠 （Ob） 获得，记录在 Z 距离（从 15 到 21 μm 深度）。通过阈值处理图像并转换为二进制图像。（C） 在图 B 中观察到的不同 Z 距离下获得的共聚焦切片的计算线粒体密度。（D） 从图 B中观察到的图像组成的堆栈中获得的线粒体密度。图 B 中的图像为 65 x 50 μm。比例尺 = 10 μm。 缩写：线粒体密度=线粒体密度;IMF = 肌原纤维间线粒体;Ob = 肥胖;SSM = 肌下线粒体。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：通过 FFT 分析线粒体分布。 在从锻炼的 Zucker +/+ 大鼠（Lean，面板 A）和肥胖的 Zucker fa/fa 大鼠（Ob，面板 B）获得的骨骼肌纤维深度 21 μm 处获得的装有荧光指示剂 TMRE 的线粒体的代表性共聚焦图像。通过阈值处理图像并转换为二进制图像。图 A （图 C）和图 B （图 D）的横向和中央ROI，以及荧光强度（上图）和FFT光谱（下图）的各自图谱。FFT 由宽度为 256 像素的 ROI 计算得出，对应于面板 A 中的 ROI 大小为 39 x 5 μm，面板 B 中的 ROI 大小为 50 x 5 μm。图 E 显示了来自瘦大鼠和Ob大鼠的线粒体在横向ROI中发现的FFT谱的差异，而图 F 显示了中心ROI的FFT谱的差异。比例尺 = 10 μm。 缩写：A.U. = 任意单位;FFT = 快速傅里叶变换;ROI = 感兴趣的区域;Ob = 肥胖。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂 | 终浓度（100 mL） | 股票 |
| K-天冬氨酸 | 100毫米 | |
| 氯化钾 | 20毫米 | |
| HEPES的 | 20毫米 | |
| L-谷氨酸 | 3毫米 | |
| 苹果酸 | 3毫米 | |
| EGTA公司 | 0.1毫米 | 10毫米 |
| 氯化镁2 | 1 mM 游离镁2+ | |
| 氯化钙2 | 0.00002 mM 游离 Ca2+ | |
| 磷酸肌酸二钠 | 5毫米 | 500毫米 |
| 肌酸磷酸激酶 | 5 U/毫升 | 200 U/毫升 |
| 镁ATP | 5毫米 | |
| pH 7.3（含 NaOH） |
表1：放宽溶液试剂和浓度。
补充图S1：图像预处理方法的效果。 （A） 从锻炼的 Zucker +/+ 大鼠（瘦，上图）和肥胖的 Zucker fa/fa 大鼠（下图）获得的骨骼肌纤维中，在 18 μm 深度获得的装有荧光指示剂 TMRE 的线粒体的代表性共聚焦图像，以及使用 Otsu' 阈值、中值滤波器和 Otsu' 阈值预处理后获得的各自图像， 以及 2D 反卷积和 Otsu 阈值。（B） 用不同方法预处理后从共聚焦图像（图 A）获得的线粒体密度图谱。图 A 中的图像为65 x 50μm。比例尺 = 10 μm。缩写：2D-Decon = 2D 反卷积;线粒体密度=线粒体密度。 请点击这里下载此文件。
Discussion
线粒体是具有高重塑能力的细胞器。它们的含量、密度和分布可以通过激活线粒体融合和裂变机制（称为线粒体动力学1）以及线粒体周转机制之间的平衡来快速改变：线粒体生物发生和专门的线粒体降解途径线粒体自噬21,22.线粒体含量和形态可以根据细胞类型和发育阶段而变化，并且可以在不同的生理和病理刺激下重塑17,22,23,24。因此，线粒体形态学的研究已经持续了半个多世纪25。值得注意的是，通过电子显微镜分析线粒体已成为多项研究中应用的标准技术26。
在过去几年中，共聚焦显微镜的荧光研究因其能够在不同纤维深度对线粒体进行活细胞成像而获得相关性，这有助于更好地了解线粒体在不同适应性和适应不良条件下在骨骼肌中的作用27。在这项研究中，描述了一种通过共聚焦显微镜分析活骨骼肌纤维中线粒体密度和分布的方法。使用活骨骼肌纤维的主要挑战之一是避免从分离过程到线粒体共聚焦记录的收缩。为了达到这个目的，使用高Mg和ATP松弛溶液17使纤维松弛至少2小时，这有足够的时间进行纤维分离过程，荧光团负载，并通过共聚焦显微镜获取线粒体信号。该协议的一个关键点是机械地获得纤维，因为它需要高精度和新鲜的组织;然而，使用这种先前使用和报道的技术28，可以从大鼠肌肉中获得可行的纤维束。获得完整的纤维可以保留肌瘤和细胞内环境，保持细胞结构之间的代谢和功能串扰28,29。
与使用组织或固定细胞不同，通过共聚焦显微镜获取活细胞成像荧光图像可以实时监测不同实验条件的影响。本方案可用于实时探索线粒体密度和分布的变化，并探索实验组之间的差异，例如这里介绍的瘦肉纤维和Ob衍生纤维之间的示例（图3 和 图4）。应始终考虑到，活细胞成像意味着在细胞损伤轻微的情况下标准化最佳工作条件。必须对工作时间、所用溶液的质量、采集参数和激光的曝光进行精细控制。因此，下面提到了基本考虑因素。
由于纤维的大小和长时间激光照射可能造成的纤维损伤，共聚焦显微镜无法完全纵向记录肌肉纤维的线粒体。然而，在这种技术下记录了纤维的代表性样品。虽然可以通过共聚焦显微镜记录大鼠骨骼肌纤维的整个厚度，但这意味着更长的记录时间和暴露于激光束。在对照大鼠的情况下，没有遇到这些记录的问题。然而，来自病理条件的纤维可能更容易受到损害，正如在 Ob 大鼠的纤维中观察到的那样。因此，最好获取在不同Z距离下获得的具有代表性的共聚焦图像堆栈。当只记录一段纤维厚度时，建议在所有测试的纤维上以相同的深度进行堆叠，因为线粒体分布和密度会根据其在纤维中的位置而变化。建议在15μm以上的深度采集信号，以获得IMF的代表性共聚焦图像，避免靠近外围的SSM群体。
在共聚焦采集过程中，必须考虑一些重要的因素。首先，要考虑放大倍率、高数值孔径和浸没介质，选择浸没物镜。由于细胞维持在亲水性培养基中，因此孵育和浸泡培养基的折射率必须相似，以获得良好的信号并深入组织扫描。通常使用水浸物镜实现。图 3 和 图4 的共聚焦图像是用20倍、0.7 NA的水浸物镜采集的。该物镜可以记录光纤的所有深度，但决定在15、18和21 μm下进行扫描，因为可以在高荧光强度信号和轻微光纤损伤的情况下获得具有代表性的IMF共聚焦图像。可以考虑其他放大倍率，例如 40 倍和油作为浸泡介质，但需要评估。
其次，根据奈奎斯定理计算成像采集的像素大小，该定理允许选择适当的像素大小，以避免过采样（较高的激光曝光）和欠采样（导致分辨率降低）30。计算取决于所选物镜的特性和波长（~90 nm）。可以通过缩放进行调整;因此，只有一个缩放设置可提供最佳像素大小30。然而，在实践中，缩放还取决于要分析的试样的面积。因此，找到平衡允许使用最接近奈奎斯特准则的像素大小，并且也适合要分析的区域。图 3 和 图 4 的像素尺寸为 150 和 190 nm，可以分析光纤的全宽，即 ~50-80 μm。
第三，应使用适当的针孔直径，以防止失焦光到达检测器。通常，1 Airy被认为是最佳针孔尺寸，因为它允许检测来自焦点平面30的~80%的光子。然而，一些显示低荧光水平的染色生物样品需要针孔增加30。图 3 和 图 4 的共聚焦图像是以 3 Airy 的针孔尺寸采集的，这是由于使用较低的 Airy 捕获的信号较低。重要的是要考虑到，由于针孔尺寸的增加导致信号强度的增加，由于捕获的失焦光增加而导致分辨率降低。出于这个原因，我们建议使用尽可能接近 1 通风的针孔尺寸。
当充分采集时，可以处理共聚焦图像以获得有关线粒体密度和分布的定量信息。无论如何，在分析之前需要执行关键的处理图像步骤，即阈值，以提高信号的量化。在这个关键步骤中，定义了将线粒体的阳性像素与背景的阳性像素分开的荧光强度值。当图像的直方图显示两个峰（一个对应于背景，另一个对应于线粒体）时，阈值可以通过代表线粒体的峰的高斯拟合来定义。然而，并非总是在每个图像中实现双峰分布，因此必须应用其他阈值方法。
在该协议中，描述了Otsu阈值的实现，这是一种非参数和无监督的方法，旨在在两个峰未分离或存在其他峰时找到阈值31。Otsu 可以很容易地使用开源平台进行生物图像分析;但是，可以测试其他阈值方法。必须将相同的阈值方法应用于所有共聚焦图像，并且必须为每个共聚焦图像独立计算。将阈值应用于整个堆栈会导致不正确的结果。一旦在阈值处理后获得二进制图像，就可以按照本协议中描述的说明轻松进行线粒体密度和FFT的分析。然而，在进行这两种分析时应小心，避免包括细胞核和毛细管，因为这会导致定量错误。关于密度，从要分析的像素或总面积中减去像素或原子核或毛细血管所占的面积就足够了。此外，在进行FFT分析时，必须验证线粒体信号是否是直的。相反，当线粒体信号倾斜时，它会产生不代表线粒体纵向分布的曲线，从而产生不正确的FFT谱数据。此外，还可以应用预处理步骤来减少图像中的噪声。该协议描述了使用中值滤波器和 2D 反卷积的两个可选预处理步骤。这些预处理方法对图像和线粒体密度含量的影响如 补充图S1所示。重要的是要考虑到，虽然这些预处理可以提高图像质量，但它们也可能导致某些图像细节的丢失。因此，应谨慎使用它们，并始终如一地应用于所有正在分析的图像。
尽管有其优点，但当实现最佳采集条件时，共聚焦显微镜仍受到 180-250 nm 的横向分辨率 （XY） 的限制32。线粒体直径为~200-700 nm，接近共聚焦显微镜的衍射极限;因此，亚线粒体结构不能被充分检测33 ，并且不能通过该协议中所示的密度和FFT分析来评估。可以探索其他超分辨率显微镜技术，例如随机光学重建显微镜 （STORM）、受激发射耗竭 （STED） 纳米镜或结构照明显微镜 （SIM），以解析亚线粒体结构32。在该协议中，使用荧光团TMRE获得线粒体的共聚焦图像，这取决于线粒体膜电位。因此，线粒体荧光强度可以根据其膜电位而变化。在数据分析之前执行阈值过程以克服此问题。所有高于定义阈值的像素都被认为是线粒体信号的阳性，与它们的荧光值无关。然而，必须注意的是，这种技术无法解决膜电位非常低的线粒体。因此，建议对线粒体蛋白质含量定量进行补充研究。使用TMRE的一个优点是共聚焦图像也可用于线粒体膜电位分析，但需要使用解偶联剂（如羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙（FCCP））进行充分的对照。此外，线粒体密度和分布分析的指令可以使用线粒体的绿色荧光指示剂来实现，线粒体的绿色荧光指示剂无论其膜电位如何都会加载线粒体，但孵育策略和共聚焦采集设置需要标准化。
鉴于线粒体结构与基本的线粒体和细胞功能有关，此处描述的方案可以提供有关它们在疾病期间或特定应激损伤期间重塑的宝贵信息。它可能有助于更好地理解由线粒体控制的骨骼肌的关键功能，例如能量产生，或者线粒体在与其他细胞器相互作用中起重要作用，例如收缩代谢偶联。遵循协议说明可以估计活骨骼肌中的线粒体密度和分布。方案步骤分为三个主要阶段，分别是骨骼肌束解剖、共聚焦显微镜扫描和图像分析，其中包括详细说明和重要注意事项。值得注意的是，该协议可以进一步优化，以根据用户的需要探索额外的Z步骤，以便在纤维内进行完整的线粒体重建。例如，可以测试共聚焦图像和分析步骤，以研究具有相似分布的细胞结构，例如活体和固定样品中的TT。
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了医学院和蒙特雷技术研究所肥胖研究所的支持。 图3A 使用Scientific Image and Illustration软件创作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
| Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
| Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Forceps | Miltex | MH-18 | |
| HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
| Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
| Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |
References
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