Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analys av mitokondriell densitet och longitudinell fördelning i levande skelettmuskelfibrer hos råtta med konfokalmikroskopi

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65306
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3
1Experimental Medicine and Advanced Therapies, The Institute for Obesity Research, Tecnologico de Monterrey, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Preclinical Research Unit, Tecnologico de Monterrey

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att analysera förändringar i mitokondriell densitet och longitudinell fördelning genom avbildning av levande skelettmuskulatur med hjälp av konfokalmikroskopi för mitokondriell nätverksskanning.

Abstract

Mitokondrien är en organell som kan förlängas, fragmenteras och renoveras enligt cellernas metaboliska krav. Ombyggnaden av det mitokondriella nätverket gör det möjligt för friska mitokondrier att möta cellulära krav; Förlusten av denna kapacitet har dock relaterats till utvecklingen eller progressionen av olika patologier. I skelettmuskulaturen observeras mitokondriella densitets- och fördelningsförändringar vid fysiologiska och patologiska tillstånd som träning, åldrande och fetma, bland annat. Därför kan studiet av det mitokondriella nätverket ge en bättre förståelse för mekanismer relaterade till dessa tillstånd.

Här beskrivs ett protokoll för mitokondrieavbildning av levande skelettmuskelfibrer från råttor. Fibrerna dissekeras manuellt i en relaxerande lösning och inkuberas med en fluorescerande levande cellavbildningsindikator för mitokondrier (tetrametylrhodamineylester, TMRE). Mitokondriesignalen registreras med konfokalmikroskopi med hjälp av XYZ-skanningsläget för att få konfokala bilder av det intermyofibrilllära mitokondriella nätverket (IMF). Därefter bearbetas de konfokala bilderna genom trösklar och binarisering. Den binariserade konfokala bilden står för de positiva pixlarna för mitokondrier, som sedan räknas för att erhålla mitokondriedensiteten. Det mitokondriella nätverket i skelettmuskulaturen kännetecknas av en hög täthet av IMF-population, som har en periodisk longitudinell fördelning som liknar den för T-tubuli (TT). Fast Fourier Transform (FFT) är en standardanalysteknik som utförs för att utvärdera fördelningen av TT som gör det möjligt att hitta distributionsfrekvensen och organisationsnivån. I detta protokoll beskrivs implementeringen av FFT-algoritmen för analys av den longitudinella mitokondriella fördelningen i skelettmuskulaturen.

Introduction

Mitokondrier bildar mycket dynamiska nätverk som huvudsakligen regleras av balansen mellan dess förlängning (fusion) och fragmentering (fission)1,2, som moduleras av uttrycket och aktiviteten hos proteiner såsom mitofusin 1 och 2 (Mfn1 och Mfn2) och optisk proteinatrofi 1 (Opa1), som reglerar fusionen av det yttre mitokondriella membranet och det inre membranet, respektive 1,2. Dynaminrelaterat protein (Drp1) reglerar främst mitokondriell fission när det fosforyleras i Ser6163.

I skelettmuskulaturen är det väl etablerat att det mitokondriella nätverket är ordnat i strukturellt väldefinierade subpopulationer baserat på deras närhet till olika cellregioner (myofibriller, sarkolemma och kärnor)4,5. De mitokondrier som ligger precis under sarkolemma kallas subsarkolemmala mitokondrier (SSM), de som ligger mellan de kontraktila filamenten kallas intermyofibrillära mitokondrier (IMF), och den mitokondriella subpopulationen runt kärnorna kallas perinukleära mitokondrier nätverk (PMN). Dessutom har det föreslagits att dessa mitokondriella subpopulationer har regionspecifika funktioner och är metaboliskt specialiserade 4,5.

Upprätthållandet av cellulär energihomeostas, som möjliggör metabolisk och kontraktil funktion, beror till stor del på interaktion och kommunikation på specifika platser genom det mitokondriella nätverket (t.ex. IMF- och SSM-interaktion)4,6. Förutom mitokondriernas nätverksinteraktioner kan mitokondrien också interagera med andra organeller och bilda strukturella och funktionella komplex. I detta avseende har det visats att IMF kan placeras intill det sarkoplasmatiska nätverket (SR) och i närheten av Ca2+ frisättningsenheterna (CRU), som bildas av de tvärgående tubuli (TT)7. Detta faktum är relevant på grund av den roll som mitokondriellt Ca2+-upptag spelar för att reglera ATP-syntes och apoptos. Nyligen har en potentiell roll i regleringen av cytosoliska Ca2+-transienter också föreslagits8.

TT är invaginationer av sarkolemma som har en periodisk fördelning längs den längsgående axeln av kardiomyocyter och skelettmuskelfibrer 9,10, liknande IMF-fördelningen 5. Förändringar i fördelningen av TT har viktiga fysiologiska implikationer, med tanke på deras roll i kontraktil funktion. Dessa förändringar har dock främst utvärderats i kardiomyocyter. Genom att använda FFT-analys (Fast Fourier Transform) kan periodiska signaler omvandlas från avståndsdomänen till frekvensdomänen, vilket resulterar i ett FFT-spektrum som indikerar frekvensen och regelbundenheten för signalen11,12,13. Även om det finns bevis för att organisationen av det mitokondriella nätverket i skelettmuskelfibrer är avgörande för anpassning till olika metabola tillstånd, som under regenerering efter muskelskada14,15, utförs de flesta analyser kvalitativt.

Dessutom, med tanke på att mitokondriell dysfunktion har associerats med flera skelettmuskelrelaterade (t.ex. disuse atrofi)2 och icke-muskelsjukdomar, särskilt metabola sjukdomar, och den associerade förlusten av muskelmassa (dvs. atrofi)16, är den kvantitativa utvärderingen av det mitokondriella nätverket och fördelningen i skelettmuskulaturen relevant. Nyligen har en signifikant skillnad i den longitudinella fördelningen av mitokondrier av gastrocnemius muskelfibrer mellan en överviktig grupp (Ob; Zucker fa/fa rats) och en mager grupp (Lean; Zucker +/+ råttor) identifierades genom FFT17. Denna studie visade användbarheten av FFT för att analysera mitokondriefördelningen. Därför presenterar detta protokoll en metod för att studera mitokondrier i levande skelettmuskelfibrer från bilder erhållna genom fluorescenskonfokalmikroskopi. Mitokondriell densitet kvantifieras genom bakgrundströskelvärde, och analysen av longitudinell mitokondriell fördelning genom FFT-analys beskrivs också. Ett arbetsflödesschema visas i figur 1.

Protocol

Alla djurförsöksförfaranden utvärderades och godkändes av Animal Use and Care Committee (CICUAL) i Tecnologico de Monterrey (protokoll 2019-007). Zucker-hanråttor (+/+ och fa/fa) i åldern 12 till 13 veckor användes för denna studie. Djuren hölls under normala djurhållningsförhållanden (12 timmar/12 timmar ljus/mörker, 40-60 % luftfuktighet) och hade tillgång till mat (standard råttmat) och vatten ad libitum.

1. Lösningens sammansättning

  1. Bered färsk Relax-lösning genom att blanda komponenterna som visas i tabell 1. Justera pH till 7,3 med natriumhydroxid (NaOH).
  2. Beräkna koncentrationen av fritt kalcium i Relax-lösningen med hjälp av ett simuleringsprogram för bestämning av koncentrationen av fria metaller.
  3. Bered en 5 mM tetrametylrhodaminmetylester (TMRE) i dimetylsulfoxid (DMSO) och en efterföljande spädning av 0,1 mM i DMSO.

2. Dissektion av gastrocnemius muskelfiberbuntar

  1. Placera djuret i induktionskammaren och stäng locket. Slå på syrgaskällan, ställ in gasflödet på 0.5 L/min och ställ in förångaren på 4 % sevofluran för att inducera anestesi.
  2. När råttan sover, placera den utanför kammaren i ryggläge medan du bibehåller bedövning. Nyp ihop tån eller svansen för att kontrollera bristen på reflexer.
  3. Klipp med en sax genom bukens hud och muskler. Klipp sedan av bröstkorgsburen för att få tillgång till hjärtat.
  4. För att utföra en kardiektomi tar du tag i hjärtat från de översta venerna och artärerna med en pincett och klipper av blodkärlen med en sax. Ta bort hjärtat.
  5. Omedelbart efter avlivning desinficerar du bakbenen med etanol och rakar den med en rakmaskin.
  6. Håll i bakfoten och gör ett snitt med sax genom huden i höjd med hälsenan.
  7. Klipp bakbenet med en sax i nivå med det proximala skenbenet. Överför den till en 60 mm petriskål som innehåller 3 ml iskall Relax-lösning i ryggläge. Täck den med tillräckligt med lösning för att förhindra att musklerna torkar ut.
  8. Identifiera akillessenan, höj den försiktigt med en pincett och dissekera musklerna bort från benet med irissax. Använd ett stereomikroskop från och med detta steg och framåt i dissektionen.
  9. Identifiera och separera hela gastrocnemius-muskeln, huvuddelen på baksidan av bakbenet.
  10. Dissekera och kassera bindväven och fettvävnaden som omger muskeln med en pincett. Överför muskelns laterala huvud till en ny petriskål med iskall Relax-lösning (se figur 2A).
  11. Håll försiktigt muskeln med pincett från ena änden och separera den försiktigt i buntar med en mikrosax. Manipulera alltid buntar genom att försiktigt hålla dem i ena änden med en pincett.
    OBS: Buntarna är cirka 10 mm långa och 2 mm breda.
  12. Överför fiberknippena till en ny petriskål med 2 ml iskall Relax-lösning. Välj bara de som har ett jämnt utseende, är kompletta från ena änden till den andra och inte är förkortade (figur 2B).

3. Avbildning av levande celler av mitokondrier i skelettmuskulatur med konfokalmikroskopi

  1. Inkubera fibrerna i 2,5 × 10-4 mM TMRE i Relax-lösning i 20 min i rumstemperatur.
    OBS: Med de rekommenderade arbetskoncentrationerna av TMRE förväntas den vara i ett icke-släckningsläge. Skydda mot ljusexponering från och med nu.
  2. Under inkubationstiden:
    1. Öppna standardprogramvaran för konfokalmikroskopet, välj konfigurationsramverket och välj laser i dialogrutan för hårdvarukonfiguration och markera alternativet HeNe 543.
    2. I inhämtningsramverket väljer du dialogrutan för förvärv och i förvärvsläget väljer du XYZ-panelen.
    3. I XY-dialogrutan väljer du formatet 512 x 512, hastigheten 400 Hz och kontrollerar hålpanelen. I dialogrutan som visas för nålhål väljer du AU för enhet och lägger till värdet 3 Airy för hålet.
      OBS: Överväg att minska nålhålsstorleken närmast kriteriet 1 Airy optimalt, om en adekvat fluorescenssignal bevaras.
    4. I dialogrutan Inställningar för strålbana väljer du ett vattennedsänkningsmål på 20x och numerisk bländare (NA) på 0,7 (20x/0,7 IMM) och väljer emissionsvåglängdsfönstret på 576–700 nm. Välj DD488/543 och 15 % av lasereffekten för 543-lasern.
      OBS: En objektivlins för nedsänkning i vatten för livebildskanning rekommenderas starkt (om tillgängligt). Eftersom ett liknande brytningsindex för nedsänkningsmediet och inkubationsmediet uppnås.
  3. Efter 20 minuters inkubation byts inkubationsmediet ut två gånger. Se till att konfokalbilderna tas inom 20-30 minuter efter inkubationen.
  4. Förbered inspelningskammaren med en 0,15 mm täckglas av borosilikatglas.
    OBS: Välj tjockleken på täckglaset enligt den tillgängliga inspelningskammaren, med tanke på att tjockleken vanligtvis varierar från 0.15 till 0.22 mm för optimal prestanda.
  5. Tillsätt 200 μL Relax-lösning till inspelningskammaren och överför fiberknippena.
  6. I konfokalmikroskopet, använd ljusfältsläget för att identifiera livskraftiga fibrer för fluorescerande registrering av mitokondrier. Livskraftiga fibrer är kompletta, inte sammandragna och har ett intakt strimmigt mönster.
  7. Separera fiberknippena från varandra och rikta in dem med pincett. Välj de som är närmast täckglaset.
  8. Skanna fluorescensen med live-knappen för att justera förstärkning och förskjutning i kontrollpanelens konsol med hänsyn till följande:
    1. Välj låga fluorescerande intensitetsvärden för en bakgrund på nästan 0 godtyckliga enheter (AU).
    2. Välj en förstärkningsnivå mellan 100 och 200 A.U. för att undvika överbelastning av inspelningssystemet. Registrera därför inte de högsta fluorescensnivåerna.
    3. Välj en pixelstorlek på 150-190 nm för att få fiberns fulla bredd och justera zoomfaktorn i XY-dialogrutan .
      OBS: Överväg att använda pixelstorleken närmare Nyquist-kriterierna (90 nm), vilket möjliggör skanning av fiberns fulla bredd.
  9. I dialogrutan Z-stack justerar du Z-avståndet för att få fluorescenssignalen från ett fiberdjup på 15 μm (startknapp) upp till 22 μm (slutknapp). Välj 3 μm som Z-stegsstorlek.
  10. Klicka på Start för att hämta konfokalbilderna. Skaffa en Z-stack som består av tre konfokala bilder tagna på 15, 18 och 21 μm djup.

4. Analys av mitokondriell densitet

  1. I plattformen med öppen källkod för biologisk bildanalys18 öppnar du Z-stacken file och roterar bilderna för att placera fibern horisontellt, som visas i figur 3B.
  2. Välj slumpmässigt ett rektangulärt intresseområde (ROI) som inkluderar det område som upptas av mitokondrierna (ROImito). Välj ROImito-storlekar från 65 till 90 μm för X. För Y beror storleken på fiberbredden, vilket undviker dess periferi.
  3. Duplicera Z-stacken med den valda ROI-miton och spara den som en ny Z-stack (Mito-stack) i TIFF-format. Spara den ROI mito-position som valts på den ursprungliga stacken med ROI Manager-verktyget.
  4. Beräkna tröskelvärdet för bakgrundssubtraktion enligt följande:
    1. Använd kortkommandot kommando+skift+t för att öppna dialogrutan Tröskelvärde .
    2. Välj tröskelalgoritmen Otsu |Svartvitt | Alternativ för mörk bakgrund . Observera att bilden nu är binäriserad.
    3. I dialogrutan Tröskelvärde observerar du histogrammet för fördelningen av fluorescensintensiteten och det tröskelvärde som visas.
      OBS: Mitokondripositiva pixlar har fluorescensintensitetsvärden som är större än tröskelvärdet och visas som vita pixlar i den binära bilden.
    4. Tillämpa tröskelvärdet på den binära bildstacken genom att välja Använd. I dialogrutan Konvertera stapel till binär som visas väljer du alternativen Beräkna tröskelvärde för varje bild, Svart bakgrund, Skapa ny stapel och klickar på OK.
  5. Observera att en stack med de tre binära avbildningarna genereras (BinDMito-stack). Spara den i TIFF-format.
  6. Beräkna mitokondriell densitet i BinDMito-stacken enligt följande:
    1. Välj menyn Analysera . Klicka sedan på Histogram. I dialogrutan Histogram som visas klickar du på Ja om du vill ta med alla bilder i stapeln för analys.
    2. I dialogrutan Histogram för stapel klickar du på Lista för att hämta histogramdata. Överför histogramdata till ett kalkylblad.
    3. I ett kalkylblad identifierar du Mito-pixlar som är de med värdet 255 . Beräkna mitokondriell densitet med hjälp av ekvation (1):
      Mitokondriell densitet = Equation 1 × 100 (1)
      Det totala antalet pixlar identifieras som N i dialogrutan Histogram eller beräknas genom att summera antalet pixlar i histogrammet i kalkylbladet.
    4. För att beräkna arean som upptas av mitokondrier (μm2), multiplicera Mito-pixlarna i BinDMito-stacken med pixelstorleken.

5. Analys av mitokondriell fördelning med Fast Fourier Transform

  1. I plattformen med öppen källkod för biologisk bildanalys öppnar du BinDMito-stacken och ritar en rektangulär ROI på 256 pixlars bredd och 5 μm höjd. Leta reda på en ROI i ett centralt läge och en annan i ett lateralt läge, som visas i figur 4A,B.
  2. Använd ROI Manager-verktyget för att konfigurera ROI:erna för FFT-analys och spara den.
    OBS: Beroende på analysens behov kan andra ROI:er väljas i olika positioner och deras storlekar kan ändras. Bredden måste dock vara lika med 2n pixlar för att utföra FFT (t.ex. 128, 256, 512 pixlar).
  3. Hämta plottningsprofilen för ROI:erna med hjälp av genvägskommandot + k och överför data till ett kalkylblad.
  4. I kalkylbladet fyller du i kolumnerna B och C med de data som hämtats från diagramprofilen. B-kolumnen innehåller avståndet i μm och C-kolumnen motsvarande gråvärde för fluorescensintensiteten (A.U.).
  5. D-kolumnen motsvarar FFT-frekvensen (händelse/μm), som kommer att fyllas enligt följande:
    1. Beräkna samplingsfrekvensen (Fs): Fs = 1/Δ d, där Δd är avståndssteget (det andra värdet på B).
    2. Beräkna Δ Fs: Δ Fs= Fs/N, där N är antalet datapunkter för B (256).
    3. Beräkna stoppvärdet för FFT-frekvensen (S): S = (N/2) ×ΔFs.
    4. Fyll kolumn D enligt följande:
      1. Det första värdet i D-kolumnen är lika med 0.
      2. Markera den andra cellen i D-kolumnen , gå till startmenyn, välj fyllning och klicka på serie. Välj kolumner. För stegvärdet används det beräknade Δ Fs. För stoppvärdet använder du det beräknade S.
    5. Fyll sedan E-kolumnen med de komplexa FFT-värdena enligt följande:
      1. Infoga 0 i den första cellen i C-kolumnen, eftersom avståndet 0 måste sammanfalla med en signal 0 för beräkningen av FFT.
      2. Gå sedan till menyn Data , klicka på Dataanalys och välj Fourieranalys.
      3. I det nya fönstret väljer du datapunktsområdet för den fluorescerande signalen som beskrivs i kolumn C för ingångsområdet.
        OBS: Antalet datapunkter måste vara 2n (t.ex. 256 eller 128 datapunkter med fluorescerande signal).
      4. Välj motsvarande område för E för utgångsområdet.
      5. Välj Ok och låt FFT-komplexvärdena fyllas i automatiskt.
  6. Fyll F-kolumnen med FFT-magnituden enligt följande:
    1. Använd IMABS-funktionen för att returnera det absoluta värdet i F från det komplexa talet i E och multiplicera med 2/N för att normalisera (ekvation (2)):
      FFT-magnitud = (IM.ABS (E1... En) × (2/N) (2)
  7. Plotta FFT-spektrumet med FFT-magnituden i F, som en funktion av FFT-frekvensen i D, tills S. Hitta punkten för den maximala toppen och dess motsvarande FFT-frekvens.
  8. Konvertera FFT-frekvensen för den maximala toppen till avstånd med ekvation (3). Detta beräknade avstånd representerar det longitudinella avståndet för mitokondriefördelningen.
    Avstånd (μm) = 1/FFT-frekvens (3)
    OBS: På grund av FFT-symmetri, plotta inte FFT-frekvensen utöver S-värdet , vilket motsvarar hälften av datapunkterna, för att undvika duplicering av FFT-spektrumet.

6. Valfria förbehandlingssteg för att minska bildbruset före bildanalys

  1. Använd ett medianfilter eller en 2D-faltning på följande sätt:
    1. För medianfilter:
      1. Välj Process | Filtrerar och klicka på alternativet Median .
      2. I dialogrutan Median som visas väljer du 2,0 för Radie och klickar på OK. Välj Ja om du vill tillämpa processen på alla bilder i Mito-stapeln.
      3. Observera minskningen av brus i bilderna.
    2. För 2D-dekonvolution:
      1. Generera en teoretisk punktspridningsfunktion (PSF).
      2. Ladda ner plugin-PSF_Generator.jar och placera filen i mappen "Plugins".
      3. I dialogrutan PSF-generator klickar du på alternativet Born & Wolf 3D optisk modell, anger nedsänkningsvärdet för brytningsindex på 1,33 som används vid konfokal skanning och väljer Bäst för alternativet Noggrannhetsberäkning .
      4. Fånga 576 nm för emissionsvåglängd, NA för objektivlinsen som används på 0,7 och Z-steget på 3 000 nm.
      5. Fånga pixelstorleken XY för den konfokala bilden som ska dekonvolteras, samt storleken XYZ som anger antalet pixlar i X och Y och antalet Z-steg (3 för detta protokoll).
      6. I menyn Visa i PSF-generatorn klickar du på alternativet linjär, väljer 8 bitars upplösning och väljer sedan det grå alternativet för uppslagstabellen (LUT).
      7. Kör PSF-generatorn och spara den teoretiska PSF som skapats i TIFF-format.
      8. Gör en summa av de delar av PSF som skapats genom att öppna verktyget Z-projekt för alternativet Staplar som finns i menyn Bild .
      9. I dialogrutan ZProjection som visas väljer du Summera sektorer som projektionstyp och klickar på OK. Spara den nya PSF i TIFF-format.
        Anm.: En polyesterstapelfibrer som framställts experimentellt genom konfokal skanning av fluorescerande mikropärlor med känd diameter kan användas i stället för den teoretiska polyesterstapelfibrerna.
      10. Ladda ner plugin-programmet "DeconvolutionLab_2.jar"19 och placera det i plugin-mappen.
      11. Klicka på menyn Plugins. Klicka sedan på DeconvolutionLab2.
      12. Separera de konfokala bilderna från Mito-stapeln med hjälp av verktyget Bilder att stapla från alternativet Staplar som finns i Bild menyn och spara den i TIFF-format.
      13. I dialogrutan DeconvolutionLab2 väljer du en av de bilder som hämtas från Mito-stacken. Välj den teoretiska PSF som skapats och välj algoritmen Richardson-Lucy med 15 iterationer.
      14. Kör DeconvolutionLab2, verifiera signalförbättring och brusreducering i bilden och spara den i TIFF-format.
  2. Fortsätt med steg 4.4 för bildanalys.
  3. För tröskelvärdet för de invecklade bilderna konverterar du dem till en 8-bitarsmask under tröskelprocessen. Skapa en stapel med binära och invecklade bilder genom att välja Bilder att stapla i verktyget Staplar på menyn Bild .
  4. För FFT-analys av invecklade bilder innehåller diagramprofilen avstånd i pixelenheter. Transformera pixelenheterna till μm enligt följande:
    1. När du har slutfört steg 5.4 överför du data från B till A i kalkylbladet. Fyll sedan B med avståndet i μm genom att multiplicera varje pixelnummer från A med pixelstorleken.

Representative Results

Enligt detta protokoll kan analys av mitokondriernas densitet och fördelning uppnås i levande skelettmuskulatur. Protokollet är indelat i tre huvudsteg: Dissektion av skelettmuskelknippen, konfokalmikroskopiskanning och bildanalys. Arbetsflödesöversikten visas i bild 1. Figur 2A visar en hel råtta gastrocnemius-muskel i en petriskål, som markerar det laterala huvudet från vilket fibrerna erhålls, medan figur 2B visar fiberbuntarna i Relax-lösning. Med konfokalmikroskopi kan mitokondrierna registreras längs djupet av levande skelettmuskelfibrer med hjälp av den fluorescerande indikatorn TMRE. TMRE är en lipofil katjonisk fluorofor som selektivt ackumuleras i mitokondrier i enlighet med mitokondriemembranpotentialen20.

En optimal konfokalbild av IMF kan erhållas genom att välja ett Z-avstånd över 15 μm djup i fibern (figur 3A). Figur 3B visar representativa XY-konfokala bilder av mitokondrier laddade med TMRE tagna längs gastrocnemiusmuskelfibrernas Z-avstånd (15 till 21 μm). De konfokala bilderna bearbetades genom trösklar för att omvandla dem till binära bilder för att möjliggöra mitokondriell analys. Figur 3B (vänster panel) visar en fiber från en tränad Lean-råtta. Det representerar ett förväntat konfokalt rekord av skelettmuskelfibermitokondrier eftersom det har ett konsekvent mönster längs fibern. Däremot valde vi en fiber från en Ob-råtta (Figur 3B, höger panel) som visar betydande förändringar i mitokondrieinnehåll och distribution. Figur 3C visar kvantifieringen av fiberområdet som upptas av mitokondrierna uttryckt som mitokondriell densitet, erhållen från varje binariserad bild (visas i panel B). Som förväntat uppvisade Ob-fibern en lägre mitokondriell densitet. Det kvantifierades konsekvent längs det analyserade Z-avståndet, vilket också observeras i figur 3D när mitokondriedensiteten beräknas per stapel som överensstämmer med de tre konfokala bilderna som tagits vid 15, 18 och 21 μm.

I likhet med mitokondriell densitetsanalys möjliggör konfokalskanning av en fluorescerande indikator för avbildning av levande celler, såsom TMRE, att studera den longitudinella organisationen av mitokondrier i levande skelettmuskulatur. IMF presenterar en periodisk organisation i I-bandet nära TT7, som kan analyseras av FFT för att kvantifiera frekvensen av den mitokondriella signalen och organisationsnivån17. Figur 4 visar skillnaderna i organisationen av IMF som finns hos gastrocnemius härledda från Lean- och Ob-råttor och hur FFT gör det möjligt att hitta förändringar i fördelningen av mitokondriesignalen. Figur 4A,B visar longitudinella ROI valda i en central och lateral position i fibern för FFT-analys. Innan FFT utförs beräknas tröskelvärdet för bakgrundssubtraktion. Sedan binariseras bilden. Dessa procedurer eliminerar variationerna i mitokondriesignalens fluorescensintensitetsnivåer. Den binära bilden ger plottningsprofilen för fluorescensfördelning som är nödvändig för att utföra FFT.

Figur 4C,D visar de valda ROI:erna i panelerna A och B med deras plottningsprofiler (övre paneler). Från plottprofilerna kan skillnader i fluorescensfördelningen mellan fibrerna som härrör från Lean- och Ob-råttor observeras, liksom variationerna mellan ROI inom samma fiber. För varje områdesprofil presenteras deras respektive FFT-spektrum (nedre paneler). Toppen av det maximala FFT-spektrumet indikerar FFT-frekvensen (X-axeln) för den mitokondriella signalfördelningen längs den längsgående axeln. Det kan omvandlas till ett avståndsvärde nära 2 μm i de laterala och centrala ROI:erna från Lean-råttan. Noterbart är att FFT-storleken på toppen är ett index för regelbundenheten hos den mitokondriella signalen, och förändringar i denna amplitud avslöjar förändringar i mitokondriefördelningen.

Figur 4E,F visar skillnaderna i FFT-spektrumet mellan Lean- och Ob-härledda fibrer där laterala respektive centrala ROI analyserades. I laterala ROI (Figur 4E) var frekvensen av mitokondriell längsgående fördelning likartad i de magra och Ob-härledda fibrerna; ändå var amplituden för den maximala FFT-toppen i de Ob-härledda fibrerna högre, vilket överensstämmer med den högre regelbundenheten hos signalen som observerades i bilden i figur 4B. Icke desto mindre observeras den centrala ROI (figur 4F) för Ob som ett exempel på en kritisk minskning av FFT-toppen jämfört med Lean när en viktig förändring av mitokondriefördelningen är närvarande.

Figure 1
Figur 1: Schema för mitokondriell analys i skelettmuskulatur med konfokalmikroskopi. Detta schema sammanfattar protokollets huvudsteg i tre separata faser. Den första fasen, dissektion av gastrocnemius muskelfiberbuntar, är uppdelad i tre efterföljande steg, gastrocnemius muskelisolering, följt av muskelmekanisk dissektion i buntar för att slutligen göra ett visuellt urval av de livskraftiga. Den andra fasen består av insamling av levande celler genom konfokalmikroskopi, som består av inkubation med fluoroforen (TMRE) i 20 minuter vid rumstemperatur för att placera fibrerna i kammaren. Därefter görs lämpliga inställningar i mikroskopet för att genomföra insamlingen av konfokalbilderna. Under den tredje fasen genomförs konfokal bildbehandling och dataanalys. Börjar med bildbehandling, där en tröskel krävs för att generera binära bilder från vilka mitokondriella densitetsberäkningar och mitokondriell fördelning med FFT görs. Förkortningar: TMRE = tetrametylrhodamine-etylester; FFT = Snabb Fouriertransform. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Dissektion av skelettmuskelknippen. (A ) Dissekerat råttans laterala gastrocnemiushuvud (svart pil) i en petriskål med Relax-lösning. (B) Representativ bild av gastrocnemius muskelfiberbuntar i Relax-lösning före TMRE-laddning. Förkortning: TMRE = tetrametylrhodamineylester. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Analys av mitokondriell densitet. (A) Illustration som representerar det Z-avstånd som rekommenderas för konfokal skanning av IMF-mitokondrier i skelettmuskelfibrer. (B) Serie av konfokala bilder av mitokondrier laddade med TMRE i skelettmuskelfibrer, erhållna från en tränad Zucker +/+-råtta (Lean) och från en överviktig Zucker fa/fa-råtta (Ob) inspelad på Z-avstånd (från 15 till 21 μm djup). Bilderna bearbetades genom trösklar och omvandlades till binära bilder. (C) Beräknad mitodensitet för de konfokala skivorna erhållna vid olika Z-avstånd observerade i panel B. (D) Den mitodensitet som erhålls från stapeln som består av de bilder som observerats i panel B. Bilderna i panel B är 65 x 50 μm. Skalstapel = 10 μm. Förkortningar: Mitodensitet = mitokondriell densitet; IMF = intermyofibrillära mitokondrier; ob = överviktig; SSM = subsarkolemmala mitokondrier. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Mitokondriell fördelningsanalys med FFT. Representativa konfokala bilder av mitokondrier laddade med den fluorescerande indikatorn TMRE tagna vid 21 μm av djupet av skelettmuskelfibrer erhållna från en tränad Zucker +/+ råtta (Lean, panel A) och från en överviktig Zucker fa/fa råtta (Ob, panel B). Bilderna bearbetades genom trösklar och omvandlades till binära bilder. Laterala och centrala ROI från panel A (panel C) och panel B (panel D) med sina respektive plottningsprofiler för fluorescensintensitet (övre plot) och FFT-spektrum (nedre plott). FFT beräknades utifrån ROI med 256 pixlars bredd, vilket motsvarar en ROI-storlek på 39 x 5 μm i panel A och en ROI-storlek på 50 x 5 μm i panel B. Panel E visar skillnaderna i FFT-spektrumet som finns mellan mitokondrier härledda från Lean- och Ob-råttor i den laterala ROI, medan panel F visar skillnaderna i FFT-spektrumet för central ROI. Skalstapel = 10 μm. Förkortningar: AU = godtyckliga enheter; FFT = snabb fouriertransform; ROI = regioner av intresse; Ob = Överviktig. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Reagens Slutlig koncentration i 100 ml Lager 
K-aspartat 100 mM
KCl 20 m²
HEPES 20 m²
L-glutaminsyra 3 m²
Äppelsyra 3 m²
EGTA 0,1 mM 10 mM
MgCl2 1 mM fritt Mg2+
CaCl2 0,00002 mM ledigt Ca2+
Fosfokreatin di-Na 5 mM 500 mM
Kreatinfosfokinas 5 U/ml 200 U/ml
MgATP 5 mM
pH 7,3 (med NaOH)

Tabell 1: Reagenser och koncentration av relaxlösning.

Tilläggsfigur S1: Effekt av bildförbehandlingsmetoder. A) Representativa konfokala bilder av mitokondrier laddade med den fluorescerande indikatorn TMRE tagna på ett djup av 18 μm i skelettmuskelfibrer erhållna från en tränad Zucker +/+-råtta (Lean, övre panelen) och från en fet Zucker fa/fa-råtta (nedre panelen), tillsammans med deras respektive bilder erhållna efter förbehandling med Otsu'-trösklar, medianfilter och Otsu'-trösklar, och 2D-dekonvolution och Otsu-trösklar. (B) Plottningsprofil för mitodensitet erhållen från konfokalbilderna (panel A) efter förbehandling med olika metoder. Bilderna i panel A är 65 x 50 μm. Skalstapel = 10 μm. Förkortningar: 2D-Decon = 2D-dekonvolution; Mitodensitet = Mitokondriell densitet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Mitokondrier är organeller med hög ombyggnadskapacitet. Deras innehåll, densitet och fördelning kan snabbt modifieras genom aktivering av mitokondriernas fusions- och fissionsmekanismer, känd som mitokondriell dynamik1, och balansen mellan de mitokondriella omsättningsmekanismerna: den mitokondriella biogenesen och den specialiserade mitokondriernas nedbrytningsväg, mitofagi21,22. Mitokondriellt innehåll och morfologi kan variera beroende på celltyp och utvecklingsstadium och kan omformas under olika fysiologiska och patologiska stimuli 17,22,23,24. Därför har studiet av mitokondriell morfologi varit relevant i över ett halvt sekel25. Noterbart är att analys av mitokondrier genom elektronmikroskopi har varit standardtekniken som tillämpats i flera studier26.

Fluorescerande studier med konfokalmikroskopi har fått relevans under de senaste åren på grund av deras kapacitet för avbildning av mitokondrier i levande celler på olika fiberdjup, vilket kan bidra till att bättre förstå mitokondriernas roll i skelettmuskulaturen vid olika adaptiva och maladaptiva förhållanden27. I denna studie beskrivs en metodik för analys av mitokondriernas täthet och fördelning i levande skelettmuskelfibrer med konfokalmikroskopi. En av de största utmaningarna med att arbeta med levande skelettmuskelfibrer är att undvika sammandragning från isoleringsprocesserna upp till den mitokondriella konfokala inspelningen. För att uppnå detta mål används en hög Mg- och ATP Relax-lösning17 för att hålla fibrerna avslappnade i minst 2 timmar, vilket ger tillräckligt med tid för att utföra fiberisoleringsprocessen, fluoroforbelastningen och insamlingen av mitokondriell signal genom konfokalmikroskopi. En kritisk punkt i protokollet är att erhålla fibrerna mekaniskt eftersom det kräver hög precision och färsk vävnad; Det är dock möjligt att erhålla livskraftiga fiberknippen från råttmuskler med denna tidigare använda och rapporterade teknik28. Att erhålla intakta fibrer gör det möjligt att bevara sarkolemma och den intracellulära miljön, vilket håller den metaboliska och funktionella överhörningen mellan cellstrukturer28,29.

Till skillnad från att arbeta med vävnader eller fasta celler, möjliggör insamling av fluorescerande bilder av levande celler genom konfokalmikroskopi realtidsövervakning av effekten av olika experimentella förhållanden. Det aktuella protokollet kan användas för att utforska förändringar i mitokondriell densitet och distribution i realtid och utforska skillnader mellan experimentella grupper, såsom de exempel som presenteras här mellan Lean- och Ob-härledda fibrer (Figur 3 och Figur 4). Det bör alltid beaktas att avbildning av levande celler innebär att man standardiserar optimala arbetsförhållanden med mindre cellskador. Arbetstiden, kvaliteten på de lösningar som används, insamlingsparametrarna och exponeringen av lasrar måste kontrolleras noggrant. Därför nämns viktiga överväganden nedan.

Mitokondrier i muskelfibrer kan inte registreras helt longitudinellt med konfokalmikroskopi på grund av fiberns storlek och den skada på fibern som kan orsakas av lång laserexponering. Icke desto mindre registreras ett representativt prov av fibern under denna teknik. Även om det är möjligt att registrera hela tjockleken på skelettmuskelfibern hos en råtta med konfokalmikroskopi, innebär detta en längre inspelningstid och exponering för laserstrålen. När det gäller kontrollråttor har inga problem med dessa inspelningar påträffats. Fibrer från patologiska tillstånd kan dock vara mer mottagliga för skador som observerats i fibrerna från Ob-råttor. Därför är det att föredra att skaffa en stapel med representativa konfokala bilder som tagits på olika Z-avstånd. När endast en sektion av fibertjockleken registreras, rekommenderas det att ta stacken på samma djup på alla testade fibrer eftersom mitokondriell fördelning och densitet kan variera beroende på dess position i fibern. Insamling av signalen på ett djup över 15 μm rekommenderas för att få representativa konfokalbilder av IMF och undvika SSM-populationer som ligger nära periferin.

Under konfokalförvärvet måste några viktiga överväganden beaktas. För det första, valet av nedsänkningsobjektivet med tanke på förstoringen, höga NA och nedsänkningsmediet. Eftersom cellerna hålls kvar i ett hydrofilt inkubationsmedium måste brytningsindexet för inkubations- och nedsänkningsmediet vara likartat för att få en bra signal och skanna djupt in i vävnaden. Uppnås vanligtvis med hjälp av en objektivlins med vattennedsänkning. Konfokala bilder av figur 3 och figur 4 togs med ett 20x, 0,7 NA, vattennedsänkningsmål. Detta objektiv gör det möjligt att registrera fibern i hela dess djup, men skanning vid 15, 18 och 21 μm bestämdes eftersom representativa konfokala bilder av IMF kan erhållas med signal med hög fluorescensintensitet och mindre fiberskador. Annan förstoring, såsom 40x och olja som nedsänkningsmedium, kan övervägas men behöver utvärderas.

För det andra beräknas pixelstorleken för bildtagning enligt Nyquists sats, vilket gör det möjligt att välja en lämplig pixelstorlek som undviker översampling (högre laserexponering) och undersampling (leder till mindre upplösning)30. Beräkningen beror på egenskaperna hos den valda objektivlinsen och våglängden (~90 nm). Den kan justeras med zoomen; Därför ger endast en zoominställning en optimal pixelstorlek30. Men i praktiken beror zoomen också på området på provet som ska analyseras. Att hitta balans gör det alltså möjligt att arbeta med en pixelstorlek som ligger närmast Nyquist-kriteriet och som också passar det område som ska analyseras. Figur 3 och figur 4 förvärvades med en pixelstorlek på 150 och 190 nm, vilket möjliggjorde analys av fiberns fulla bredd som är ~50-80 μm.

För det tredje bör en lämplig håldiameter som förhindrar oskarpt ljus från att nå detektorn användas. Vanligtvis anses 1 Airy vara den optimala nålhålsstorleken eftersom den tillåter detektion av ~80 % av fotonerna som kommer från fokusplanet30. Icke desto mindre kräver vissa färgade biologiska prover som visar låga fluorescensnivåer en nålhålsökning30. Konfokala bilder av figur 3 och figur 4 togs med en nålhålsstorlek på 3 Airy på grund av en låg signal som fångades med en lägre Airy. Det är viktigt att tänka på att ökningen av signalintensiteten till följd av en ökning av nålhålsstorleken leder till en minskning av upplösningen på grund av ökat oskarpt fångat ljus. Av denna anledning rekommenderar vi att du använder en nålhålsstorlek så nära 1 luftig som möjligt.

När de är tillräckligt insamlade kan konfokala bilder bearbetas för att få kvantitativ information om mitokondriell densitet och distribution. Oavsett vilket måste det kritiska bearbetningsbildsteget för tröskelvärde utföras före analys för att förbättra kvantifieringen av signalen. Under detta avgörande steg definieras fluorescensintensitetsvärdet som separerar de positiva pixlarna för mitokondrier från de i bakgrunden. Tröskelvärdet kan definieras av en gaussisk anpassning av toppen som representerar mitokondrier när bildens histogram visar två toppar, en som motsvarar bakgrunden och den andra mitokondrierna. En bimodal fördelning uppnås dock inte alltid i var och en av bilderna, så andra tröskelmetoder måste tillämpas.

I detta protokoll beskrivs implementeringen av Otsus tröskelvärde, som är en icke-parametrisk och oövervakad metod som är utformad för att hitta tröskelvärdet när de två topparna inte är separerade eller när andra toppar är närvarande31. Otsu kan enkelt appliceras med hjälp av en plattform med öppen källkod för biologisk bildanalys; Andra tröskelmetoder kan dock testas. Samma tröskelmetod måste tillämpas på alla konfokala bilder och måste beräknas separat för varje konfokal bild. Om du tillämpar tröskelvärdet på en hel stack leder det till felaktiga resultat. När de binära bilderna har erhållits efter tröskelprocessen kan analysen av mitokondriell densitet och FFT enkelt utföras genom att följa instruktionerna som beskrivs i detta protokoll. Försiktighet bör dock iakttas när man utför båda analyserna för att undvika att inkludera kärnor och kapillärer, eftersom det skulle leda till kvantifieringsfel. När det gäller densitet räcker det att subtrahera pixlarna, eller området som upptas av kärnorna eller kapillärerna, från pixlarna eller den totala arean som ska analyseras. Dessutom, när man utför FFT-analysen, måste det verifieras att mitokondriesignalen är rak. Omvänt, när mitokondriesignalen lutas, kan den producera profiler som inte representerar mitokondriernas longitudinella fördelning, vilket ger felaktiga FFT-spektrumdata. Dessutom kan ett förbehandlingssteg tillämpas för att minska bruset i bilderna. Det här protokollet beskriver två valfria förbearbetningssteg med hjälp av ett medianfilter och 2D-faltning. Effekterna av dessa förbehandlingsmetoder på bilden och mitokondriedensiteten presenteras i tilläggsfigur S1. Det är viktigt att tänka på att även om dessa förprocesser kan förbättra bildkvaliteten, kan de också leda till att vissa bilddetaljer går förlorade. Därför bör de användas med försiktighet och konsekvent tillämpas på alla bilder som analyseras.

Trots sina fördelar begränsas konfokalmikroskopi av en lateral upplösning (XY) på 180-250 nm när de optimala förutsättningarna för insamling är implementerade32. Mitokondriell diameter är ~200-700 nm, nära diffraktionsgränsen för konfokalmikroskopi; Således kan submitokondriella strukturer inte detekteras på ett adekvat sätt33 och kan inte utvärderas genom densitets- och FFT-analyser som visas i detta protokoll. Andra superupplösningstekniker för mikroskopi, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), nanoskopi med stimulerad emissionsutarmning (STED) eller strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), kan utforskas för att lösa upp submitokondriella strukturer32. I detta protokoll erhålls de konfokala bilderna av mitokondrier med hjälp av fluoroforen TMRE, som beror på mitokondriemembranpotentialen. Därför kan mitokondriell fluorescerande intensitet variera beroende på deras membranpotential. En tröskelprocess utförs före dataanalysen för att lösa det här problemet. Alla pixlar över ett definierat tröskelvärde anses vara positiva för mitokondriell signal oberoende av deras fluorescensvärde. Det måste dock noteras att mitokondrier med mycket låg membranpotential inte kan lösas med denna teknik. Kompletterande studier av kvantifiering av mitokondriellt proteininnehåll rekommenderas därför. En fördel med att använda TMRE är att konfokala bilder också kan användas för analys av mitokondriemembranpotential, men adekvata kontroller med frånkopplingsmedel måste utföras såsom karbonylcyanid-p-trifluormetoxifenylhydrazon (FCCP). Dessutom kan instruktionerna för mitokondriell densitets- och distributionsanalys uppnås med hjälp av gröna fluorescerande indikatorer för mitokondrier, som belastar mitokondrier oavsett deras membranpotential, men inkubationsstrategi och konfokala insamlingsinställningar måste standardiseras.

Med tanke på att mitokondriernas struktur är relaterad till viktiga mitokondriella och cellulära funktioner, kan protokollet som beskrivs här ge värdefull information om deras ombyggnad under sjukdom eller genom en särskild stressförolämpning. Det kan bidra till en bättre förståelse av nyckelfunktioner i skelettmuskulaturen som styrs av mitokondrier, såsom energiproduktion, eller där mitokondrier spelar en viktig roll i interaktionen med andra organeller, såsom kontraktion-metabolismkoppling. Att följa protokollinstruktionerna gör det möjligt att uppskatta mitokondriell densitet och fördelning i levande skelettmuskulatur. Protokollstegen är indelade i tre huvudsteg med fokus på dissektion av skelettmuskulaturen, konfokalmikroskopi och bildanalys, där detaljerade instruktioner och viktiga överväganden ingår. Noterbart är att protokollet kan optimeras ytterligare för att utforska ytterligare Z-steg för fullständig mitokondriell rekonstruktion i fibern enligt användarens behov. Till exempel kan de konfokala bild- och analysstegen testas för att studera cellulära strukturer med liknande fördelning, såsom TT i levande och fasta prover.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte föreligger några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av School of Medicine och Institute for Obesity Research vid Tecnologico de Monterrey. Figur 3A skapades med hjälp av programvaran Scientific Image and Illustration.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A6419
Borosilicate glass coverslip Warner Instruments 64-0709
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670
Confocal microscope Leica TCS SP5
Confocal microscope software Leica Application Suite  Leica 2.7.3.9723
Creatine Phosphokinase Sigma-Aldrich C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate Sigma-Aldrich 11240
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Forceps Miltex MH-18
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective  Leica 506517
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iris scissors Miltex 5-304
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
Maxchelator UC Davis Health https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm 
Micro scissors Miltex 18-1633
Open-source platform for biological-image analysis Fiji  Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji https://fiji.sc/
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
PSF Generator (PSF_Generator.jar) Biomedical Imaging Group, EPFL http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ 
Recording chamber Warner Instruments RC-27N
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Spreadsheet Microsoft Excel Microsoft 
Stereo microscope Zeiss Stemi 508
Tetramethylrhodamine, ethyl ester Invitrogen T669

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
  2. De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. Skeletal muscle mitochondria in health and disease. Cell Calcium. 94, 102357 (2021).
  3. Chang, C. R., Blackstone, C. Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1. Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).
  4. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305 (2021).
  5. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role. Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).
  6. Díaz-Vegas, A. R., et al. Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism. Frontiers in Physiology. 9, 791 (2018).
  7. Boncompagni, S., et al. Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures. Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).
  8. Reggiani, C., Marcucci, L. A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers. The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167 (2022).
  9. Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).
  10. Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skeletal Muscle. 1 (1), 26 (2011).
  11. Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).
  12. Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes. Life Sciences. 264, 118700 (2021).
  13. Song, L. S., et al. Orphaned ryanodine receptors in the failing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).
  14. Houzelle, A., et al. Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity. Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).
  15. Call, J. A., et al. Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).
  16. Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging. Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).
  17. Rivera-Alvarez, I., et al. A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers. Life Sciences. 256, 117965 (2020).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).
  19. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  20. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  21. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  22. Meinild, L. A. -K., et al. Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis. Acta Physiologica. 222 (1), (2018).
  23. Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. Exercise and mitochondrial health. Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).
  24. Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases. Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).
  25. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  26. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  27. Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization. Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).
  28. Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
  29. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles. International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252 (2022).
  30. Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer, Boston, MA. (2006).
  31. Otsu, N. A. Threshold selection method from gray-level histogram. IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  32. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  33. Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. Light microscopy of mitochondria at the nanoscale. Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).

Tags

Biologi utgåva 202
Analys av mitokondriell densitet och longitudinell fördelning i levande skelettmuskelfibrer hos råtta med konfokalmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pérez-Treviño, P.,… More

Pérez-Treviño, P., Nieblas, B., López-Vaquera, S. R., García, N. Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65306, doi:10.3791/65306 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter