Summary
هنا نستخدم مكتبة esiRNA الإنسان في شاشة عالية الإنتاجية للجينات لها دور في انقسام الخلايا. نحن لشرح كيفية إعداد وإجراء شاشات esiRNA ، فضلا عن كيفية تحليل والتحقق من صحة النتائج.
Abstract
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هي الآلية الأساسية الخلوية للتحكم في التعبير الجيني. هي التي يسببها رني الرنا المزدوج تقطعت بهم السبل قصيرة الصغيرة التي تعرف أيضا باسم الرناوات التدخل (siRNAs). على المدى القصير المزدوج تقطعت بهم السبل الرناوات تنشأ من السلائف مزدوجة يعد تقطعت بهم السبل نتيجة نشاط المقامر ، وهو بروتين من عائلة الثالث من ريبونوكلياز endonucleases. الشظايا الناتجة مكونات الحمض النووي الريبي إسكات المعقدة التي يسببها (RISC) وتوجيهه إلى الهدف مرنا وما شابه ذلك. RISC يشق على مرنا الهدف مما يقلل من التعبير عن بروتين ترميز 1،2،3. وقد أصبح وسيلة قوية رني وتستخدم على نطاق واسع تجريبية لفقدان دراسات وظائف الجينات في خلايا الثدييات الصغيرة الاستفادة الرناوات التدخل.
حاليا اثنين من الطرق الرئيسية تتوفر لإنتاج صغيرة الرناوات التدخل. أسلوب واحد يتضمن التركيب الكيميائي ، في حين أن أسلوب بديل توظف الانقسام endonucleolytic محددة الهدف الرنا المزدوج تقطعت بهم السبل منذ فترة طويلة الثالث ريبونوكلياز في المختبر. وبذلك ، يتم إنتاج مجموعة متنوعة من سيرنا مثل [أليغنوكليوتيد] الذي يعرف أيضا باسم endoribonuclease المعدة أو esiRNA سيرنا. مقارنة بين فعالية siRNAs كيمائيه وesiRNAs يظهر أن كلا من مشغلات هي كامنة في إسكات الجينات المستهدفة. ويمكن أن الاختلافات ينبغي ألا ينظر إليه عند مقارنة التحديد. العديد من واحدة تنتج كيميائيا توليفها siRNAs بارزة خارج الهدف آثار ، في حين أن مزيج معقد المتأصلة في esiRNAs يؤدي الى ضربة قاضية أكثر تحديدا 10.
في هذه الدراسة ، فإننا نقدم تصميم الجينوم النطاق المكتبات esiRNA بعثة واستخدامه لفحص رني التي تجسدت شاشة محتوى الحمض النووي لتحديد الجينات المسؤولة عن تقدم دورة الخلية. نعرض كيفية تحسين بروتوكول ترنسفكأيشن والفحص لفرز في إنتاجية عالية. أيضا كيف نبرهن على مجموعات كبيرة من البيانات يمكن تقييمها إحصائيا والحاضر وسائل للتحقق من صحة يضرب الابتدائي. أخيرا ، يمكن أن نعطي نقطة انطلاق لمزيد من التوصيفات الوظيفية الزيارات التحقق من صحتها.
Protocol
1. عالية الجودة المكتبات بعثة esiRNA
- من أجل كل الجينات في المصالح يتم اختيار المنطقة المستهدفة والأكثر عرضة محددة لاستخدام خوارزمية رني DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4 درجات DEQOR إمكانية إسكات جميع ممكن siRNAs 21 النيوكليوتيدات طويلة في مرنا المستهدفة استنادا للدولة من ال 4 فن التصميم والقيود. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحليل كل احتمال ممكن سيرنا التفاعل المتبادل مع جينات أخرى قبل تنفيذ عملية بحث BLAST ضد transcriptome للكائن دراستها. ويوفر البرنامج بذلك تحليلا للجودة الشاملة وعبر إسكات قدرات esiRNA المحتملة (300-600 غليان طول).
- يتم تضخيمه في المنطقة المختارة من الجينات المستهدفة من قبل [كدنا] PCR باستخدام جينات محددة الاشعال يحيط بها سلاسل الحمض النووي الريبي ، بوليميريز - عاثية المروج.
- يتم التحقق من كل منتج PCR المستخدمة لإنتاج esiRNA بعثة للهوية من خلال تسلسل والنقاء من خلال تحليل Labchip الفرجار.
- هو كتب طويلة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي من PCR المنتجات التي بوليميريز الحمض النووي الريبي ، يعقبه الصلب من فروع كتب.
- مستعدون esiRNAs بواسطة الهضم الأنزيمي محدود من الحمض النووي الريبي مزدوج الخيط الطويل باستخدام RNaseIII تليها تنقية عبر أنيون تبادل اللوني باستخدام أعمدة الدوران Q - sepharose.
- وعجلت esiRNAs ومعلق في TE العازلة. ويتم قياس العائد من خلال امتصاص الأشعة فوق البنفسجية القياسات ويتم ضبط التركيز عن طريق إذابة في حجم مناسب لTE العازلة. يتم فحص الجودة الشاملة للمنتج النهائي عن طريق تحليل Labchip الفرجار.
2. اختيار خط الخلية وتعظيم ترنسفكأيشن للفحص
- عاير كميات من esiRNA (استخدام Eg5 بأنها إيجابية وrenilla - luciferase والسيطرة السلبية) وزيادة كميات من كاشف ترنسفكأيشن في صفيحة 384 أيضا ، إضافة الخلايا واحتضان لمدة 48 ساعة. Eg5 هو بروتين kinesin المحركات المطلوبة لتجميع القطبين المغزل واستنزاف تؤدي إلى اعتقال الإنقسامية. كرر هذا الإجراء لالكواشف ترنسفكأيشن مختلفة وخطوط الخلية. هنا ، فإننا نستخدم خلايا هيلا مثقف وفقا للإجراءات العادية oligofectamine (Invitrogen) وكاشف ترنسفكأيشن.
- لاختيار الظروف المثلى ترنسفكأيشن عدد الخلايا transfected مع Eg5 esiRNAs التي تظهر اعتقال الإنقسامية (شكل دائري) ، والعدد الكلي للخلايا transfected مع esiRNA (RLUC) renilla - luciferase بواسطة المجهر الضوئي. اختيار الشرط مع أقل سمية للRLUC النمط الظاهري وأكثر وضوحا لEg5.
طريقة بديلة لتحسين ظروف ترنسفكأيشن ينطوي على خط معربا عن الخلية مستقرة EGFP (أو الجين مراسل مناسبة أخرى) تحت سيطرة المروج نشط التأسيسية. بعد ترنسفكأيشن لesiRNA ضد EGFP (أو الجين مراسل آخر) وRLUC (أو مناسبة أخرى esiRNA السيطرة السلبية) قياس تدق إلى أسفل فعالية وسمية التي مضان مثل الفرز بمساعدة خلية (FACS). تأكد من أن تستخدم لesiRNA EGFP مكملة تماما لمرنا المستهدفة.
3. إعداد الشاشة الابتدائية 5،6
- تحسين دقة pipetting لجميع المكونات المستخدمة في محطة pipetting الآلي (مثل الدلو ، وTecan WellMate ، مصفوفة). لأن المعلمات pipetting تتغير اعتمادا على نوع من الحل نوع وحجم وطبق هذا التحسين أن تتكرر في كل خطوة على حدة. إذا كان ذلك ممكنا ، ينبغي أن توضع في محطة pipetting تحت غطاء تدفق الصفحي لتجنب التلوث. يجب تطهير جميع المكونات المستخدمة قبل استخدام إما عن طريق التعقيم إذا أمكن ، أو عن طريق الرش مع الايثانول 75 ٪. تحسين غسل بروتوكولات بحيث عبر تلوث من بئر إلى بئر استبعادها. يمكن تفاصيل عن الاستفادة المثلى من pipetting الآلي لا يمكن إعطاء لقيود في الفضاء ، وتعتمد بشكل كبير على محطة pipetting المستخدمة. لمزيد من المعلومات تشير إلى المصنوعات البروتوكول.
- Transfect الخلايا في شكل جيد باستخدام 384 الأمثل من الشروط المذكورة أعلاه مع esiRNAs لEg5 وRLUC. استخدام نمط بالتناوب لEg5 esiRNA RLUC وتغطي لوحة كاملة.
- بعد حضانة لمدة 48 ساعة إصلاح الخلايا مع البرد الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، في برنامج تلفزيوني ترطيب لمدة 15 دقيقة ، وصمة عار لمدة 25 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميكروغرام / مل ودابي ميكروغرام / 100 مل ريبونوكلياز A (Qiagen). يغسل أخيرا مع برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- قياس كثافة دابي ومضان على سبيل المثال عن طريق الفحص المجهري على نظام ScanR أوليمبوس. إنشاء رسم بياني عن طريق التآمر ضد دابي كثافة عدد الخلايا وتقييم توزيع دورة الخلية عن طريق حساب نسبة الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي 2N المحتوى للمرحلة - G1 ، <2N> 4N ل S - المرحلة ؛ 4N لوG2/M-phase > 4N لعدم توازن الصبغيات / تعدد الصيغ الصبغية.
- تقييم تجانس النتائج على لوحة. هناك حاجة إلى مزيد من التحسين إذا النتائج تختلف اختلافا كبيرا لاستبعاد موقف EFFEسنت. مشكلة شائعة عند استخدام لوحات متعددة جيدا هو التبخر المعززة على حافة الآبار خلال فترة الحضانة. هذا يؤدي إلى ظروف تجريبية مختلفة في الآبار المختلفة ، والتي غالبا ما يترجم إلى لوحة - موقف آثار محددة. لهذا السبب ، فإننا ننصح لمغادرة جميع الآبار فارغة لحافة الشاشة. لمزيد من تقليل التبخر تأكد من أن يتم الاحتفاظ الحاضنات في الرطوبة العالية. علينا أيضا أن توظف بشكل روتيني الحواجز تبخر مثل الشريط ختم تنفس كورنينج التي تمنع التبخر. الموارد الأخرى أيضا لتأثيرات الموقف يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار ، مثل الاختلاف التقنية لنظام قراءات (المجهر ، لوحة القارئ ، الخ) أو الاختلافات في التعامل مع السائل (التدرجات ، التجانس من الحلول ، الخ).
- وفروق ذات دلالة إحصائية بين الضوابط الإيجابية والسلبية مقياسا لأهمية الفحص المستخدمة. هناك فرق كبير بين مراقبة سلبية (أو الضوضاء الخلفية ، للسيطرة وهمية) ، ونموذج يجب أن تكون وضعت قبل بدء الفرز الفعلي. مقياس جيد للدلالة إحصائية هو Z - عامل. يحسب Z عامل المعادلة التالية :
Z = 1 -- (3 SD [نموذج] + 3 SD [وهمية] (*) | شارع [نموذج] -- شارع [وهمية] |) -1 ؛ مع SD : الانحراف المعياري ؛ شارع : متوسط. A - Z عامل 1> Z> 0.5 يشير إلى وجود انفصال ذات دلالة إحصائية للضوابط السلبية (والضجيج) من الضوابط الإيجابية 7.
4. الشاشة الرئيسية
- إعداد 384 جيدا لوحات لزراعة الأنسجة ترنسفكأيشن esiRNAs من الاستفادة الأمثل من الشروط المذكورة أعلاه. هنا ، فإننا نستخدم esiRNA 15ng لكل بئر الذائبة في TE 5μl العازلة. يجب أن يتم تحميل مواقع السيطرة ثمانية على الاقل في لوحة التحكم مع مناسبة الإيجابية والسلبية لعملية بيولوجية درس (هنا : Eg5 وRLUC). لتجنب الآثار موقف يتم تحميلها على حافة الآبار مع العازلة TE 5μl فقط.
- إضافة 5μl OptiMEM (Invitrogen) التي تحتوي على Oligofectamine 0.2μl لكل بئر ، ومزيج احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة تعليق على الخلية الخليط ترنسفكأيشن (هنا : 40μl لتعليق الخلية هيلا في 25 خلية / ميكرولتر تركيز ؛ أي ما يعادل 1000 في الخلايا أيضا) ، واحتضان لمدة 72 ساعة.
- قياس الحمض النووي المحتوى على المجهر الآلي (أوليمبوس ScanR ، راجع أعلاه). تقييم باستخدام Z - إحصاءات لاختيار درجة ضرب : Z - تحسب لجميع الدرجات esiRNAs العينة باستخدام إشارة سلبية للتحكم كمرجع. علما ، و- Z النتيجة ليست هي نفسها كما Z - عامل. Z - عشرات توفير قدر الإحصائية لأهمية القيم في عينة المقارنة لتحكم (وهمية). يتم احتسابها بعد المعادلة :
Z = (القيمة [مثال] -- متوسط [وهمية]) * المعايير الانحراف [صورية] -1.
لاختيار بلغت عتبة لابد من تطبيقها. عادة ، وهي معايير الأهمية مثل : 2 <Z يستخدم <-2 ، ولكن تبعا لنوعية ورقة العمل ، ودرس عملية بيولوجية أو ببساطة نطاق الشاشة ، وعتبات مختلفة قد تكون قابلة للتطبيق. يمكن بجانب الإحصاءات Z - درجة السهل أن تستخدم أيضا أساليب تقييم أكثر تفصيلا الرياضية (يمكن العثور في الداخل لأول مرة في مجال تقييم واسعة من البيانات الإحصائية للتحري آخرون مالو 8).
5. الشاشة الثانوية والتحقق ضرب
- شاشة ثانوية يلي الشاشة الرئيسية للقضاء على ايجابيات كاذبة بسبب أخطاء تجريبية أو تأثيرات خارج الهدف. وينبغي ليضرب مختارة تتكرر نفس الإجراءات المستخدمة في الشاشة الرئيسية لأكبر عدد من نسخ مكررة (3-5) للسماح لأفضل تقييم الإحصائية.
- وينبغي التحقق منها لتوجيه ضربات يمكن استخدام esiRNA الثانوية غير متداخلة (أو إسكات آخر الزناد غير المتداخلة) ضد الأهداف المحددة في الشاشات الأولية. ينبغي تطبيق نفس مقايسة وتلا ، كما على الشاشة الرئيسية.
- ويمكن في نهاية المطاف يمكن التحقق من صحة هذه الجينات التي اختارتها الانقاذ رني عبر الأنواع 9. وبالتالي هو transfected ستابلي البكتيرية الصبغي الاصطناعي (BAC) الترميز مثل الماوس ortholog من الجينات في الخلايا. BAC - ثوابت الحفاظ على الجينات في سياقها الجينومية والسماح للتعبير تقريبا الفسيولوجية. ورني ضد الجينات البشرية الذاتية يترك التعبير دون تغيير الماوس التحوير الذي ينقذ لرني - النمط الظاهري. رني الانقاذ يوفر الذهب القياسية للتحقق من الظواهر رني المتاحة حتى الآن.
- أخيرا ، تتم دراسة المرشحين المصادق بتفصيل أكبر لجني في نهاية المطاف فهم الآلية. ويمكن في كثير من الحالات يمكن استخدام رني في هذه التجارب ، على سبيل المثال في المقايسات والثانوي أكثر تفصيلا.
Discussion
لقد أصبح التدخل RNA تقنية قياسية لدراسة الخسائر من الظواهر ذات وظيفة. على نطاق واسع ، مجموعات من الوسطاء رني المتوفرة من مختلف الموردين ، وتوفير وسيلة سهلة وفعالة من حيث التكلفة وسريعة لإسكات الجينات. فتح هذا الباب لفحص منتظمة لرئيسى لاعبين في كثير من العمليات البيولوجية السماح منظور الجينوم النطاق بشأن طائفة واسعة من الأنواع المختلفة وأنواع الخلايا.
ارتفاع معدلات سلبية كاذبة وزائفة إيجابية تشكل تحديا مشتركا في شاشات رني. لمعالجة هذه المشكلة ، وقد استثمرت جهودا كبيرة لتحسين كفاءة وعلى وجه الخصوص بتشغيل خصوصية إسكات. كان الاكتشاف المهم أن مجموعة من siRNAs مختلفة تستهدف نص يعزز إلى حد كبير نفس النوعية المستهدفة. لأنه أنتج مجموعة معقدة جدا من siRNAs مختلفة من endoribonuclease ، esiRNAs مرتفعة مشغلات خصوصية المستهدفة ، وتخفيض معدل إيجابية كاذبة في شاشات رني. وقد أثبتت esiRNAs أيضا لتحقيق knockdowns كفاءة ، وخفض أيضا سعر سلبية كاذبة.
لأن الشاشات رني يطالبون من الناحية الفنية ، فإنها من المرجح ان تظل تحديا لأداء على أساس روتيني لبعض الوقت. لكن ، وكما كواشف المختبرات وأدوات الحصول على أفضل وأكثر خبراتهم ، تعتبر استخدام شاشات رني في البيولوجيا الحديثة لزيادة في المستقبل.
Disclosures
الكتاب تعلن العلاقات المالية مع الكيانات التجارية التي قد يكون لها مصلحة في العمل المقدم.
Acknowledgments
نود أن نعترف أعضاء المختبر بوتشولز وسيغما الدريخ رني في الفريق للمناقشة. نود أن نشكر جمعية ماكس بلانك والفراء Bundesministerium Bildung اوند الإضافية اطلعوا سباقا الذهاب بيو [0315105] للحصول على الدعم.
بعثة ® هي علامة تجارية مسجلة لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
