Summary
Qui si usa una libreria umano esiRNA in un high-throughput schermo per geni coinvolti nella divisione cellulare. Dimostriamo come impostare e condurre un esiRNA schermi, e come analizzare e convalidare i risultati.
Abstract
Interferenza dell'RNA (RNAi) è un meccanismo cellulare di base per il controllo dell'espressione genica. RNAi è indotta da brevi double-stranded RNA conosciuta anche come piccoli RNA interferenti (siRNA). Il corto double-stranded RNA provengono da più precursori a doppio filamento per l'attività di Dicer, una proteina della famiglia delle endonucleasi RNasi III. I frammenti risultanti sono i componenti del silenziamento dell'RNA indotta complesso (RISC), orientandola verso l'mRNA bersaglio affini. RISC si unirà l'mRNA bersaglio riducendo così l'espressione della proteina codificata 1,2,3. RNAi è diventato un metodo potente ed ampiamente utilizzato sperimentale per la perdita degli studi di funzione del gene in cellule di mammifero utilizzando piccoli RNA interferenti.
Attualmente due metodi principali sono disponibili per la produzione di piccoli RNA interferenti. Un metodo comporta sintesi chimica, mentre un metodo alternativo impiega scissione endonucleolytic di target specifici long double-stranded RNA da RNase III in vitro. In tal modo, un pool eterogeneo di siRNA oligonucleotidi come viene prodotto, che è anche conosciuto come endoribonuclease preparata siRNA o esiRNA. Un confronto di efficacia di siRNA chimicamente derivati e esiRNAs mostra che entrambi i trigger sono potenti in target-silenziamento genico. Differenze possono però essere visti quando si confrontano specificità. Molti siRNA solo per sintesi chimica di produrre importanti effetti off-target, mentre la miscela complessa inerente esiRNAs porta ad una più specifica knockdown 10.
In questo studio, presentiamo il progetto di librerie MISSIONE genoma scala esiRNA e il suo utilizzo per lo screening RNAi esemplificato da un DNA contenuto dello schermo per l'identificazione di geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare. Mostriamo come ottimizzare il protocollo di trasfezione e il test per lo screening in un throughput elevato. Abbiamo anche dimostrare come grandi insiemi di dati possono essere valutati statisticamente e presenti metodi per convalidare colpi primaria. Infine, diamo potenziali punti di partenza per ulteriori caratterizzazioni funzionali di visite convalidato.
Protocol
1. Di alta qualità MISSIONE esiRNA librerie
- Per ogni gene di interesse della regione di destinazione più sensibili e specifici per la RNAi viene scelto utilizzando l'algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4. Punteggi DEQOR il potenziale silenziamento di tutti possibili 21 nucleotidi siRNA a lungo in un obiettivo-mRNA in base a state-of-the-art design vincoli 4. Inoltre, ogni siRNA potenziale è analizzato per un possibile cross-reattività con altri geni eseguendo una ricerca BLAST contro il trascrittoma dell'organismo studiato. Il programma prevede quindi una analisi della qualità complessiva e cross-silenziamento capacità del esiRNA potenziale (300-600 lunghezza bp).
- La regione scelta del target-gene cDNA viene amplificato mediante PCR utilizzando primers gene-specifici affiancato da batteriofagi RNA-polimerasi-promotore sequenze.
- Ogni prodotto di PCR utilizzata per la produzione MISSIONE esiRNA è verificata l'identità mediante sequenziamento e l'analisi di purezza, Pinza Labchip.
- Long double-stranded RNA trascritto dal prodotto PCR da RNA polimerasi, seguita da una ricottura dei fili trascritte.
- esiRNAs sono preparati da limitate digestione enzimatica della long double-stranded RNA utilizzando RNaseIII seguita dalla purificazione tramite cromatografia a scambio anionico utilizzando Q-sefarosio colonne di rotazione.
- esiRNAs sono precipitati e risospese in tampone TE. Il rendimento si misura con assorbimento UV-misure e la concentrazione è regolata sciogliendo in un volume adeguato di tampone TE. La qualità complessiva del prodotto finale è controllato da analisi Pinza Labchip.
2. La scelta di una linea cellulare e ottimizzare la trasfezione per lo screening
- Quantità titolare di esiRNA (uso Eg5 come positivi e Renilla-luciferasi come controllo negativo) e quantità crescenti di reagenti di trasfezione in 384 pozzetti, aggiungere le cellule e incubare per 48 ore. Eg5 è una proteina motore chinesina necessari per l'assemblaggio del fuso bipolare e l'esaurimento porta ad un arresto mitotico. Ripetere questa procedura per i reagenti di trasfezione diverse linee cellulari. Qui, usiamo le cellule HeLa in coltura seguendo le procedure standard e oligofectamine (Invitrogen) come reagente di trasfezione.
- Per la scelta delle condizioni ottimali di transfezione contare le cellule transfettate con Eg5 esiRNAs che mostrano un arresto mitotico (forma rotonda) e il numero totale di cellule trasfettate con Renilla-luciferasi (RLUC) esiRNA al microscopio ottico. Scegli la condizione con il minor tossicità per RLUC e il fenotipo più pronunciata per Eg5.
Un metodo alternativo per l'ottimizzazione delle condizioni di trasfezione stabile coinvolge una linea di cellule che esprimono EGFP (o un altro gene reporter adatto) sotto il controllo di un promotore costitutivo attivo. Dopo la trasfezione di un esiRNA contro EGFP (o un altro gene reporter) e RLUC (o altro idoneo esiRNA controllo negativo) misura knock-down efficacia e la tossicità ad esempio con l'ordinamento delle cellule assistita fluorescenza (FACS). Assicurarsi che il esiRNA utilizzato per EGFP è perfettamente complementare al target-mRNA.
3. Impostazione della schermata principale 5,6
- Ottimizzare la precisione di pipettaggio per tutti i componenti utilizzati in una stazione di pipettamento automatizzati (ad esempio l'Acquario, Tecan e WellMate, Matrix). Poiché i parametri pipettaggio cambiano a seconda del tipo di tipo di soluzione, il volume e la piastra di questa ottimizzazione deve essere ripetuta per ogni fase separatamente. Se possibile, la stazione di pipettamento deve essere posto sotto una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Tutti i componenti utilizzati devono essere disinfettati prima di utilizzare sia in autoclave, se applicabile a spruzzo o con il 75% di etanolo. Ottimizzare i protocolli di lavaggio in modo che la contaminazione incrociata da pozzetto a pozzetto è esclusa. Dettagli per l'ottimizzazione del pipettaggio automatizzato non si può dare per vincoli di spazio e dipendono in gran parte dalla stazione di pipettamento utilizzati. Per maggiori informazioni fare riferimento al protocollo produce.
- Trasfezione delle cellule in formato da 384 pozzetti utilizzando le condizioni ottimizzate dall'alto con esiRNAs per Eg5 e RLUC. Utilizzare uno schema alternato per Eg5 e RLUC esiRNA copre l'intera piastra.
- Dopo incubazione per 48 ore fissare le cellule con etanolo freddo al 100%, reidratare in PBS per 15 minuti, macchia per 25 minuti in PBS contenente 1 mg / ml DAPI e 100 mg / ml RNasi A (Qiagen). Infine lavare con PBS e conservare a 4 ° C.
- Misurare l'intensità di fluorescenza DAPI-ad esempio con microscopia su un sistema Olympus ScanR. Genera un istogramma tracciando intensità DAPI contro numero di cellulare e valutare la distribuzione del ciclo cellulare calcolando la percentuale di cellule con il DNA contenuto 2N per G1-fase; <2N> 4N per la fase S; 4N per G2/M-phase e > 4N per aneuploidie / poliploidia.
- Valutare l'omogeneità dei risultati sopra la piastra. Ulteriore ottimizzazione è necessario se i risultati differiscono significativamente da escludere effe posizionects. Un problema comune quando si usano più pozzetti evaporazione è maggiore nei pozzi bordo durante il tempo di incubazione. Questo porta a diverse condizioni sperimentali in pozzi diversi, che si traduce spesso alla piastra posizioni effetti specifici. Per questo motivo, si consiglia di lasciare tutti i pozzi vuoti a bordo di uno schermo. Per minimizzare ulteriormente l'evaporazione assicurarsi che le incubatrici sono mantenuti a umidità elevata. Abbiamo anche abitualmente utilizzano barriere evaporazione come nastro di tenuta Corning traspirante che bloccano l'evaporazione. Anche altre risorse per gli effetti di posizione devono essere presi in considerazione, ad esempio, variazioni tecniche del sistema di lettura (microscopio, lettore di piastre, ecc) o variazioni di manipolazione dei liquidi (gradienti, disomogeneità delle soluzioni, ecc.)
- Le differenze statistiche tra controlli positivi e negativi di fornire una misura della significatività del test impiegato. Una grande differenza tra controllo negativo (o rumore di fondo; mock-controllo) e il campione deve essere stabilito prima di iniziare la proiezione vera e propria. Una buona misura per la significatività statistica è la Z-fattore. Lo Z-fattore è calcolato secondo la formula:
Z = 1 - (3 SD [campione] + 3 SD [finta]) * (| Av [campione] - Av [finta] |) -1, con SD: deviazione standard; Av: media. Un fattore di Z-1> Z> 0,5 indica una separazione statisticamente significativo dei controlli negativi (e rumore) dai controlli positivi 7.
4. Schermo primario
- Preparare 384 e piastre di coltura di tessuto per la transfezione di esiRNAs utilizzando le condizioni ottimizzate dall'alto. Qui, usiamo esiRNA 15ng per ben sciolto in tampone 5μl TE. Almeno otto posizioni di controllo per piastra deve essere caricata con opportuni controlli positivi e negativi per il processo biologico studiato (qui: Eg5 e RLUC). Per evitare effetti la posizione del bordo pozzi vengono caricati con tampone TE 5μl solo.
- Aggiungi 5μl OptiMEM (Invitrogen) contenente Oligofectamine 0.2μl per bene, mescolare e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungi sospensione cellulare sulla miscela di trasfezione (qui: 40μl di una sospensione di cellule HeLa a 25 cellule / concentrazione microlitri, pari a 1000 cellule per pozzetto) e incubare per 72 ore.
- Misura del DNA contenuto in un microscopio automatico (Olympus ScanR, vedi sopra). Valutare con Z-score statistiche per la selezione hit: Z-score vengono calcolati per tutti esiRNAs esempio utilizzando il segnale per il controllo negativo come riferimento. Nota, la Z-score non è la stessa della Z-fattore. Z-score fornisce una misura statistica per la significatività dei valori del campione rispetto ad un (finto) di controllo. Si è calcolato secondo la formula:
Z = (valore [Sample] - media [finta]) * deviazione standard [finta] -1.
Per la selezione ha colpito una soglia deve essere applicato. Tipicamente, un criterio di significato come: 2 <Z <-2 viene utilizzato, ma a seconda della qualità del set di dati, il processo biologico studiato o semplicemente la portata dello schermo, soglie differenti possono essere applicabili. Accanto alla abbastanza facile Z-score statistiche anche più elaborati metodi di valutazione matematico può essere utilizzato (dentro una prima volta nel vasto campo della valutazione statistica dei dati di screening può essere trovato a Malo et al. 8).
5. Schermo secondario e validazione colpito
- Uno schermo secondario segue lo schermo principale per eliminare i falsi positivi a causa di errori sperimentali o off-target effetti. Per i colpi selezionato la stessa procedura utilizzata nella schermata principale dovrebbe essere ripetuto per un maggior numero di repliche (3-5) per consentire una migliore valutazione statistica.
- Per colpisce verificato un esiRNA secondaria non sovrapposti (o un altro non sovrapposti innescare silenziamento) rispetto agli obiettivi individuati nelle schermate iniziali dovrebbero essere usati. La stessa analisi e lettura deve essere applicato come per lo schermo principale.
- In definitiva i geni selezionati possono essere convalidati da cross-specie di soccorso RNAi 9. Quindi un cromosoma batterico artificiale (BAC) che codifica per esempio il ortholog topo del gene è trasfettate stabilmente nelle cellule. BAC-costruisce conservare un gene nel suo contesto genomica e consentire una espressione quasi-fisiologica. RNAi contro il gene endogeno umano lascerà l'espressione del transgene inalterato topo che salva il RNAi-fenotipo. RNAi-rescue fornisce il gold-standard per la verifica dei fenotipi RNAi ad oggi disponibili.
- Infine, i candidati validati sono studiate in modo più dettagliato alla fine di ricavare comprensione meccanicistica. In molti casi RNAi può essere utilizzato in questi esperimenti, ad esempio in secondaria, i test più elaborati.
Discussion
RNA interference è diventata una tecnica standard per studiare la perdita di funzione fenotipi. Su larga scala collezioni di RNAi-mediatori sono disponibili da diversi fornitori e fornisce un metodo facile, conveniente e rapido per silenziamento genico. Ciò ha aperto la porta per lo screening sistematico per attori chiave in molti processi biologici che permette un genoma scala punto di vista su una vasta gamma di diverse specie e tipi di cellule.
Alto tasso di falsi positivi e falsi negativi sono una sfida comune a schermi RNAi. Per risolvere questo problema, notevoli sforzi sono stati investiti per migliorare l'efficacia e, in particolare, la specificità del silenziamento trigger. Una scoperta importante fu che un pool di diversi siRNA targeting la trascrizione stessa migliora notevolmente la specificità del bersaglio. Perché una piscina molto complessa di diversi siRNA è prodotto dalla endoribonuclease, esiRNAs sono alti trigger specificità del bersaglio, riducendo il tasso di falsi positivi nelle schermate RNAi. esiRNAs hanno anche dimostrato di raggiungere atterramenti efficiente, riducendo anche il tasso di falsi negativi.
Poiché gli schermi RNAi sono tecnicamente impegnativi, che probabilmente rimarrà difficile da eseguire di routine per qualche tempo. Tuttavia, come reagenti e strumenti di laboratori di ottenere una migliore e più condividere la loro esperienza, l'uso di schermi RNAi in biologia moderna sono ritenuti aumentare in futuro.
Disclosures
Gli autori dichiarano rapporti finanziari con gli enti commerciali che potrebbe avere un interesse per il lavoro presentato.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Buchholz e il Sigma-Aldrich RNAi-team per la discussione. Vorremmo ringraziare la Max Planck Society e il Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] per il supporto.
MISSION ® è un marchio registrato di Sigma-Aldrich Biotecnologie LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
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- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
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