Summary
आण्विक शटल functionalized सतह पालन kinesin मोटर प्रोटीन nanoscale एक परिवहन प्रणाली के रूप में सेवा कर सकते हैं पर ग्लाइडिंग सूक्ष्मनलिकाएं से मिलकर. यहाँ एक ठेठ शटल प्रणाली की विधानसभा में वर्णित है.
Abstract
कक्ष परिष्कृत आणविक मशीनरी विकसित किया है, जैसे kinesin मोटर प्रोटीन और microtubule filaments के लिए माल की सक्रिय intracellular परिवहन का समर्थन. जबकि kinesins पूंछ डोमेन कार्गो की एक किस्म के लिए बांधता है, kinesins सिर डोमेन रासायनिक एटीपी अणुओं में संग्रहीत करने के लिए microtubule जाली साथ कदम ऊर्जा का उपयोग. लंबे, कठोर सूक्ष्मनलिकाएं लंबी दूरी intracellular परिवहन के लिए पटरियों के रूप में में सेवा करते हैं.
ये मोटर्स और filaments microfabricated कृत्रिम वातावरण में भी आणविक एक शटल के घटक के रूप में नियोजित किया जा सकता है . एक बार इस्तेमाल किया डिजाइन में, kinesin मोटर्स उनके पूंछ के माध्यम से ट्रैक की सतह के लिए anchored रहे हैं, और functionalized सूक्ष्मनलिकाएं माल ले जाने के तत्वों, जो इन मोटर्स द्वारा चालित हैं के रूप में सेवा करते हैं. इन शटल बायोटिन और streptavidin के बीच मजबूत और चयनात्मक बंधन का उपयोग करके माल के साथ लोड किया जा सकता है. प्रमुख घटक (biotinylated ट्यूबिलिन, streptavidin और biotinylated कार्गो) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
क्लासिक उल्टे गतिशीलता परख 2 पर बिल्डिंग, आणविक शटल के निर्माण यहाँ विस्तृत है. Kinesin मोटर प्रोटीन कैसिइन के साथ Precoated सतह adsorbed, सूक्ष्मनलिकाएं biotinylated ट्यूबिलिन से polymerized हैं, kinesin के लिए पालन और बाद में rhodamine लेबल streptavidin के साथ लेपित हैं. 3 माल लदान के लिए एक microtubule ग्लाइडिंग इष्टतम वेग प्राप्त करने के एटीपी एकाग्रता subsaturating एकाग्रता पर बनाए रखा है. अंत में biotinylated, fluorescein लेबल nanospheres माल के रूप में जोड़ रहे हैं. Nanospheres ग्लाइडिंग सूक्ष्मनलिकाएं और nanospheres सतह का पालन करने के बीच collisions का एक परिणाम के के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं को देते हैं.
प्रोटोकॉल करने के लिए आसानी से किया जा biotinylated डीएनए 4, क्वांटम 5 डॉट्स या biotinylated 4-6 एंटीबॉडी के माध्यम से प्रतिजनों की एक विस्तृत विविधता जैसे कार्गो की एक किस्म को लोड करने के लिए संशोधित कर सकते हैं.
Protocol
1.) Buffers और अभिकर्मकों
ये समाधान अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए और सुविधा आकार aliquots में संग्रहीत. एक विभाज्य एक विशिष्ट प्रयोग है और एक ताजा विभाज्य प्रत्येक गतिशीलता परख के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए के लिए पर्याप्त समाधान होना चाहिए. भंडारण की स्थिति और ठेठ विभाज्य आकार भी निम्नलिखित प्रोटोकॉल में उल्लेख कर रहे हैं.
1. BRB80 बफर, (80 मिमी पाइप, 1 मिमी 2 MgCl, विआयनीकृत आसुत में 1 मिमी EGTA (dd) पानी, पीएच को समायोजित KOH द्वारा 6.9)
- Dd पानी में 100 एमएल 0.5 एम EGTA के शेयर समाधान करें. पीएच 7.0 2 एम NaOH समाधान का उपयोग कर समायोजित करें.
- Dd पानी में 100 एमएल एम 1 2 MgCl के शेयर समाधान करें. समाधान आटोक्लेव.
- पाइप और dd पानी के लगभग 800 एमएल में 3.1 छ KOH छर्रों के 24.2 छ जोड़ें और हलचल को भंग. पीएच 6.9 1 एम KOH समाधान का उपयोग कर समायोजित करें. 0.5 एम EGTA शेयर समाधान और 1 एम MgCl 2 शेयर समाधान के 1 एमएल के 2 एमएल जोड़ें. Dd पानी के साथ मात्रा 1000 एमएल के लिए ले आओ.
- 50 एमएल बाज़ ट्यूब और भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर में विभाज्य. BRB80 ट्यूब वर्तमान में इस्तेमाल किया जा रहा है 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
2. मैग्नेशियम क्लोराइड, 2 MgCl (dd पानी में 100 मिमी)
- Dd पानी में पतला करने के लिए 100 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए.
- 0.5 एमएल microcentrifuge -20 डिग्री सेल्सियस पर और ट्यूबों की दुकान में भविष्य में उपयोग के लिए विभाज्य (10 μL मात्रा)
3. ग्वानोसिन 5'-triphosphate, disodium नमक, GTP (dd पानी, पीएच में 25 मिमी के लिए समायोजित NaOH द्वारा 7)
- बाहर वजन और dd पानी में भंग और 7 करने के लिए 2 एम NaOH समाधान द्वारा पीएच को समायोजित.
- एकाग्रता 260 एनएम यूवी absorbance को मापने के द्वारा सत्यापित करें. (11.7 x 103 एम -1 -1 सेमी के विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करें ).
- 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान में विभाज्य (10 μL मात्रा).
4. डाइमिथाइल sulfoxide, DMSO
- 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान में विभाज्य (10 μL मात्रा).
5. Taxol (DMSO में 1 मिमी)
- बाहर वजन और धूआं हुड के नीचे DMSO में भंग करने के लिए 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने.
- 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान में विभाज्य (20 μL मात्रा).
6. डी (+) ग्लूकोज, (2 एम dd पानी में)
- बाहर वजन और dd पानी में भंग 2 एम. के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने
- 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान में विभाज्य (20 μL मात्रा).
7. ग्लूकोज oxidase, (2 मिलीग्राम / एमएल BRB80 में)
- BRB80 में भंग 2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने.
- 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान में विभाज्य (20 μL मात्रा).
8. Dithiothreitol डीटीटी, (1 dd पानी में एम)
- धूआं हुड के तहत dd पानी में भंग करने के लिए 1 एम. के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने
- 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान में विभाज्य (20 μL मात्रा).
9. Catalase (0.8 मिलीग्राम / एमएल BRB80 में)
- कम से कम 2 चरणों में BRB80 में भंग 0.8 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने. 276 एनएम और 406 एनएम (3.1 x 10 5 276 एनएम एम -1 -1 सेमी और 2.2 x 10 5 एम -1 -1 406 एनएम पर सेमी का एक विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करें यूवी absorbance को मापने के द्वारा प्रत्येक चरण में एकाग्रता का निर्धारण और समीकरण एक = सी.एल.).
- 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान में विभाज्य (20 μL मात्रा).
10. Adenosine - 5'-triphosphate एटीपी (100mm MgCl 2 में 100 मिमी)
- Dd पानी में 100 मिमी 2 MgCl के एक शेयर समाधान तैयार करें. शुष्क पाउडर वजन और 100mm के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए इस शेयर समाधान में भंग करने के लिए.
- एकाग्रता 260 एनएम यूवी absorbance को मापने के द्वारा सत्यापित करें. (15.4 x 10 3 एम -1 -1 सेमी के विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करें ).
- 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान में विभाज्य (20 μL मात्रा).
11. कैसिइन समाधान (20 मिलीग्राम / एमएल कैसिइन BRB80 में)
- एक 50 एमएल बाज़ ट्यूब में 30 एमएल dd पानी के लिए लगभग 3 जी कैसिइन जोड़ें. लगभग 1 घंटे के लिए भंवर समाधान जब तक मोटी स्थिरता विकसित करता है.
- 30 मिनट के लिए लगभग 15000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र. सुक्ष्ममापी 0.5 और 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर.
- 280 एनएम (एमएल 0.67 मिलीग्राम -1 -1 सेमी के विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करें) में यूवी absorbance को मापने के द्वारा सतह पर तैरनेवाला की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. यह 20 मिलीग्राम / BRB80 में एमएल पतला.
- विभाज्य में (20 μL मात्रा)0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों और -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए दुकान के लिए.
2) मानक समाधान
ये प्रयोग के दिन पर तैयार कर रहे हैं और बाद प्रयोग खत्म हो गया है त्याग किया जाना चाहिए. प्रत्येक के 1 एमएल तैयार करें.
1. BRB80CS0.5
- कैसिइन BRB80 में 0.5 मिलीग्राम / एमएल बर्फ और दुकान के अंतिम एकाग्रता समाधान पतला. यह समाधान प्रवाह पहले kinesin के लिए सेल में शुरू की है और सतह सोखना के बाद kinesin गतिविधि को बनाए रखने में मदद करता है.
2. BRB80CA
- BRB80 और बर्फ से अधिक की दुकान में 0.2 मिलीग्राम / एमएल कैसिइन और 1 मिमी एटीपी तैयार करें. Kinesin आगे प्रवाह कक्ष में शुरूआत से पहले इस समाधान का उपयोग कर पतला है.
3. BRB80T
- BRB80 में कमरे के तापमान पर 10 सुक्ष्ममापी और दुकान के अंतिम एकाग्रता taxol समाधान पतला. इस समाधान के लिए सूक्ष्मनलिकाएं को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
4. BRB80CT
- 10 सुक्ष्ममापी taxol और 0.2 मिलीग्राम / एमएल BRB80 में कैसिइन और कमरे के तापमान पर दुकान तैयार करें. यह antifade और microtubule समाधान करने के लिए आगे तैयार किया है.
5. BRB80AF
- 20 मिमी डी - ग्लूकोज, 20 ग्लूकोज μg / एमएल oxidase, 8 μg / एमएल catalase, 10 मिमी डीटीटी, और BRB80CT में 20 सुक्ष्ममापी एटीपी और कमरे के तापमान पर दुकान तैयार करें. यह समाधान streptavidin और nanospheres पतला करने के लिए प्रयोग किया जाता है और "बाहर धोने" प्रवाह कक्ष में अतिरिक्त streptavidin. kinesin गति इस समाधान में एटीपी एकाग्रता का समायोजन करके नियंत्रित किया जा सकता है.
3) kinesin तैयारी
- एक्सप्रेस kinesin जंगली प्रकार, पूर्ण लंबाई ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर kinesin भारी चेन और एक Escherichia कोलाई में उनका टैग - सी टर्मिनल के मिलकर निर्माण और एक नी-NTA स्तंभ के रूप में 6 में वर्णित का उपयोग कर शुद्ध.
- 0.5 एमएल microcentrifuge -80 और ट्यूबों की दुकान में aliquots (10 μL प्रत्येक) डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए. इन aliquots में सक्रिय kinesin की एकाग्रता लगभग 200 एनएम है 7.
- एक विशिष्ट प्रयोग के लिए, kinesin समाधान BRB80CA में 20 गुना पतला. लेबल समाधान और बर्फ पर KIN20 दुकान.
4) microtubule तैयारी
- एक 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में वृद्धि समाधान के 25 μL तैयार: 4 मिमी BRB80 बफर में 2 MgCl, 1 मिमी GTP और 5% DMSO (v / v).
- Lyophilized biotinylated ट्यूबिलिन के 20 μg विभाज्य करने के लिए इस समाधान के 6.25 μL जोड़ें.
- भंवर, तो 37 में एक गर्मी स्नान में जगह ° सी के लिए 30 मिनट polymerize. BRB80T और भंवर में 100 गुना धीरे पतला. लेबल समाधान और कमरे के तापमान पर MT100 दुकान.
- BRB80AF में MT100 के एक 10 गुना कमजोर पड़ने बनाओ. लेबल समाधान MT1000.
5) streptavidin और Nanosphere समाधान
BRB80AF में 100 एनएम के एक एकाग्रता में AlexaFluor568 - लेबल streptavidin तैयार करें. यह STV100 और बर्फ से अधिक की दुकान लेबल. इसी तरह, BRB80AF समाधान में nanospheres 5000 गुना पतला है. NS5000 यह दुकान और बर्फ से अधिक लेबल.
6.) फ्लो सेल निर्माण
एक flowcell का उपयोग कर दो गिलास डबल पक्षीय टेप से अलग coverslips निर्माण. यह प्रवाह लगभग 2 सेमी लंबा, 1 सेमी चौड़ा और 100 सुक्ष्ममापी उच्च सेल है, और लगभग 20 μL की एक मात्रा है. समाधान प्रवाह कक्ष के एक तरफ से एक विंदुक और दूसरे से दुष्ट बाहर फिल्टर पेपर का उपयोग कर का उपयोग में पेश कर रहे हैं.
7.) उल्टे परख सभा
ग्लास सतह पहले कैसिइन के साथ लेपित है, जो kinesin सोखना पर अपनी कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है. बाद kinesin adsorbed है, सूक्ष्मनलिकाएं शुरू कर रहे हैं, जो kinesin द्वारा आयोजित कर रहे हैं. सूक्ष्मनलिकाएं तो फ्लोरोसेंट streptavidin के साथ लेपित हैं. अतिरिक्त streptavidin धोने के बाद, biotinylated polystyrene fluorescein nanospheres (40 एनएम व्यास) शुरू कर रहे हैं. भूतल adsorbed स्थिर nanospheres चलती सूक्ष्मनलिकाएं के साथ टकराने और उन्हें (चित्रा 1) पर लादा.
समाधान और समय अगले समाधान की शुरूआत से पहले अनुमति के प्रवाह के क्रम में नीचे सूचीबद्ध हैं.
- BRB80CS0.5, 5 मिनट
- KIN20, 5 मिनट
- MT1000, 5 मिनट
- STV100, 5 मिनट
- BRB80AF, 3x
- NS5000
8). माइक्रोस्कोपी
खुर्दबीन मंच पर nanosphere परिचय के तुरंत बाद प्रवाह सेल माउंट. इस प्रयोग में, एक ग्रहण TE2000 यू प्रतिदीप्ति खुर्दबीन (Nikon, मेलविल, NY) एक 100X तेल (1.45 एनए) उद्देश्य, एक एक्स 120 (EXFO, ओंटारियो, कनाडा) दीपक और एक iXon EMCCD (कैमरा Andor का हवाला देते हैं, के साथ सुसज्जित दक्षिण विंडसर, सीटी) का इस्तेमाल किया गया था. एक FITC फिल्टर (# 48,001) क्यूब और एक TRITC फिल्टर क्यूब (# 48,002, Chroma टेक्नोलॉजीज, Rockingham, VT) छवि nanospheres और सूक्ष्मनलिकाएं respecti के लिए इस्तेमाल किया गयाvely प्रवाह कोशिकाओं के नीचे सतह पर. जोखिम समय 0.2s था, जबकि जोखिम के बीच समय एस 2
चित्रा 1. आणविक शटल के योजनाबद्ध ड्राइंग.
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Discussion
मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक किया गया है समूहों की एक किस्म के द्वारा इस्तेमाल किया kinesin microtubule आधारित गतिशीलता assays इकट्ठा. अंतिम गतिशीलता समाधान में 10 मिमी डीटीटी 0.5% β-mercaptoethanol के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. मानक (BRB80AF, KIN20 और MT1000) समाधान से अधिक 2 घंटे पुराना नहीं किया जाना चाहिए. बर्फ पर कोई taxol और विशेष रूप से सूक्ष्मनलिकाएं युक्त समाधान कभी नहीं रखा जाना चाहिए. प्रवाह सेल के अत्यधिक कार्यात्मक घटकों को photodamage में यूवी उत्तेजना प्रकाश परिणामों के लिए जोखिम: सूक्ष्मनलिकाएं और kinesin 8 यह भी अधिक स्पष्ट प्रभाव है अगर प्रवाह सेल polystyrene nanospheres के रूप में उच्च ऑक्सीजन diffusivity के साथ पॉलिमर शामिल हैं 9.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम भारी Jonathon हावर्ड, जिसका समूह एक ग्लाइडिंग गतिशीलता परख जो बाद में हमारे द्वारा रूपांतरित किया गया के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए ऋणी हैं. NSF अनुदान DMR0645023 से वित्तीय सहायता आभार स्वीकार किया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| Biotin tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
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