Summary
Hier verwenden wir ein menschliches esiRNA Bibliothek in einem Hochdurchsatz-Screening nach Genen der Zellteilung beteiligt. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Durchführung eines esiRNA Bildschirme, und wie zu analysieren und die Ergebnisse überprüfen.
Abstract
RNA-Interferenz (RNAi) ist eine grundlegende zelluläre Mechanismus für die Kontrolle der Genexpression. RNAi wird von kurzen doppelsträngigen RNAs auch als small interfering RNAs (siRNAs) bezeichnet induziert. Die kurze doppelsträngige RNAs stammen aus mehr doppelsträngigen Vorstufen durch die Aktivität von Dicer, ein Protein der RNase III Familie von Endonukleasen. Die resultierenden Fragmente sind Bestandteile des RNA-induced silencing complex (RISC), lenkt sie auf die verwandten Ziel-mRNA. RISC spaltet die Ziel-mRNA wodurch die Expression des kodierten Proteins 1,2,3. RNAi hat sich zu einem mächtigen und weit verbreiteten experimentellen Methode für den Verlust der Genfunktion Studien in Säugerzellen Nutzung small interfering RNAs.
Derzeit sind zwei wichtigsten Methoden sind für die Produktion von small interfering RNAs. Eine Methode besteht in der chemischen Synthese, während eine alternative Methode beschäftigt endonukleolytische Spaltung der Ziel-spezifischen langen doppelsträngigen RNAs von RNase III in vitro. Dabei ist eine vielfältige Pool von siRNA-Oligonukleotide wie erzeugt, die auch als Endoribonuklease vorbereitet siRNA oder esiRNA bekannt. Ein Vergleich der Wirksamkeit von chemisch abgeleiteten siRNAs und esiRNAs zeigt, dass beide Trigger potent in Ziel-Gen-Silencing sind. Unterschiede können jedoch beim Vergleich Spezifität werden. Viele einzelne chemisch synthetisierte siRNAs herstellen prominenten Off-Target-Effekte, während die komplexen Gemisch innewohnt esiRNAs führt zu einer spezifischen Knockdown 10.
In dieser Studie präsentieren wir die Gestaltung der genomweite MISSION esiRNA Bibliotheken und deren Nutzung für die RNAi-Screening durch einen DNA-Gehalt Bildschirm für die Identifizierung von Genen in den Ablauf des Zellzyklus beteiligt veranschaulicht. Wir zeigen, wie die Transfektionsprotokolls und der Test für das Screening in hohem Durchsatz zu optimieren. Wir zeigen auch, wie groß Datensätze können statistisch ausgewertet werden und gegenwärtige Methoden zur primären Treffern zu validieren. Schließlich geben wir mögliche Ansatzpunkte für weitere funktionelle Charakterisierung von validierten Hits.
Protocol
1. Hochwertige MISSION esiRNA Bibliotheken
- Für jedes Gen von Interesse am anfälligsten und spezifische Zielregion für RNAi gewählt Nutzung der DEQOR Algorithmus (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 DEQOR Partituren zum Schweigen Potenzial aller möglich 21 Nukleotide lange siRNAs in einem Ziel-mRNA auf State-of-the art Design-Constraints 4. Darüber hinaus wird jeder potenzielle siRNA für mögliche Kreuzreaktionen mit anderen Genen, indem Sie eine BLAST-Suche gegen das Transkriptom des Organismus untersucht analysiert. Das Programm bietet damit eine Analyse der allgemeinen Qualität und cross-Silencing Kapazitäten der potenziellen esiRNA (300-600 bp Länge).
- Die gewählten Region der Ziel-Gen cDNA durch PCR mit genspezifischen Primern von Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor-Sequenzen flankiert verstärkt.
- Jeder PCR-Produkt für MISSION esiRNA Produktion verwendet wird, für die Identität durch Sequenzierung und für die Reinheit von Caliper LabChip verifiziert.
- Lange doppelsträngige RNA wird aus dem PCR-Produkt durch die RNA-Polymerase, durch ein Glühen der transkribierten Stränge verfolgt transkribiert.
- esiRNAs sind begrenzt durch enzymatische Verdauung der langen doppelsträngigen RNA mit RNaseIII durch Reinigung über Anionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose Spin-Säulen, hergestellt.
- esiRNAs werden gefällt und resuspendiert in TE-Puffer. Die Ausbeute wird durch UV-Absorptionsmessungen gemessen und die Konzentration wird durch Lösen in einem geeigneten Volumen TE-Puffer eingestellt. Die Qualität des Endprodukts wird durch Caliper LabChip Analyse überprüft.
2. Die Wahl einer Zelllinie und die Optimierung der Transfektion für das Screening
- Titrieren Mengen esiRNA (Verwendung Eg5 als positiv und Renilla-Luciferase als Negativ-Kontrolle) und steigende Mengen an Transfektionsreagenz in einer 384-Well-Platte, fügen Zellen und inkubieren für 48 Stunden. Eg5 ist ein Kinesin-Motorproteine für bipolare Spindel-Anordnung und eine Depletion führt zu einer mitotischen verhaften. Wiederholen Sie diesen Vorgang für verschiedene Transfektionsreagenzien und Zelllinien. Hier verwenden wir HeLa-Zellen kultiviert folgenden Standardverfahren und oligofectamine (Invitrogen) als Transfektionsreagenz.
- Für die Auswahl der optimalen Transfektionsbedingungen zählen die Zellen mit Eg5 esiRNAs, dass eine Mitose (runde Form) und die Gesamtzahl der Zellen mit Renilla-Luciferase (RLuc) esiRNA mittels Lichtmikroskopie transfizierten zeigen transfiziert. Wählen Sie den Zustand mit der geringsten Toxizität für RLuc und am ausgeprägtesten Phänotyp für Eg5.
Eine alternative Methode für die Optimierung der Transfektion Bedingungen beinhaltet eine stabile Zelllinie EGFP (oder ein anderes geeignetes Reportergen) unter der Kontrolle eines konstitutiven aktiven Promotor. Nach der Transfektion eines esiRNA gegen EGFP (oder einem anderen Reporter-Gen) und RLuc (oder einem anderen geeigneten Negativkontrolle esiRNA) messen knock-down Wirksamkeit und Toxizität von zB Fluoreszenz unterstützt Zellsortierung (FACS). Stellen Sie sicher, dass die verwendeten esiRNA für EGFP vollständig komplementär zu den Ziel-mRNA ist.
3. Einrichten des primären Bildschirms 5,6
- Optimieren Sie die Pipettiergenauigkeit für alle verwendeten Komponenten auf einem automatischen Pipettieren Station (zB Aquarius, Tecan und WellMate, Matrix). Da Pipettieren Parameter auf die Art von Lösung, Volumen und Plattentyp ändern sich in Abhängigkeit dieser Optimierung muss für jeden Schritt einzeln wiederholt werden. Wenn möglich, sollte das Pipettieren Station unter einer Sterilbank platziert werden, um Kontaminationen zu vermeiden. Alle verwendeten Komponenten sollten vor der Verwendung desinfiziert werden entweder durch Autoklavieren ggf. oder durch Besprühen mit 75% Ethanol. Optimieren wash-Protokolle, so dass eine Kreuzkontamination von Brunnen zu Brunnen ist ausgeschlossen. Details für die Optimierung von Pipettierautomaten kann nicht geben, für die Raum-Einschränkungen und hängen stark von der verwendeten Pipettierstation. Für weitere Informationen beziehen sich auf die Hersteller-Protokoll.
- Transfektion von Zellen in 384-Well-Format mit den optimierten Bedingungen von oben mit esiRNAs für Eg5 und RLuc. Verwenden Sie ein abwechselndes Muster für Eg5 und RLuc esiRNA über die gesamte Platte.
- Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden beheben die Zellen mit kaltem 100% Ethanol in PBS rehydriert für 15 Minuten, Edelstahl für 25 Minuten in PBS mit 1 pg / ml DAPI und 100 ug / ml RNase A (Qiagen). Schließlich mit PBS und speichern Waschen bei 4 ° C.
- Messen Sie die Intensität der DAPI-Fluoreszenz-Mikroskopie durch z. B. auf einer Olympus ScanR System. Generieren Sie ein Histogramm durch Auftragen DAPI-Intensität gegen die Zellzahl und Auswertung der Zellzyklus-Verteilung durch die Berechnung der Anteil der Zellen mit der DNA-Gehalt 2N für G1-Phase; <2N> 4N für S-Phase; 4N für G2/M-phase und > 4N für Aneuploidie / Polyploidie.
- Beurteilen Sie die Homogenität der Ergebnisse über die Platte. Eine weitere Optimierung ist notwendig, wenn die Ergebnisse signifikant zu positionieren effe auszuschließencts. Ein häufiges Problem bei der Verwendung von Multi-Well-Platten wird verbessert Verdunstung am Rande Brunnen während Inkubationszeit. Dies führt zu unterschiedlichen experimentellen Bedingungen in verschiedenen Vertiefungen, die oft übersetzt Platte-Position spezifische Wirkungen. Aus diesem Grund empfehlen wir allen Rand Brunnen leer für einen Bildschirm zu verlassen. Zur weiteren Minimierung Verdunstung sorgen dafür, dass die Inkubatoren bei hoher Luftfeuchtigkeit aufbewahrt werden. Wir setzen routinemäßig Verdunstung Barrieren wie Corning Atmungsaktive Dichtungsband, die Verdunstung zu blockieren. Auch andere Ressourcen für die Position Effekte zu berücksichtigen, z. B. technische Veränderung der Anzeige-System (Mikroskop, Platten-Lesegerät, etc) oder Variationen in Liquid Handling (Steigungen, Inhomogenität der Lösungen, etc.) entnommen werden.
- Die statistischen Unterschiede zwischen positiven und negativen Kontrollen stellen ein Maß für die Bedeutung des Tests verwendet. Ein großer Unterschied zwischen negativen Kontrolle (oder Hintergrundgeräusche; Mock-Kontrolle) und Probe muss vor Beginn der eigentlichen Screening festgestellt werden. Ein gutes Maß für die statistische Signifikanz der Z-Faktor. Der Z-Faktor ist nach der Gleichung berechnet:
Z = 1 - (3 SD [sample] + 3 SD [Mock]) * (| Av [sample] - Av [Mock] |) -1; mit SD: Standardabweichung, Av: Durchschnitt. Ein Z-Faktor von 1> Z> 0,5 zeigt eine statistisch signifikante Trennung der negativen Kontrollen (und Lärm) von den positiven steuert 7.
4. Primäre Bildschirm
- Bereiten Sie 384-well-Zellkulturplatten für die Transfektion von esiRNAs Nutzung der optimierten Bedingungen von oben. Hier verwenden wir 15NG esiRNA pro Well in 5μl TE-Puffer gelöst. Mindestens acht Kontrolle Positionen pro Platte sollte mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen für den biologischen Prozess untersucht (: Eg5 und RLuc hier) geladen werden. Um zu vermeiden, Position Effekte Rande Vertiefungen werden mit 5μl TE-Puffer nur geladen.
- Add 5μl OptiMEM (Invitrogen) mit 0.2μl Oligofectamine pro Well, Mischen und inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
- Add Zellsuspension auf die Transfektion Mischung (hier: 40 ul einer HeLa Zellsuspension bei 25 Zellen / ul Konzentration; äquivalent zu 1000 Zellen pro well) und Inkubation für 72 Stunden.
- Messen DNA-Inhalte auf einem automatisierten Mikroskop (Olympus ScanR, siehe oben). Bewerten mit Z-score-Statistik für hit Auswahl: Z-Scores werden für alle Proben esiRNAs mit dem Signal für die negative Kontrolle als Referenz berechnet. Beachten Sie, dass die Z-score nicht das gleiche wie das Z-Faktor. Z-Scores bieten ein statistisches Maß für die Bedeutung der Abtastwerte im Vergleich zu einem (Mock-) Kontrolle. Es ist nach der Gleichung berechnet:
Z = (Wert [Sample] - durchschnittlich [Mock]) * Standard-Abweichung [Mock] -1.
Für Hit Auswahl eines Schwellenwerts muss angewendet werden. In der Regel wie eine Bedeutung Kriterien: 2 <Z <-2 verwendet wird, sondern abhängig von der Qualität des Datensatzes, der studierte biologischen Prozess oder einfach nur den Rahmen des Bildschirms, unterschiedliche Schwellenwerte könnten erhoben werden. Neben den recht einfach Z-score Statistiken auch aufwändigere mathematische Auswerteverfahren verwendet werden (ein erster Einblick in das weite Feld der statistischen Auswertung der Screening-Daten können in Malo et al. 8).
5. Sekundäre Bildschirm und drücken Sie die Validierung
- Ein zweiter Bildschirm folgt den primären Bildschirm, um Fehlalarme aufgrund von experimentellen Fehlern oder Off-Target-Effekte zu beseitigen. Für die ausgewählten hits dem gleichen Verfahren wie in den primären Bildschirm verwendet werden, sollten für eine größere Anzahl von Wiederholungen (3-5) wiederholt werden, um eine bessere statistische Auswertung zu ermöglichen.
- Für überprüft trifft ein sekundärer, nicht-überlappenden esiRNA (oder ein anderes nicht-überlappenden silencing Trigger) gegen die Ziele in den ersten Screens identifiziert verwendet werden sollte. Das gleiche Test und Auslesen sind als für den primären Bildschirm verwendet werden.
- Letztendlich ist die ausgewählten Gene können durch cross-species RNAi Rettung 9 validiert werden. Dadurch wird eine bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Verschlüsselung, wie zB die Maus Ortholog des Gen stabil in Zellen transfiziert. BAC-Konstrukte erhalten ein Gen in ihrer genomischen Kontext und ermöglichen eine fast-physiologische Ausdruck. RNAi gegen die endogenen menschlichen Gen verlassen die Maus Transgenexpression unverändert, die die RNAi-Phänotyp-rettet. RNAi-Rettung bietet der Gold-Standard für die Überprüfung der RNAi-Phänotypen bislang nicht verfügbar.
- Schließlich werden die validierten Kandidaten im Detail untersucht, um schließlich daraus mechanistische Verständnis. In vielen Fällen RNAi kann in diesen Experimenten verwendet werden, zB in der Sekundarstufe, aufwändigere Tests.
Discussion
RNA-Interferenz hat sich zu einem Standard-Technik, um loss-of-function Phänotypen studieren. Groß angelegte Sammlungen von RNAi-Mediatoren sind von verschiedenen Herstellern erhältlich und bieten eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode für die Gen-Silencing. Diese öffnete sich das Tor für das systematische Screening für Key-Player in vielen biologischen Prozessen ermöglicht ein Genom-Skala Perspektive auf eine Vielzahl von verschiedenen Arten und Zelltypen.
Hohe falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse sind eine gemeinsame Herausforderung in RNAi-Screens. Um dieses Problem anzugehen, haben erhebliche Anstrengungen investiert, um die Wirksamkeit zu verbessern und insbesondere die Spezifität der silencing auslöst. Eine wichtige Entdeckung war, dass ein Pool von verschiedenen siRNAs demselben Transkript stark erhöht Zielspezifität. Da ein sehr komplexes Pool von verschiedenen siRNAs durch die Endoribonuklease produziert wird, werden esiRNAs hohen Zielspezifität auslöst, die Verringerung der Quote an falsch positiven RNAi-Screens. esiRNAs haben auch gezeigt, um eine effiziente Niederschlägen zu erreichen, wodurch auch die falsch-negative Rate.
Da RNAi-Screens technisch anspruchsvoll sind, werden sie wahrscheinlich schwierig bleiben, um auf einem Routine-Basis für einige Zeit durchzuführen. Doch wie bekommen Reagenzien und Instrumente besser und Labors teilen ihre Erfahrungen, sind die Verwendung von RNAi-Screens in der modernen Biologie als auch in Zukunft zu erhöhen.
Disclosures
Autoren erklären, finanzielle Beziehungen mit kommerziellen Unternehmen, die ein Interesse an der eingereichten Arbeit haben könnte.
Acknowledgments
Wir möchten die Mitglieder des Buchholz-Labor und die Sigma-Aldrich RNAi-Team zur Diskussion zu bestätigen. Wir möchten die Max-Planck-Gesellschaft und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] für die Unterstützung bedanken.
MISSION ® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
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- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
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