Summary
Här använder vi ett mänskligt esiRNA bibliotek i en hög genomströmning skärm för gener involverade i celldelningen. Vi visar hur du ställer upp och genomföra en esiRNA skärmar, samt hur man kan analysera och validera resultaten.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) är en grundläggande cellulära mekanism för kontroll av genuttryck. RNAi är induceras av kort dubbelsträngat RNA även känd som små störande RNA (siRNA). Den korta dubbel-strängat RNA härstammar från längre strandsatta dubbelt prekursorer av verksamheten i Dicer, ett protein av RNas III familjen endonukleaser. Den resulterande fragment är delar av RNA-inducerad tysta komplex (RISC), rikta den till besläktat målet mRNA. RISC klyver målet mRNA och därmed minska uttrycket av protein som bildas 1,2,3. RNAi har blivit en kraftfull och används ofta experimentell metod för förlust av studier geners funktion i däggdjursceller utnyttja små störande RNA.
För närvarande två huvudsakliga metoder finns tillgängliga för produktion av små störande RNA. En metod innebär kemisk syntes, medan en alternativ metod sysselsätter endonucleolytic klyvning av målspecifika långa dubbel-strängat RNA som RNas III in vitro. Därmed är ett mångsidigt pool av siRNA-liknande oligonukleotider fram som också är känd som endoribonuclease förberedda siRNA eller esiRNA. En jämförelse av effekten av kemiskt framställda siRNA och esiRNAs visar att både triggers är potenta i Target-geners uttryck. Skillnaderna kan dock ses vid en jämförelse specificitet. Många ensamstående kemiskt syntetiserade siRNA producera framstående ej åsyftade effekter, medan den komplexa blandningen inneboende i esiRNAs leder till en mer specifik ÖVERVÄLDIGANDE 10.
I denna studie presenterar vi designen av genomet skala bibliotek MISSION esiRNA och dess användning för RNAi screening exemplifieras av ett DNA-innehåll på skärmen för att identifiera gener involverade i cellcykelreglering. Vi visar hur man kan optimera transfektion protokollet och analysen för screening med hög genomströmning. Vi visar också hur stora data-uppsättningar kan utvärderas statistiskt och presentera metoder för att validera primära träffar. Slutligen ger vi möjligheter utgångspunkter för ytterligare funktionella karakteriseringar av validerade träffar.
Protocol
1. Högkvalitativ MISSION esiRNA bibliotek
- För varje gen av intresse de mest mottagliga och specifika mål region för RNAi väljs utnyttjar DEQOR algoritm (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 DEQOR poäng att tysta potentialen hos alla möjliga 21 nukleotider långa siRNA i ett mål-mRNA baserad på state-of-the art design-begränsningar 4. Dessutom är varje potentiell siRNA analyseras för eventuella korsreaktioner med andra gener genom att göra en BLAST sökning mot transkriptom organismens studeras. Programmet ger därmed en analys av den övergripande kvaliteten och över tysta kapacitet av de potentiella esiRNA (300-600 bp längd).
- Den valda region i mål-genen cDNA förstärks genom PCR med genspecifika primers flankerad av bakteriofag RNA-polymeras-promotor-sekvenser.
- Varje PCR-produkt som används för Mission esiRNA produktionen kontrolleras för identitet genom sekvensering och renhetsgrad av Caliper Labchip analys.
- Långa dubbelsträngat RNA är transkriberas av PCR-produkten med RNA-polymeras, följt av en glödgning av transkriberade delar.
- esiRNAs förbereds av begränsade enzymatisk nedbrytning av den långa dubbelsträngat RNA med hjälp av RNaseIII följt av rening genom anjonbindande utbyte kromatografi utnyttjar Q-sepharose spin kolonner.
- esiRNAs fälls och suspenderade i TE buffert. Avkastningen mäts genom UV-absorption mätningar och koncentrationen justeras genom att lösa upp i en lämplig volym av TE buffert. Den övergripande kvaliteten på slutprodukten kontrolleras av Caliper Labchip analys.
2. Välja en cellinje och optimera transfektion för screening
- Titrera mängder esiRNA (använd Eg5 som positiv och renilla-luciferas som negativ kontroll) och allt större transfektion reagens i en 384-brunnar, lägga till celler och inkubera i 48 timmar. Eg5 är en kinesin motor protein som behövs för bipolär spindelenhet och utarmning leder till en mitotiska gripande. Upprepa proceduren för olika transfektion reagens och cellinjer. Här använder vi HeLa celler odlade följande standard procedurer och oligofectamine (Invitrogen) som transfektion reagens.
- För att välja den optimala transfektion villkor räkna celler transfekterade med Eg5 esiRNAs som visar en mitotiska arrestering (runda formen) och det totala antalet celler transfekterade med renilla-luciferas (RLUC) esiRNA med ljusmikroskop. Välj skick med minst toxicitet för RLUC och de mest uttalade fenotypen för Eg5.
En alternativ metod för optimering av transfektion villkor innebär en stabil cellinje som uttrycker EGFP (eller annan lämplig reporter gen) under kontroll av ett konstitutivt aktiv promotor. Efter transfektion av en esiRNA mot EGFP (eller en annan reporter gen) och RLUC (eller annan lämplig negativ kontroll esiRNA) mäter knock-down effekt och toxicitet genom t.ex. fluorescens hjälp cellsortering (FACS). Se till att den används esiRNA för EGFP är fullt komplement till mål-mRNA.
3. Installera den primära skärmen 5,6
- Optimera pipettering noggrannhet för alla komponenter som används på ett automatiserat pipettering station (t.ex. Aquarius, Tecan och WellMate, Matrix). Eftersom pipettering parametrar ändras beroende på vilken typ av lösning, volym och plåt typ denna optimering måste upprepas för varje steg separat. Om möjligt bör pipetteringen stationen placeras i dragskåp huva för att undvika föroreningar. Alla använda komponenter bör saneras före användning antingen genom autoklavering om tillämpligt, eller genom att spraya med 75% etanol. Optimera tvätt-protokoll så att korskontaminering från väl till väl är utesluten. Detaljer för optimering av automatiserade pipettering kan inte ge för rymd-begränsningar och beror till stor del på den utnyttjade pipettering stationen. För ytterligare information hänvisas till tillverkare protokollet.
- Transfektera celler i 384-brunnars format med hjälp av optimerade villkor från ovan med esiRNAs för Eg5 och RLUC. Använd ett växlande mönster för Eg5 och RLUC esiRNA täcker hela plattan.
- Efter inkubation i 48 timmar fixera cellerna med kalla 100% etanol, rehydrera i PBS i 15 minuter, bets i 25 minuter i PBS som innehåller 1 mikrogram / ml DAPI och 100 mikrogram / ml RNas A (Qiagen). Slutligen tvättas med PBS och förvara vid 4 ° C.
- Mät intensitet DAPI-fluorescens i mikroskop till exempel om en Olympus ScanR system. Skapa ett histogram genom att markera DAPI intensitet mot mobilnummer och utvärdera fördelningen cellcykeln genom att beräkna andelen celler med DNA-innehåll 2N för G1-fas, <2N> 4N för S-fasen, 4N för G2/M-phase och > 4N för aneuploidi / polyploidi.
- Utvärdera homogenitet resultat under plattan. Ytterligare optimering behövs om resultaten skiljer sig markant att utesluta ställning effeCTS. Ett vanligt problem när man använder flera bra plattor ökar avdunstningen vid kanten brunnar under inkubationstiden. Detta leder till olika experimentella förhållanden i olika brunnar, som ofta översätts till tallrik-läge specifika effekter. Av denna anledning rekommenderar vi att lämna alla kanter brunnar tom för en skärm. För att ytterligare minimera avdunstning se till att inkubatorer hålls på hög luftfuktighet. Vi har också rutinmässigt använder avdunstning hinder såsom Corning andas förseglingstejpen som blockerar avdunstning. Även andra resurser för position effekter måste beaktas, t.ex. tekniska variant av avläsningen systemet (mikroskop, plattläsaren, etc.) eller variationer i vätskehantering (gradienter, homogen lösningar, etc).
- Den statistiska skillnader mellan positiva och negativa kontroller ger ett mått på betydelsen av sysselsatta analysen. En stor skillnad mellan negativ kontroll (eller bakgrundsljud, mock-kontroll) och prov måste fastställas innan själva screeningen. Ett bra mått för statistisk signifikans är Z-faktorn. Z-faktorn beräknas med följande ekvation:
Z = 1 - (3 SD [sample] + 3 SD [håna]) * (| Av [sample] - Av [håna] |) -1, med SD: standardavvikelse, Av: genomsnitt. En Z-faktor på 1> Z> 0,5 indikerar en statistiskt signifikant separering av negativa kontroller (och buller) från de positiva kontrollerna 7.
4. Primära skärmen
- Förbered 384-brunnars plattor vävnadskulturer för transfektion av esiRNAs utnyttja optimerade villkor från ovan. Här använder vi 15ng esiRNA per brunn upplöst i 5μl TE buffert. Minst åtta manöverplatser per platta skall laddas med lämpliga positiva och negativa kontroller för de studerade biologiska processen (här: Eg5 och RLUC). För att undvika ställning effekter kanten brunnar är laddade med 5μl TE buffert bara.
- Lägg 5μl OptiMEM (Invitrogen) som innehåller 0.2μl Oligofectamine per brunn, blanda och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Lägg cellsuspension på transfektion blandningen (här: 40μl av en HeLa cellsuspension på 25 celler / l koncentration, vilket motsvarar 1000 celler per brunn) och inkubera i 72 timmar.
- Mät DNA-innehåll på ett automatiserat mikroskop (Olympus ScanR, se ovan). Utvärdera med hjälp av Z-score statistik för drabbade valet: Z-poäng beräknas för alla prov esiRNAs använder signalen för den negativa kontrollen som referens. Obs, är Z-score inte samma sak som Z-faktorn. Z-poäng ger ett statistiskt mått på betydelsen av prov värden i jämförelse med ett (mock-) kontroll. Den beräknas efter formeln:
Z = (värde [sample] - genomsnitt [håna]) * standard-avvikelsen [hånar] -1.
För slog val en tröskel måste tillämpas. Vanligtvis en betydelse kriterier som: 2 <Z <-2 används, men beroende på kvaliteten på datasetet, den studerade biologiska processen eller bara omfattningen av skärmen kan olika tröskelvärden tillämpas. Bredvid ganska lätt Z-score statistiken också mer avancerade matematiska metoder för utvärdering kan användas (ett första inne i den breda området för statistisk utvärdering av screening data kan hittas i Malo et al. 8).
5. Sekundär skärm och tryck validering
- En sekundär skärm följer den primära skärmen för att eliminera falska positiva på grund av experimentella fel eller ej åsyftade effekter. För den valda träffar samma förfarande som används i den primära skärmen bör upprepas för ett större antal replikat (3-5) för att möjliggöra en bättre statistisk utvärdering.
- För verifierade träffar en sekundär icke överlappande esiRNA (eller någon annan icke-överlappande tysta trigger) mot de mål som identifieras i den första skärmarna ska användas. Samma analys och avläsning bör tillämpas som för den primära skärmen.
- Ytterst valda gener kan valideras av gränsöverskridande art RNAi räddning 9. Därmed en bakteriell konstgjord kromosom (BAC) kodning t.ex. mus ortholog av genen är stabilt transfekterade i celler. BAC-konstruktioner bevara en gen i sin genomiska sammanhang och möjliggöra en nästan fysiologiska uttryck. RNAi mot kroppsegna mänskliga genen kommer att lämna uttrycket musen transgenen oförändrade som räddar RNAi-fenotyp. RNAi-räddning ger guld-standard för kontroll av RNAi fenotyper tillgängliga.
- Slutligen är validerade kandidater studeras mer i detalj för att så småningom dra mekanistisk förståelse. I många fall RNAi kan användas i dessa experiment, t ex i sekundära, mer avancerade analyser.
Discussion
RNA-interferens har blivit en standardiserad teknik för att studera förlust-av-funktion fenotyper. Storskalig samlingar av RNAi-medlare är tillgängliga från olika leverantörer och ger en enkel, kostnadseffektiv och snabb metod för gen-tystas. Detta öppnade grinden för systematisk screening för nyckel-spelare i många biologiska processer möjliggör en genomet skala perspektiv på ett brett spektrum av olika arter och celltyper.
Hög falskt positiva och falskt negativa resultat är en gemensam utmaning i RNAi skärmar. För att lösa detta problem har stora ansträngningar har investerats för att förbättra effektivitet och i synnerhet specificitet tysta triggers. En viktig upptäckt var att en pool av olika siRNA inriktade på samma avskriften kraftigt förbättrar mål specificitet. Eftersom en mycket komplex grupp av olika siRNA produceras av endoribonuclease, esiRNAs är höga mål specificitet triggers, minska falska positiva ränta i RNAi skärmar. esiRNAs har också visat att uppnå en effektiv knockdowns, minskar också den falska negativ ränta.
Eftersom RNAi-skärmar är tekniskt krävande, kommer de fortfarande sannolikt en utmaning att utföra på ett rutinmässigt under en tid. Men som reagens och instrument bli bättre och laboratorier dela sina kunskaper, är användningen av RNAi skärmar i modern biologi bedöms öka i framtiden.
Disclosures
Författarna förklarar finansiella relationer med kommersiella enheter som kan ha intresse av det inlämnade arbetet.
Acknowledgments
Vi vill tacka för medlemmar i Buchholz laboratoriet och Sigma-Aldrich RNAi-team för diskussion. Vi vill tacka Max Planck Society och Bundesministerium für Bildung und Forschung Grands Go-Bio [0315105] för stöd.
MISSION ® är ett registrerat varumärke som tillhör Sigma-Aldrich Bioteknik LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
