Summary
여기에서는 미토콘드리아 네트워크 스캐닝을 위한 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 골격근 이미징에 의한 미토콘드리아 밀도 및 종단 분포의 변화를 분석하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
미토콘드리아는 세포의 대사 요구 사항에 따라 길어지고, 조각나고, 개조될 수 있는 세포 기관입니다. 미토콘드리아 네트워크의 리모델링은 건강한 미토콘드리아가 세포 요구를 충족시킬 수 있도록 합니다. 그러나 이 능력의 상실은 다른 병리학의 발달 또는 진행과 관련이 있습니다. 골격근에서 미토콘드리아 밀도와 분포 변화는 운동, 노화, 비만과 같은 생리학적, 병리학적 조건에서 관찰됩니다. 따라서 미토콘드리아 네트워크에 대한 연구는 이러한 조건과 관련된 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록 합니다.
여기에서는 쥐의 살아있는 골격근 섬유의 미토콘드리아 이미징을 위한 프로토콜이 설명됩니다. 섬유를 이완 용액에서 수동으로 절개하고 미토콘드리아의 형광 살아있는 세포 이미징 표시기(테트라메틸로다민 에틸 에스테르, TMRE)로 배양합니다. 미토콘드리아 신호는 근섬유간 미토콘드리아(IMF) 네트워크의 공초점 이미지를 얻기 위해 XYZ 스캔 모드를 사용하여 컨포칼 현미경으로 기록됩니다. 그 후, 컨포칼 이미지는 임계값 설정 및 이진화에 의해 처리됩니다. 이진화된 컨포칼 이미지는 미토콘드리아의 양의 픽셀을 설명하며, 이 픽셀은 미토콘드리아 밀도를 얻기 위해 계산됩니다. 골격근의 미토콘드리아 네트워크는 T-세뇨관(TT)과 유사한 주기적 종방향 분포를 갖는 IMF 집단의 밀도가 높은 것이 특징입니다. 고속 푸리에 변환(FFT)은 TT의 분포를 평가하기 위해 수행되는 표준 분석 기술로, 분포 빈도와 조직 수준을 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 골격근의 종방향 미토콘드리아 분포 분석을 위해 FFT 알고리즘의 구현이 설명됩니다.
Introduction
미토콘드리아는 주로 신장(융합)과 단편화(분열) 사이의 균형에 의해 조절되는 매우 역동적인 네트워크를 형성합니다.1,2 미토푸신 1 및 2(Mfn1 및 Mfn2)와 같은 단백질의 발현과 활성에 의해 조절되고, 외부 미토콘드리아 막과 내막의 융합을 조절하는 시신경 단백질 위축1(Opa1)이 있습니다. 각각 1,2. 다이나민 관련 단백질(Drp1)은 Ser6163에서 인산화될 때 미토콘드리아 핵분열을 주로 조절합니다.
골격근에서 미토콘드리아 네트워크는 서로 다른 세포 영역(근섬유, 근종 및 핵)에 대한 근접성을 기반으로 구조적으로 잘 정의된 하위 집단으로 배열된다는 것이 잘 확립되어 있습니다.4,5. 유골 바로 아래에 위치한 미토콘드리아는 근근하 미토콘드리아(SSM)라고 하고, 수축 필라멘트 사이에 위치한 미토콘드리아는 근간미토콘드리아(IMF)라고 하며, 핵 주위의 미토콘드리아 하위집단을 핵주위 미토콘드리아 네트워크(PMN)라고 합니다. 더욱이, 이러한 미토콘드리아 하위 집단은 지역 특이적 기능을 가지고 있으며 대사적으로 특화되어 있는 것으로 제안되었습니다 4,5.
신진대사 및 수축 기능을 가능하게 하는 세포 에너지 항상성의 유지는 미토콘드리아 네트워크를 통한 특정 부위의 상호 작용 및 통신(예: IMF 및 SSM 상호 작용)에 크게 의존합니다.4,6. 미토콘드리아 네트워크 상호 작용 외에도 미토콘드리아는 다른 세포 기관과 상호 작용하여 구조적 및 기능적 복합체를 형성할 수 있습니다. 이와 관련하여, IMF는 근질 망상체(SR)에 인접해 있고 횡세관(TT)7에 의해 형성된 Ca2+ 방출 단위(CRU)에 근접할 수 있음이 밝혀졌다. 이 사실은 ATP 합성 및 세포 사멸을 조절하는 미토콘드리아 Ca2+ 흡수의 역할과 관련이 있습니다. 최근에, 세포질 Ca2+ 과도 현상을 조절하는 잠재적인 역할도 제안되었다8.
TT는 심근세포와 골격근섬유의 세로축을 따라 주기적으로 분포하는 유육종의 침범이다9,10, IMF 분포5와 유사하다. TT 분포의 변화는 수축 기능에서의 역할을 감안할 때 중요한 생리학적 의미를 갖습니다. 그러나 이러한 변화는 주로 심근세포에서 평가되었습니다. 고속 푸리에 변환(Fast Fourier Transform, FFT) 분석을 사용하면 거리 도메인에서 주파수 도메인으로 주기적 신호를 변환할 수 있으며, 그 결과 신호11,12,13의 주파수 및 규칙성을 나타내는 FFT 스펙트럼이 생성된다. 골격근 섬유의 미토콘드리아 네트워크 조직이 근육 손상 후 재생 중과 같이 다양한 대사 조건에 적응하는 데 필수적이라는 증거가 있지만(14,15), 대부분의 분석은 정성적으로 수행됩니다.
또한, 미토콘드리아 기능 장애가 여러 골격근 관련(예: 불사용 위축)2 및 비근육 질환, 특히 대사 질환 및 관련 근육량 손실(즉, 위축)16과 관련이 있다는 점을 감안할 때, 골격근의 미토콘드리아 네트워크 및 분포에 대한 정량적 평가가 관련성이 있습니다. 최근에는 비만군(Ob; Zucker fa /fa rats) 및 린 그룹(Lean; Zucker +/+ rats)는 FFT17을 통해 확인되었습니다. 이 연구는 미토콘드리아 분포를 분석하는 데 FFT의 유용성을 입증했습니다. 따라서 이 프로토콜은 형광 컨포칼 현미경으로 얻은 이미지에서 살아있는 골격근 섬유의 미토콘드리아를 연구하는 방법론을 제시합니다. 미토콘드리아 밀도는 배경 임계값에 의해 정량화되며, FFT 분석에 의한 종적 미토콘드리아 분포 분석도 설명됩니다. 워크플로 체계는 그림 1에 나와 있습니다.
Protocol
모든 동물 실험 절차는 Tecnologico de Monterrey의 동물 사용 및 관리 위원회(CICUAL)의 평가 및 승인되었습니다(프로토콜 2019-007). 이 연구에는 12주에서 13주 사이의 수컷 Zucker(+/+ 및 fa/fa) 쥐가 사용되었습니다. 동물은 표준 사육 조건(12시간/12시간 밝음/어두움 주기, 40-60% 습도)에서 사육되었으며 음식(표준 쥐 차우)과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다.
1. 용액 구성
- 표 1에 표시된 성분을 혼합하여 신선한 Relax 용액을 준비합니다. 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 7.3으로 조정합니다.
- 자유 금속 농도를 결정하기 위한 시뮬레이션 프로그램을 사용하여 Relax 용액의 유리 칼슘 농도를 계산합니다.
- 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 5mM 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRE) 스톡을 준비하고, DMSO에 0.1mM을 희석합니다.
2. 비복근 섬유 다발의 해부
- 동물을 유도 챔버 안에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 산소 공급원을 켜고 가스 유량을 0.5L/min으로 설정하고 기화기를 4% 세보플루란으로 설정하여 마취를 유도합니다.
- 쥐가 잠들면 마취를 유지하면서 앙와위 자세로 챔버 밖에 놓습니다. 발가락이나 꼬리를 꼬집어 반사 신경이 없는지 확인합니다.
- 가위로 복부의 피부와 근육을 자릅니다. 그런 다음 흉곽을 잘라 심장에 접근합니다.
- 심장 절제술을 할 때는 집게로 맨 위의 정맥과 동맥에서 심장을 잡고 가위로 혈관을 자릅니다. 심장을 제거하십시오.
- 안락사 직후에는 뒷다리를 에탄올로 소독하고 면도기를 사용하여 면도합니다.
- 뒷발을 잡고 가위로 아킬레스건 높이의 피부를 절개합니다.
- 근위 경골 수준에서 가위로 뒷다리를 자릅니다. 3mL의 얼음처럼 차가운 릴렉스 용액이 들어 있는 60mm 페트리 접시에 등쪽 자세로 옮깁니다. 근육이 건조해지는 것을 방지하기 위해 충분한 용액으로 덮으십시오.
- 아킬레스건을 확인하고 집게로 조심스럽게 들어 올린 다음 홍채 가위로 뼈에서 멀리 떨어진 근육을 해부합니다. 이 단계부터 해부 단계부터 실체현미경을 사용하십시오.
- 뒷다리 뒤쪽의 주요 덩어리인 전체 비복근을 식별하고 분리합니다.
- 끝이 가는 집게로 근육을 둘러싼 결합 조직과 지방 조직을 절개하고 버립니다. 근육의 측면 머리를 얼음처럼 차가운 Relax 용액이 있는 새 페트리 접시로 옮깁니다( 그림 2A 참조).
- 한쪽 끝에서 집게로 근육을 부드럽게 잡고 마이크로 가위로 조심스럽게 묶음으로 분리합니다. 항상 집게로 한쪽 끝을 부드럽게 잡아 묶음을 조작하십시오.
알림: 번들의 길이는 약 10mm, 너비는 2mm입니다. - 섬유 다발을 얼음처럼 차가운 Relax 용액 2mL와 함께 새 페트리 접시에 옮깁니다. 모양이 매끄럽고 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 완전하며 짧아지지 않은 것만 선택하십시오(그림 2B).
3. 공초점 현미경을 통한 골격근의 미토콘드리아의 살아있는 세포 이미징 획득
- 섬유를 2.5 × 10-4 mM TMRE의 Relax 용액에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
알림: TMRE의 권장 작동 농도에서는 비담금질 모드에 있을 것으로 예상됩니다. 이 시점부터 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. - 배양 기간 동안:
- 컨포칼 현미경 표준 소프트웨어를 열고 구성 프레임워크를 선택한 다음 하드웨어 구성 대화 상자에서 레이저를 선택하고 HeNe 543 옵션을 선택합니다.
- 획득 프레임워크에서 획득 대화 상자를 선택하고 획득 모드에서 XYZ 패널을 선택합니다.
- XY 대화상자에서 512 x 512 형식, 400Hz 속도를 선택하고 핀홀 패널을 선택합니다. 표시된 핀홀 대화상자에서 단위로 AU를 선택하고 핀홀로 값 3 Airy를 추가합니다.
알림: 적절한 형광 신호가 보존되는 경우 1 Airy 최적 기준에 가장 가까운 핀홀 크기를 줄이는 것이 좋습니다. - 빔 경로 설정 대화 상자에서 20x의 침수 대물렌즈와 0.7(20x/0.7 IMM)의 개구수를 선택하고 576-700nm의 방출 파장 창을 선택합니다. DD488/543을 선택하고 543 레이저의 경우 레이저 출력의 15%를 선택합니다.
알림: 실시간 이미징 스캔을 위한 수침 대물 렌즈를 사용하는 것이 좋습니다(가능한 경우). 침지 매체와 배양 매체의 유사한 굴절률이 달성되기 때문입니다.
- 배양 20분 후 배양 배지를 두 번 교환합니다. 배양 후 20-30분 이내에 컨포칼 이미지를 획득해야 합니다.
- 붕규산 유리의 0.15mm 커버슬립으로 기록 챔버를 준비합니다.
참고: 최적의 성능을 위해 두께가 일반적으로 0.15mm에서 0.22mm 사이임을 고려하여 사용 가능한 기록 챔버에 따라 커버슬립의 두께를 선택하십시오. - 200μL의 Relax 용액을 기록 챔버에 추가하고 섬유 다발을 옮깁니다.
- 컨포칼 현미경에서 명시야 모드를 사용하여 미토콘드리아의 형광 기록에 사용할 수 있는 섬유를 식별합니다. 생존 가능한 섬유는 완전하고 수축되지 않으며 온전한 줄무늬 패턴을 가지고 있습니다.
- 섬유 다발을 서로 분리하고 집게로 정렬합니다. 커버슬립에 가장 가까운 것을 선택하십시오.
- 라이브 버튼을 사용하여 형광을 스캔하여 제어판 콘솔에서 게인과 오프셋을 조정하고 다음 사항을 고려합니다.
- 거의 0 A.U.(임의 단위)에 가까운 배경에 대해 낮은 형광 강도 값을 선택합니다.
- 100에서 200 AU 사이의 게인 레벨을 선택합니다.녹음 시스템의 포화를 피하기 위해. 따라서 가장 높은 형광 수준을 기록하지 마십시오.
- 150-190nm의 픽셀 크기를 선택하여 광섬유의 전체 너비를 얻고 XY 대화 상자에서 확대/축소 비율을 조정합니다.
참고: 광섬유의 전체 너비를 스캔할 수 있는 나이퀴스트 기준(90nm)에 더 가까운 픽셀 크기를 사용하는 것이 좋습니다.
- Z 스택 대화 상자에서 Z 거리를 조정하여 15μm(시작 버튼)에서 시작하여 최대 22μm(종료 버튼)의 광섬유 깊이에서 형광 신호를 수집합니다. Z-스텝 크기로 3μm를 선택합니다.
- 시작 버튼을 클릭하여 컨포칼 이미지를 획득합니다. 15, 18 및 21μm 깊이에서 획득한 3개의 컨포칼 이미지로 구성된 Z 스택을 얻습니다.
4. 미토콘드리아 밀도 분석
- 생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 플랫폼(18)에서 Z-스택 파일을 열고 이미지를 회전하여 그림 3B와 같이 광섬유를 수평으로 배치합니다.
- 미토콘드리아가 차지하는 영역(ROI mito)을 포함하는 직사각형 관심 영역(ROI)을 랜덤하게 선택합니다. X의 경우 65 - 90 μm 범위의 ROImito 크기를 선택할 수 있습니다. Y의 경우 크기는 주변부를 피하면서 섬유 너비에 따라 달라집니다.
- 선택한 ROImito 를 사용하여 Z-스택을 복제하고 TIFF 형식의 새 Z-스택(Mito 스택)으로 저장합니다. ROI 매니저 툴을 사용하여 원래 스택에서 선택한 ROImito 위치를 저장합니다.
- 배경 빼기에 대한 임계값을 다음과 같이 계산합니다.
- 단축키 command+shift+t를 사용하여 임계값 대화 상자를 엽니다.
- 임계값 알고리즘 선택 Otsu |흑백 | 어두운 배경 옵션. 이제 이미지가 이진화된 것을 관찰합니다.
- Threshold(임계값) 대화 상자에서 형광 강도 분포의 히스토그램과 표시되는 임계값 을 관찰합니다.
참고: 미토콘드리아 양성 픽셀은 형광 강도 값이 임계값보다 크며 이진 이미지에서 흰색 픽셀로 나타납니다. - Apply(적용)를 선택하여 이진 이미지 스택에 임계값을 적용합니다. 표시된 스택을 이진으로 변환 대화 상자에서 각 이미지에 대한 임계값 계산, 검은색 배경, 새 스택 생성 옵션을 선택하고 확인을 클릭합니다.
- 세 개의 이진 이미지가 있는 스택이 생성되는지 확인합니다(BinDMito-stack). TIFF 형식으로 저장합니다.
- BinDMito-stack에서 미토콘드리아 밀도를 다음과 같이 계산합니다.
- 분석 메뉴를 선택합니다. 그런 다음 히스토그램을 클릭합니다. 표시된 히스토그램 대화 상자에서 예를 클릭하여 분석을 위해 스택의 모든 이미지를 포함합니다.
- 스택의 히스토그램 대화 상자에서 목록을 클릭하여 히스토그램 데이터를 가져옵니다. 히스토그램 데이터를 스프레드시트로 전송합니다.
- 스프레드시트에서 값이 255인 Mito 픽셀을 식별합니다. 방정식 (1)을 사용하여 미토콘드리아 밀도를 계산합니다.
미토콘드리아 밀도 =
× 100 (1)
총 픽셀은 히스토그램 대화 상자에서 N 으로 식별되거나 스프레드시트에서 히스토그램의 픽셀 수를 합산하여 계산됩니다. - 미토콘드리아가 차지하는 면적(μm2)을 계산하려면 BinDMito-stack의 Mito 픽셀에 픽셀 크기를 곱합니다.
× 100 (1)5. Fast Fourier Transform에 의한 미토콘드리아 분포 분석
- 생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 플랫폼에서 BinDMito-stack을 열고 너비 256픽셀, 높이 5μm의 직사각형 ROI를 그립니다. 그림 4A,B와 같이 ROI를 중앙 위치에 배치하고 측면 위치에 ROI를 찾습니다.
- ROI Manager 툴을 사용하여 FFT 분석을 위한 ROI를 구성하고 저장합니다.
참고: 분석의 필요성에 따라 다른 위치에서 다른 ROI를 선택할 수 있으며 크기를 수정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, FFT를 수행하기 위해서는 폭이2n 픽셀과 같아야 한다(예를 들어, 128, 256, 512 픽셀). - 바로 가기 명령 + k 를 사용하여 ROI의 플롯 프로파일을 구하고 데이터를 스프레드시트로 전송합니다.
- 스프레드시트에서 B 및 C 열을 플롯 프로파일에서 얻은 데이터로 채웁니다. B 열에는 μm 단위의 거리가 포함되고 C 열에는 형광 강도(A.U.)의 해당 회색 값이 포함됩니다.
- D 열은 FFT 주파수(이벤트/μm)에 해당하며 다음과 같이 채워집니다.
- 샘플링 주파수(Fs) 계산: Fs = 1/Δ d, 여기서 Δd는 거리 단계(B의 두 번째 값)입니다.
- ΔFs = Fs/N을 계산합니다. 여기서 N은 B(256)의 데이터 포인트 수입니다.
- FFT 주파수(S)의 정지 값 계산: S = (N/2) ×ΔFs.
- 다음과 같이 D 열을 채웁니다.
- D 열의 첫 번째 값은 0입니다.
- D 열에서 두 번째 셀을 선택하고 홈 메뉴로 이동하여 채우기를 선택하고 계열을 클릭합니다. 열을 선택합니다. 단계 값의 경우 계산된 Δ Fs를 사용합니다. 중지 값의 경우 계산된 S를 사용합니다.
- 그런 다음 다음과 같이 E 열을 FFT 복소수 값으로 채웁니다.
- FFT 계산을 위해 거리 0이 신호 0과 일치해야 하므로 C 열의 첫 번째 셀에 0을 삽입합니다.
- 그런 다음 데이터 메뉴로 이동하여 데이터 분석을 클릭하고 푸리에 분석을 선택합니다.
- 새 창에서 입력 범위에 대해 C 열에 설명된 형광 신호의 데이터 점 범위를 선택합니다.
참고: 데이터 포인트의 수는2n (예: 형광 신호의 256개 또는 128개 데이터 포인트)이어야 합니다. - 출력 범위에 해당하는 E 범위를 선택합니다.
- 확인을 선택하고 FFT 복소수 값이 자동으로 채워지도록 합니다.
- 다음과 같이 F 열을 FFT 크기로 채웁니다.
- IMABS 함수를 사용하여 E의 복소수에서 F의 절대값을 반환하고 2/N을 곱하여 정규화합니다(방정식 (2)).
FFT 크기 = (IM.ABS(E1... En) × (2/N) (2)
- IMABS 함수를 사용하여 E의 복소수에서 F의 절대값을 반환하고 2/N을 곱하여 정규화합니다(방정식 (2)).
- F의 FFT 크기를 D의 FFT 주파수에 대한 함수로 사용하여 S까지 FFT 스펙트럼을 플로팅합니다. 최대 피크의 점과 이에 대응하는 FFT 주파수를 구합니다.
- 최대 피크의 FFT 주파수를 수학식 3과 같이 거리로 변환합니다. 이 계산된 거리는 미토콘드리아 분포의 종방향 거리를 나타냅니다.
거리(μm) = 1/FFT 주파수(3)
참고: FFT 대칭으로 인해 FFT 스펙트럼의 중복을 피하고 데이터 포인트의 절반에 해당하는 S 값을 초과하여 FFT 주파수를 플로팅하지 마십시오.
6. 이미지 분석 전에 이미지 노이즈를 줄이기 위한 선택적 전처리 단계
- 다음과 같이 중앙값 필터 또는 2D 디콘볼루션을 적용합니다.
- 중앙값 필터의 경우:
- 프로세스 | 필터를 클릭하고 중앙값 옵션을 클릭합니다.
- 표시된 중앙값(Median) 대화상자에서 반지름(Radius)으로 2.0을 선택하고 확인(OK)을 클릭합니다. [Yes]를 선택하여 Mito 스택의 모든 이미지에 프로세스를 적용합니다.
- 이미지의 노이즈 감소를 관찰합니다.
- 2D 디콘볼루션의 경우:
- 이론적인 점 확산 함수(PSF)를 생성합니다.
- 플러그인 PSF_Generator.jar 다운로드하고 파일을 "Plugins" 폴더에 넣습니다.
- PSF 생성기 대화 상자에서 Born & Wolf 3D 광학 모델 옵션을 클릭하고, 컨포칼 스캐닝 중에 사용된 굴절률 침지 값 1.33을 입력하고, 정확도 계산 옵션에 대해 최상을 선택합니다.
- 방출 파장의 경우 576nm, 사용된 대물 렌즈의 NA는 0.7, Z-step은 3,000nm로 캡처합니다.
- 디콘볼루션할 컨포칼 이미지의 픽셀 크기 XY와 X와 Y의 픽셀 수와 Z 단계 수(이 프로토콜의 경우 3)를 나타내는 크기 XYZ를 캡처합니다.
- PSF Generator의 Display 메뉴에서 linear 옵션을 클릭하고 8비트 해상도를 선택한 다음 룩업 테이블(LUT)에 대해 grays 옵션을 선택합니다.
- PSF 생성기를 실행하고 이론적으로 생성된 PSF를 TIFF 형식으로 저장합니다.
- 이미지 메뉴에 있는 스택 옵션의 Z 프로젝트 도구를 열어 만든 PSF 슬라이스의 합을 만듭니다.
- 표시된 ZProjection 대화 상자에서 투영 유형으로 슬라이스 합계를 선택하고 확인을 클릭합니다. 새 PSF를 TIFF 형식으로 저장합니다.
참고: 공초점 스캐닝 형광 마이크로비즈를 통해 실험적으로 얻은 PSF를 이론적인 PSF 대신 사용할 수 있습니다. - 플러그인 "DeconvolutionLab_2.jar"19 를 다운로드하여 플러그인 폴더에 넣습니다.
- Plugins 메뉴를 클릭합니다. 그런 다음 DeconvolutionLab2를 클릭합니다.
- 이미지 메뉴에 있는 스택 옵션에서 쌓을 이미지 도구를 사용하여 Mito 스택에서 공초점 이미지를 분리하고 TIFF 형식으로 저장합니다.
- DeconvolutionLab2 대화 상자에서 Mito 스택에서 가져온 영상 중 하나를 선택합니다. 생성된 이론적 PSF를 선택하고 15회 반복을 갖는 알고리즘 Richardson-Lucy를 선택합니다.
- DeconvolutionLab2를 실행하고, 영상의 신호 개선과 잡음 감소를 확인한 다음, TIFF 형식으로 저장합니다.
- 중앙값 필터의 경우:
- 이미지 분석을 위해 4.4단계를 계속합니다.
- 디콘볼루션된 영상의 이진화를 위해, 이진화 과정 중에 영상을 8비트 마스크로 변환하십시오. [이미지] 메뉴의 [스택] 도구에서 [스택할 이미지]를 선택하여 바이너리 영상과 디콘볼루션된 영상이 포함된 스택을 만듭니다.
- 디콘볼루션된 영상의 FFT 분석의 경우, 플롯 프로파일에는 픽셀 단위의 거리가 포함됩니다. 다음과 같이 픽셀 단위를 μm 로 변환합니다.
- 스프레드시트에서 5.4단계를 완료한 후 B에서 A로 데이터를 전송합니다. 다음으로, A의 각 픽셀 수에 픽셀 크기를 곱하여 B를 μm 단위의 거리로 채웁니다.
Representative Results
본 프로토콜에 따라 미토콘드리아의 밀도 및 분포 분석은 살아있는 골격근에서 달성될 수 있습니다. 프로토콜은 골격근 다발 절제, 컨포칼 현미경 스캐닝 및 이미지 분석의 세 가지 주요 단계로 나뉩니다. 워크플로 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 그림 2A 는 페트리 접시에 있는 전체 쥐의 비복근을 보여주며, 섬유질이 얻어지는 측면 머리를 표시하고, 그림 2B 는 Relax 용액의 섬유 다발을 보여줍니다. 공초점 현미경을 통해 형광 표시기 TMRE를 사용하여 살아있는 골격근 섬유의 깊이를 따라 미토콘드리아를 기록할 수 있습니다. TMRE는 미토콘드리아 막 전위(20)에 따라 미토콘드리아 내에 선택적으로 축적되는 친유성 양이온성 형광단입니다.
IMF의 최적 공초점 이미지는 광섬유 내에서 깊이 15μm 이상의 Z 거리를 선택하여 얻을 수 있습니다(그림 3A). 그림 3B 는 비복근 섬유의 Z 거리(15-21μm)를 따라 획득한 TMRE가 로드된 미토콘드리아의 대표적인 XY 컨포칼 이미지를 보여줍니다. 컨포칼 이미지는 미토콘드리아 분석이 가능하도록 바이너리 이미지로 변환하기 위해 임계값을 설정하여 처리되었습니다. 그림 3B (왼쪽 패널)는 운동한 마른 쥐의 섬유질을 보여줍니다. 골격근 섬유 미토콘드리아가 섬유를 따라 일관된 패턴을 가지고 있기 때문에 예상되는 공초점 기록을 나타냅니다. 대조적으로, 우리는 미토콘드리아 함량과 분포에 상당한 변화를 보이는 Ob 쥐(그림 3B, 오른쪽 패널)의 섬유를 선택했습니다. 그림 3C 는 미토콘드리아 밀도로 표현된 미토콘드리아가 차지하는 섬유 면적의 정량화를 보여주며, 각 이진화된 이미지(패널 B 참조)에서 얻습니다. 예상했던 대로, Ob 섬유는 더 낮은 미토콘드리아 밀도를 나타냈습니다. 분석된 Z 거리를 따라 일관되게 정량화되었으며, 이는 15, 18 및 21μm에서 획득한 3개의 컨포칼 이미지에 의해 일치된 스택당 미토콘드리아 밀도를 계산할 때도 그림 3D 에서 관찰됩니다.
미토콘드리아 밀도 분석과 유사하게, TMRE와 같은 살아있는 세포 이미징을 위한 형광 지표의 컨포칼 스캐닝을 통해 살아있는 골격근에서 미토콘드리아의 종방향 조직을 연구할 수 있습니다. IMF는 미토콘드리아 신호의 주파수와 조직 17의 수준을 정량화하기 위해 FFT로 분석할 수 있는TT7에 가까운 I-대역의 주기적 조직을 제시한다. 그림 4는 Lean 및 Ob 쥐에서 파생된 비복근에서 발견되는 IMF 조직의 차이와 FFT를 통해 미토콘드리아 신호 분포의 변화를 찾는 방법을 보여줍니다. 그림 4A,B는 FFT 분석을 위해 광섬유의 중앙 및 측면 위치에서 선택된 종방향 ROI를 보여줍니다. FFT를 수행하기 전에 배경 빼기에 대한 임계값이 계산됩니다. 그런 다음 이미지가 이진화됩니다. 이러한 절차는 미토콘드리아 신호의 형광 강도 수준의 변화를 제거합니다. 이진 영상은 FFT를 수행하는 데 필요한 형광 분포의 플롯 프로파일을 제공합니다.
그림 4C,D는 패널 A와 B에서 선택한 ROI를 플롯 프로파일(상단 패널)과 함께 보여줍니다. 플롯 프로파일에서 Lean 및 Ob 쥐에서 파생된 섬유 간의 형광 분포 차이와 동일한 섬유 내의 ROI 간 차이를 관찰할 수 있습니다. 모든 플롯 프로파일에 대해 각각의 FFT 스펙트럼이 표시됩니다(하단 패널). 최대 FFT 스펙트럼의 피크는 세로 축을 따른 미토콘드리아 신호 분포의 FFT 주파수(X축)를 나타냅니다. Lean rat의 측면 및 중앙 ROI에서 2μm에 가까운 거리 값으로 변환할 수 있습니다. 특히, 피크의 FFT 크기는 미토콘드리아 신호의 규칙성을 나타내는 지표이며, 이 진폭의 변화는 미토콘드리아 분포의 변화를 나타냅니다.
그림 4E,F는 측면 및 중앙 ROI를 각각 분석한 Lean 및 Ob 파생 섬유 간의 FFT 스펙트럼 차이를 보여줍니다. 측면 ROI(그림 4E)에서 미토콘드리아 종방향 분포의 빈도는 희박 섬유와 Ob 유래 섬유에서 유사했습니다. 그럼에도 불구하고 Ob 유래 섬유에서 최대 FFT 피크의 진폭은 더 높았으며, 이는 그림 4B의 이미지에서 관찰된 신호의 더 높은 규칙성과 일치합니다. 그럼에도 불구하고 Ob의 중앙 ROI(그림 4F)는 미토콘드리아 분포의 중요한 변화가 있을 때 Lean에 비해 FFT 피크가 크게 감소하는 예로 관찰됩니다.
그림 1: 컨포칼 현미경을 이용한 골격근의 미토콘드리아 분석 계획. 이 체계는 프로토콜의 주요 단계를 세 단계로 요약합니다. 첫 번째 단계인 비복근 섬유 다발의 해부는 비복근 분리의 세 가지 후속 단계로 세분화된 다음 근육 기계적 해부를 다발로 나누어 최종적으로 실행 가능한 다발을 시각적으로 선택합니다. 두 번째 단계는 컨포칼 현미경에 의한 살아있는 세포 이미징 획득으로 구성되며, 이는 섬유를 챔버에 배치하기 위해 실온에서 20분 동안 형광단(TMRE)으로 배양하는 것으로 구성됩니다. 그런 다음 현미경에서 적절한 설정을 하여 컨포칼 이미지 획득을 수행합니다. 세 번째 단계에서는 공초점 이미지 처리 및 데이터 분석이 수행됩니다. FFT에 의한 미토콘드리아 밀도 계산 및 미토콘드리아 분포가 수행되는 이진 이미지를 생성하기 위해 임계값이 필요한 이미지 처리부터 시작합니다. 약어: TMRE = 테트라메틸로다민 에틸 에스테르; FFT = 고속 푸리에 변환. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 골격근 다발 해부. (A) Relax 용액이 있는 페트리 접시에서 해부된 쥐 측면 비복근 머리(검은색 화살표). (B) TMRE 로딩 전 Relax 용액의 비복근 섬유 다발의 대표 이미지. 약어: TMRE = 테트라메틸로다민 에틸 에스테르. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미토콘드리아 밀도 분석. (A) 골격근 섬유에서 IMF 미토콘드리아의 컨포칼 스캔에 권장되는 Z 거리를 나타내는 그림. (B) 운동한 Zucker +/+ 쥐(Lean)와 Z 거리(15-21μm 깊이)에서 기록된 비만 Zucker fa /fa 쥐(Ob)에서 얻은 골격근 섬유에 TMRE가 로드된 미토콘드리아의 일련의 컨포칼 이미지. 이미지는 이진화에 의해 처리되고 이진 이미지로 변환되었습니다. (C) 패널 B에서 관찰된 상이한 Z 거리에서 얻어진 공초점 슬라이스의 계산된 mito-density. (D) 패널 B에서 관찰된 이미지에 의해 구성된 스택에서 얻은 mito-밀도. 패널 B의 이미지는 65 x 50 μm입니다. 눈금 막대 = 10μm. 약어: 미토 밀도 = 미토콘드리아 밀도; IMF = 근섬유간 미토콘드리아; Ob = 비만; SSM = 근막하 미토콘드리아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FFT에 의한 미토콘드리아 분포 분석. 운동한 Zucker +/+ 쥐(Lean, 패널 A)와 비만인 Zucker fa/fa 쥐(Ob, 패널 B)에서 얻은 골격근 섬유 깊이의 21μm에서 획득한 형광 표시기 TMRE가 로드된 미토콘드리아의 대표적인 컨포칼 이미지. 이미지는 이진화에 의해 처리되고 이진 이미지로 변환되었습니다. 패널 A (패널 C) 및 패널 B (패널 D)의 측면 및 중앙 ROI, 형광 강도(위쪽 플롯) 및 FFT 스펙트럼(하단 플롯)의 각각의 플롯 프로파일. FFT는 폭이 256픽셀인 ROI에서 계산되었으며, 이는 패널 A 에서 39 x 5μm의 ROI 크기, 패널 B에서 50 x 5μm의 ROI 크기에 해당합니다. 패널 E 는 측면 ROI에서 Lean 쥐와 Ob 쥐에서 유래한 미토콘드리아에서 발견되는 FFT 스펙트럼의 차이를 보여주고, 패널 F 는 중앙 ROI의 FFT 스펙트럼 차이를 보여줍니다. 축척 막대 = 10μm. 약어: AU = 임의 단위; FFT = 고속 푸리에 변환; ROI = 관심 영역; Ob = 비만. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 100 mL의 최종 농도 | 주식 |
| K-아스파르테이트 | 100 밀리미터 | |
| 케이클 | 20 밀리미터 | |
| 헤페스 | 20 밀리미터 | |
| L-글루탐산 | 3 밀리미터 | |
| 사과산 | 3 밀리미터 | |
| 증권 시세 표시기 | 0.1 밀리미터 | 10 mM |
| 마그네슘화합물 2 | 1 mM 무함유 Mg2+ | |
| CaCl 2 (카칼2) | 0.00002 mM 유리 Ca2+ | |
| 포스포크레아틴 디-Na | 5 mM | 500 밀리미터 |
| 크레아틴 포스포키나아제 | 5 U/mL | 200 U/mL |
| 마그네슘ATP | 5 mM | |
| pH 7.3 (NaOH 포함) |
표 1: 용액 시약과 농축액을 이완시킵니다.
보충 그림 S1: 이미지 전처리 방법의 효과. (A) 운동한 Zucker +/+ 쥐(Lean, 상단 패널) 및 비만인 Zucker fa /fa rat(하단 패널)에서 얻은 골격근 섬유에서 18μm 깊이에서 획득한 형광 지시약 TMRE가 로드된 미토콘드리아의 대표 컨포칼 이미지와 함께 Otsu' 임계값, 중앙값 필터 및 Otsu' 임계값을 사용하여 전처리 후 얻은 각각의 이미지, 및 2D 디콘볼루션 및 Otsu의 임계값 설정. (B) 다른 방법으로 전처리 한 후 공초점 이미지 (패널 A)에서 얻은 mito-density의 플롯 프로파일. 패널 A 의 이미지는 65 x 50 μm입니다. 눈금 막대 = 10μm. 약어: 2D-Decon = 2D 디콘볼루션; 미토콘드리아 밀도 = 미토콘드리아 밀도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
미토콘드리아는 높은 리모델링 능력을 가진 세포 기관입니다. 미토콘드리아 역학(mitochondrial dynamics)1으로 알려진 미토콘드리아 융합 및 핵분열 메커니즘(mitochondrial fusion and fission mechanism)의 활성화와 미토콘드리아 전환 메커니즘(mitochondrial turnover mechanism) 사이의 균형, 즉 미토콘드리아 생물발생(mitochondrial biogenesis)과 특수 미토콘드리아 분해 경로(mitochondria degradation pathway, mitophagy21,22)를 통해 그 함량, 밀도 및 분포를 빠르게 수정할 수 있습니다. 미토콘드리아 함량과 형태는 세포 유형 및 발달 단계에 따라 달라질 수 있으며 다양한 생리학적 및 병리학적 자극하에서 리모델링될 수 있다 17,22,23,24. 따라서 미토콘드리아 형태학에 대한 연구는 반세기 이상 지속되어 왔다25. 특히, 전자현미경을 통한 미토콘드리아의 분석은 여러 연구에서 적용된 표준 기법이었다26.
컨포칼 현미경에 의한 형광 연구는 다양한 섬유 깊이에서 미토콘드리아의 살아있는 세포 이미징 능력으로 인해 지난 몇 년 동안 관련성을 얻었으며, 이는 다양한 적응 및 부적응 조건에서 골격근에서 미토콘드리아의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다27. 이 연구에서는 컨포칼 현미경에 의한 생체 골격근 섬유의 미토콘드리아 밀도 및 분포를 분석하는 방법론을 설명합니다. 살아있는 골격근 섬유를 다루는 주요 과제 중 하나는 미토콘드리아 공초점 기록까지의 분리 과정에서 수축을 방지하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해, 높은 Mg 및 ATP Relax 용액(17)을 사용하여 섬유를 최소 2시간 동안 이완된 상태로 유지하며, 이는 섬유 분리 프로세스, 형광단 부하 및 컨포칼 현미경에 의한 미토콘드리아 신호 획득을 수행하기에 충분한 시간을 제공합니다. 프로토콜의 중요한 점은 높은 정밀도와 신선한 조직이 필요하기 때문에 섬유를 기계적으로 얻는 것입니다. 그러나, 이전에 사용되고, 보고된 이러한 기술28을 사용하여 쥐 근육으로부터 생존 가능한 섬유 다발을 얻는 것이 가능하다. 온전한 섬유를 얻는 것은 sarcolemma 및 세포 내 환경을 보존하고, 세포 구조28,29 사이의 대사 및 기능적 누화를 유지할 수 있습니다.
조직이나 고정된 세포를 사용한 작업과 달리 컨포칼 현미경으로 살아있는 세포 이미징 형광 이미지를 획득하면 다양한 실험 조건의 효과를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 본 프로토콜은 실시간으로 미토콘드리아 밀도 및 분포의 변화를 탐색하고 Lean 및 Ob 유래 섬유 간의 예와 같이 실험 그룹 간의 차이점을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다(그림 3 및 그림 4). 살아있는 세포 이미징은 경미한 세포 손상으로 최적의 작업 조건을 표준화하는 것을 의미한다는 점을 항상 고려해야 합니다. 작업 시간, 사용된 솔루션의 품질, 획득 매개변수 및 레이저 노출을 미세하게 제어해야 합니다. 따라서 필수 고려 사항이 아래에 언급되어 있습니다.
근섬유의 미토콘드리아는 섬유의 크기와 장시간 레이저 노출로 인해 발생할 수 있는 섬유의 손상으로 인해 공초점 현미경으로 완전히 종단으로 기록할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 섬유의 대표 샘플이 이 기술로 기록됩니다. 공초점 현미경으로 쥐의 골격근 섬유의 전체 두께를 기록할 수 있지만, 이는 기록 시간이 더 길고 레이저 빔에 노출된다는 것을 의미합니다. 대조군 쥐의 경우 이러한 기록에 문제가 발생하지 않았습니다. 그러나 병리학적 상태의 섬유는 Ob 쥐의 섬유에서 관찰되는 것처럼 손상에 더 취약할 수 있습니다. 결과적으로, 상이한 Z 거리에서 얻어진 대표적인 컨포칼 이미지의 스택을 획득하는 것이 바람직하다. 섬유 두께의 한 부분만 기록되는 경우, 미토콘드리아 분포와 밀도는 섬유 내 위치에 따라 달라질 수 있으므로 테스트한 모든 섬유에 대해 동일한 깊이로 스택을 채취하는 것이 좋습니다. IMF의 대표적인 컨포칼 이미지를 얻으려면 15μm 이상의 깊이에서 신호를 획득하는 것이 좋으며, 주변부에 가까운 SSM 집단을 피하는 것이 좋습니다.
공초점 획득 중에는 몇 가지 중요한 고려 사항을 고려해야 합니다. 먼저, 배율, 높은 NA 및 침지 매체를 고려한 침지 대물렌즈의 선택. 세포는 친수성 배양 배지에서 유지되기 때문에 배양 및 침지 배지의 굴절률은 좋은 신호를 얻고 조직 깊숙이 스캔하기 위해 유사해야 합니다. 일반적으로 침수 대물 렌즈를 사용하여 달성합니다. 그림 3 과 그림 4 의 컨포칼 이미지는 20x, 0.7NA, Water Immersion Objective로 획득했습니다. 이 대물렌즈를 사용하면 모든 깊이에서 광섬유를 기록할 수 있지만 높은 형광 강도 신호와 경미한 섬유 손상으로 IMF의 대표 공초점 이미지를 얻을 수 있기 때문에 15, 18 및 21μm에서 스캔하기로 결정했습니다. 40x 및 이멀젼 매체로서의 오일과 같은 다른 배율을 고려할 수 있지만 평가해야 합니다.
둘째, 이미징 획득을 위한 픽셀 크기는 나이퀴스트 정리(Nyquist theorem)에 따라 계산되며, 이를 통해 과잉 샘플링(더 높은 레이저 노출) 및 과소 샘플링(더 낮은 해상도로 이어짐)을 방지하는 적절한 픽셀 크기를 선택할 수 있습니다30. 계산은 선택한 대물 렌즈의 특성과 파장(~90nm)에 따라 다릅니다. 줌으로 조정할 수 있습니다. 따라서 하나의 줌 설정만 최적의 픽셀 크기(30)를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 실제로 줌은 분석할 표본의 영역에 따라 달라집니다. 따라서 균형을 찾으면 나이퀴스트 기준에 가장 가깝고 분석할 영역에 맞는 픽셀 크기로 작업할 수 있습니다. 그림 3 과 그림 4 는 150 및 190nm의 픽셀 크기로 획득되어 ~50-80μm인 섬유의 전체 너비를 분석할 수 있습니다.
셋째, 초점이 맞지 않는 빛이 감지기에 도달하는 것을 방지하는 적절한 핀홀 직경을 사용해야 합니다. 전형적으로, 1 Airy는 초점(30)의 평면으로부터 유래하는 광자의 ~80%의 검출을 허용하기 때문에 최적의 핀홀 크기로 간주된다. 그럼에도 불구하고, 낮은 형광 수준을 나타내는 일부 염색된 생물학적 샘플은 핀홀 증가(pinhole increase)를 필요로 한다(30). 그림 3 및 그림 4의 컨포칼 이미지는 더 낮은 Airy로 캡처된 낮은 신호로 인해 3 Airy의 핀홀 크기로 획득되었습니다. 핀홀 크기 증가로 인한 신호 강도 증가는 초점이 맞지 않는 캡처된 빛의 증가로 인해 해상도가 감소한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로 가능한 한 통풍이 잘되는 1에 가까운 핀홀 크기를 사용하는 것이 좋습니다.
적절하게 획득되면 공초점 이미지를 처리하여 미토콘드리아 밀도 및 분포에 대한 정량적 정보를 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 임계점의 중요한 처리 이미지 단계는 신호의 정량화를 개선하기 위해 분석 전에 수행되어야 합니다. 이 중요한 단계에서 미토콘드리아의 양성 픽셀을 배경의 양성 픽셀과 분리하는 형광 강도 값이 정의됩니다. 임계값은 이미지의 히스토그램이 배경에 해당하고 다른 하나는 미토콘드리아에 해당하는 두 개의 피크를 표시할 때 미토콘드리아를 나타내는 피크의 가우스 피팅으로 정의할 수 있습니다. 그러나 각 이미지에서 바이모달 분포가 항상 달성되는 것은 아니므로 다른 임계값 방법을 적용해야 합니다.
이 프로토콜에서는 Otsu의 임계값 설정의 구현이 설명되는데, 이는 두 피크가 분리되지 않거나 다른 피크가 존재할 때 임계값을 찾도록 설계된 비모수적이고 감독되지 않은 방법입니다(31). Otsu는 생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 플랫폼을 사용하여 쉽게 적용할 수 있습니다. 그러나 다른 임계값 설정 방법을 테스트할 수 있습니다. 모든 컨포칼 이미지에 동일한 임계값 방법을 적용해야 하며 각 컨포칼 이미지에 대해 독립적으로 계산해야 합니다. 전체 스택에 임계값을 적용하면 잘못된 결과가 발생합니다. 임계값 설정 프로세스 후에 바이너리 이미지를 얻으면 이 프로토콜에 설명된 지침에 따라 미토콘드리아 밀도 및 FFT 분석을 쉽게 수행할 수 있습니다. 그러나 두 분석을 모두 수행할 때 정량화 오류가 발생할 수 있으므로 핵과 모세관을 포함하지 않도록 주의해야 합니다. 밀도와 관련하여 분석할 픽셀 또는 전체 면적에서 픽셀 또는 핵 또는 모세관이 차지하는 면적을 빼는 것으로 충분합니다. 또한 FFT 분석을 수행할 때 미토콘드리아 신호가 직선인지 확인해야 합니다. 반대로, 미토콘드리아 신호가 기울어지면 미토콘드리아 종방향 분포를 나타내지 않는 프로파일이 생성되어 잘못된 FFT 스펙트럼 데이터가 생성될 수 있습니다. 또한, 이미지의 노이즈를 줄이기 위해 전처리 단계를 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 중앙값 필터와 2D 디콘볼루션을 사용하는 두 가지 선택적 전처리 단계를 설명합니다. 이미지 및 미토콘드리아 밀도 함량에 대한 이러한 전처리 방법의 효과는 보충 그림 S1에 제시되어 있습니다. 이러한 전처리는 이미지 품질을 향상시킬 수 있지만 특정 이미지 세부 정보가 손실될 수도 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 주의해서 사용해야 하며 분석 중인 모든 이미지에 일관되게 적용해야 합니다.
그 장점에도 불구하고, 컨포칼 현미경은 획득을 위한 최적의 조건이 구현될 때 180-250nm의 측면 해상도(XY)에 의해 제한된다32. 미토콘드리아 직경은 ~200-700nm로 컨포칼 현미경의 회절 한계에 가깝습니다. 따라서, 미토콘드리아 이하 구조는 적절하게 검출될 수 없고(33 ) 이 프로토콜에 나타난 밀도 및 FFT 분석에 의해 평가될 수 없다. 확률적 광학 재구성 현미경(STORM), 유도 방출 공핍(STED) 나노스코피 또는 구조화된 조명 현미경(SIM)과 같은 현미경의 다른 초고해상도 기술을 탐색하여 미토콘드리아 하부 구조(32)를 분해할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 미토콘드리아의 공초점 이미지는 미토콘드리아 막 전위에 따라 달라지는 형광단 TMRE를 사용하여 얻습니다. 따라서 미토콘드리아 형광 강도는 막 전위에 따라 달라질 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 데이터 분석 전에 임계값 프로세스가 수행됩니다. 정의된 임계값을 초과하는 모든 픽셀은 형광 값과 관계없이 미토콘드리아 신호에 대해 양수로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고 막 전위가 매우 낮은 미토콘드리아는 이 기술로 해결할 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 미토콘드리아 단백질 함량 정량화에 대한 보완 연구가 권장됩니다. TMRE를 사용하면 공초점 이미지를 미토콘드리아 막 전위 분석에도 사용할 수 있지만 카르보닐시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP)과 같은 분리제를 사용한 적절한 제어를 수행해야 한다는 장점이 있습니다. 또한 미토콘드리아 밀도 및 분포 분석에 대한 지침은 막 전위에 관계없이 미토콘드리아를 로드하는 미토콘드리아에 대한 녹색 형광 표시기를 사용하여 달성할 수 있지만 배양 전략 및 공초점 획득 설정을 표준화해야 합니다.
미토콘드리아 구조가 필수 미토콘드리아 및 세포 기능과 관련이 있다는 점을 감안할 때, 여기에 설명된 프로토콜은 질병 중 또는 특정 스트레스 모욕에 의한 미토콘드리아 리모델링에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이는 에너지 생산과 같이 미토콘드리아에 의해 지배되는 골격근의 주요 기능이나 미토콘드리아가 수축-대사 결합과 같은 다른 세포 기관과 상호 작용하는 데 중요한 역할을 하는 골격근의 주요 기능을 더 잘 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 프로토콜 지침을 따르면 살아있는 골격근의 미토콘드리아 밀도와 분포를 추정할 수 있습니다. 프로토콜 단계는 골격근 다발 절제, 컨포칼 현미경 스캐닝 및 이미지 분석에 중점을 둔 세 가지 주요 단계로 나뉘며, 여기에는 자세한 지침과 중요한 고려 사항이 포함됩니다. 특히, 이 프로토콜은 사용자의 필요에 따라 섬유 내에서 완전한 미토콘드리아 재건을 위한 추가 Z 단계를 탐색하도록 더욱 최적화될 수 있습니다. 예를 들어, 공초점 이미지 및 분석 단계를 테스트하여 살아있는 샘플과 고정 샘플의 TT와 같은 유사한 분포를 가진 세포 구조를 연구할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 의과대학과 몬테레이 공과대학의 비만 연구소의 지원을 받았습니다. 그림 3A 는 Scientific Image and Illustration 소프트웨어를 사용하여 만든 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
| Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
| Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Forceps | Miltex | MH-18 | |
| HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
| Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
| Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |
References
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