Summary
Здесь мы используем человеческие библиотеки esiRNA в высокой пропускной способности экрана для генов, участвующих в делении клеток. Мы показываем, как создать и провести esiRNA экранов, а также, как анализировать и проверять результаты.
Abstract
РНК-интерференция (RNAi) является основным клеточным механизмом для контроля экспрессии генов. RNAi индуцирована короткие двухцепочечной РНК, также известный как малых интерферирующих РНК (siRNAs). Короткие двухцепочечной РНК происходят из больше двухцепочечную прекурсоров деятельностью Dicer, белка семьи РНКазы III эндонуклеаз. Полученные фрагменты являются компонентами РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC), направляя его в родственных мРНК мишени. RISC расщепляет целевой мРНК тем самым снижая экспрессию белков закодированы 1,2,3. RNAi стало мощным и широко используется экспериментальный метод потери исследования функции генов в клетках млекопитающих использованием малых интерферирующих РНК.
В настоящее время два основных метода доступны для производства малых интерферирующих РНК. Первый метод заключается в химическом синтезе, в то время как альтернативный метод использует endonucleolytic расщепления ориентированы на конкретные долго двухцепочечной РНК от РНКазы III в пробирке. Таким образом, разнообразный пул миРНК-подобные олигонуклеотиды производится который также известен как endoribonuclease подготовленные миРНК или esiRNA. Сравнение эффективности химическим путем siRNAs и esiRNAs показывает, что как триггеры являются мощным в целевых генов. Различия могут быть, однако, видели при сравнении специфику. Многие одного химически синтезированных siRNAs производят известный за пределами целевой эффекты, в то время как сложная смесь присущие esiRNAs приводит к более конкретным нокдаун 10.
В этом исследовании мы представляем проект генома масштаба МИССИЯ esiRNA библиотеки и ее использование для скрининга RNAi примере ДНК-контента экран для идентификации генов, участвующих в клеточном цикле. Мы покажем, как оптимизировать протокол трансфекции и тест для скрининга в высокой пропускной способности. Мы также продемонстрировать, насколько большой наборов данных, можно оценить статистически, так и современные методы для проверки первичных обращений. Наконец, приведем потенциальные отправные точки для дальнейших функциональных характеристиках проверенных хитов.
Protocol
1. Высококачественные библиотеки МИССИЯ esiRNA
- Для каждого гена наиболее восприимчивы и конкретным целевым регионом для RNAi выбирается использованием DEQOR алгоритм (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4. DEQOR оценки глушителей потенциал всех возможно 21 нуклеотидов siRNAs в целевой мРНК основана на состоянии искусства дизайн-ограничений 4. Кроме того, каждый потенциальный миРНК анализируется для возможного перекрестной реактивности с другими генами, выполняя BLAST поиска по транскриптома организма изучены. Программы таким образом, обеспечивает анализ общего качества и кросс-глушителей возможностей потенциальных esiRNA (300-600 б.п. длины).
- Выбранной области целевого гена кДНК усиливается ПЦР с использованием генов-специфических праймеров окружении бактериофага РНК-полимеразы-промоутер последовательностей.
- Каждый продукт ПЦР используется для производства МИССИЯ esiRNA проверяется на идентичность с помощью секвенирования и для чистоты анализа суппорт Labchip.
- Длинные двухцепочечной РНК транскрибируется с ПЦР-продукт РНК-полимеразы с последующим отжигом транскрибируется прядей.
- esiRNAs готовят ограниченную ферментативного переваривания долго двухцепочечной РНК с использованием RNaseIII с последующей очисткой через анионообменной хроматографии использованием Q-сефарозе столбцов спина.
- esiRNAs осаждаются и ресуспендировали в буфере TE. Доходность измеряется УФ-поглощения измерения и концентрация регулируется путем растворения в соответствующем объеме буфера ТЕ. Общее качество конечного продукта проверяется анализом суппорт Labchip.
2. Выбор линии клеток и оптимизация трансфекции для скрининга
- Титруйте количество esiRNA (использование Eg5 как положительные и renilla-люциферазы в качестве отрицательного контроля) и увеличением количества трансфекции реагента в 384-луночного планшета, добавьте клеток и инкубировать в течение 48 часов. Eg5 является белком кинезин двигателя, необходимых для сборки биполярного веретена и истощение приводит к митотический арест. Повторите эту процедуру для различных реагентов трансфекции и клеточных линиях. Здесь мы используем HeLa клеток, культивированных следующие стандартные процедуры и oligofectamine (Invitrogen) в качестве реагентов трансфекции.
- Для того чтобы выбрать оптимальные условия трансфекции подсчет клеток, трансфицированных Eg5 esiRNAs, которые показывают, митотический арест (круглой формы), а общее число клеток, трансфицированных renilla-люциферазы (RLUC) esiRNA с помощью световой микроскопии. Выберите состояние с наименьшей токсичностью для RLUC и наиболее выражены фенотип для Eg5.
Альтернативный метод для оптимизации условий трансфекции предполагает стабильную клеточную линию выражения EGFP (или другой подходящий ген репортер) под контролем учредительных активным пропагандистом. После трансфекции esiRNA против EGFP (или другой ген-репортер) и RLUC (или другой подходящий отрицательный esiRNA контроль) мера нокдауна эффективности и токсичности, например, путем флуоресценции помощью сортировки ячейки (FACS). Убедитесь, что использовали esiRNA для EGFP полностью дополняют целевой мРНК.
3. Настройка основного экрана 5,6
- Оптимизация пипетирования точности для всех используемых компонентов на автоматической станции пипетки (например, Водолей, Tecan и WellMate, Matrix). Потому что пипетирования параметры изменяются в зависимости от типа решение типа, объема и пластины этой оптимизации должен быть повторен для каждого шага в отдельности. Если это возможно, пипетки станции должен быть помещен под капотом ламинарного потока, чтобы избежать загрязнения. Все используемые компоненты следует продезинфицировать, прежде чем использовать либо в автоклаве при необходимости или путем распыления с 75% этанола. Оптимизация мыть-протоколов, так что перекрестное загрязнение от колодца к колодцу, не допускается. Подробная информация для оптимизации автоматизированных пипетки не может дать для космических ограничений и в значительной степени зависят от используемых пипетирования станции. За более подробной информацией обратитесь к протоколу производств.
- Трансфекции клеток в 384-и формат, используя оптимизированные условия сверху esiRNAs для Eg5 и RLUC. Используйте чередуются для Eg5 и RLUC esiRNA охватывающих всю тарелку.
- После инкубации в течение 48 часов зафиксировать клетки с холодными 100% этанол, увлажняет в PBS в течение 15 минут, пятно в течение 25 минут в PBS, содержащем 1 мкг / мл DAPI и 100 мкг / мл РНКазы (Qiagen). Наконец промыть PBS и хранить при температуре 4 ° C.
- Мера интенсивности DAPI-флуоресценции с помощью микроскопа, например, на системы Olympus ScanR. Создание гистограммы, откладывая DAPI интенсивности от числа клеток и оценить распределение клеточного цикла, вычисляя процент клеток с ДНК-контента 2N для G1-фазе; <2> 4N для S-фазы; 4N для G2/M-phase и > 4N для анеуплоидии / полиплоидии.
- Оценка однородности результатов за тарелку. Дальнейшая оптимизация необходима, если результаты будут отличаться значительно, чтобы исключить положение Эффекарата. Общей проблемой при использовании мульти-луночных усиливается испарение на краю скважин во время инкубационного периода. Это приводит к различным условиям эксперимента в разных скважин, которые часто переводится как пластинчатые позиции специфических эффектов. По этой причине, мы рекомендуем оставить все края скважин пустой экран. Для дальнейшей минимизации испарения убедитесь, что инкубаторы хранятся при высокой влажности. Мы также регулярно используют испарение барьеры, такие как Corning Дышащие уплотнительная лента, которые блокируют испарение. Кроме того, другие ресурсы для эффекта положения должны быть приняты во внимание, например, технические изменения системы отсчета (микроскоп, ридер и т.д.) или разновидности наливных (градиенты, неоднородность решений и т.д.).
- Статистические различия между положительными и отрицательными управления обеспечивают меру значение анализа занятых. Большая разница между отрицательного контроля (или фоновый шум, макет-контроль) и образца должна быть установлена до начала фактической проверки. Хорошая мера для статистической значимости Z-фактор. Z-фактор рассчитывается следующим уравнением:
Z = 1 - (3 SD [образец] + 3 SD [макет]) * (| Av [образец] - Av [макет] |) -1; с SD: стандартное отклонение; Av: средняя. Z-фактора 1> Z> 0,5 указывает на статистически значимое разделение отрицательного контроля (и шум) из положительного контроля 7.
4. Первичный экран
- Подготовка 384-луночных культуры тканей для трансфекции esiRNAs использованием оптимизированных условиях сверху. Здесь мы используем 15ng esiRNA в хорошо растворяется в 5 мкл буфера ТЕ. По меньшей мере восемь контроль позиций в пластине должен быть загружен с подходящими положительные и отрицательные контроли для биологических процессов изучена (здесь: Eg5 и RLUC). Чтобы избежать эффекта положение края скважины загружаются с 5 мкл ТЕ буфера только.
- Добавить 5 мкл OptiMEM (Invitrogen), содержащий 0.2μl Oligofectamine на лунку, перемешать и инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
- Добавить клеточной суспензии на трансфекции смеси (здесь: 40μl суспензии HeLa ячейки на 25 кл / мкл концентрации; эквивалентную до 1000 клеток на лунку) и инкубировать в течение 72 часов.
- Мера ДНК-контент на автоматизированных микроскоп (Olympus ScanR, см. выше). Оценка использования Z-оценка Статистика хит выбор: Z-оценки рассчитываются для всех образцов esiRNAs использованием сигнала для отрицательного контроля в качестве справочных. Обратите внимание, что Z-оценка не совпадает с Z-фактор. Z-оценки обеспечивают статистический показатель на значимость выборочных значений по сравнению с (макет) контроля. Он рассчитывается следующим уравнением:
Z = (значение [Образец] - средняя [макет]) * стандартное отклонение [макет] -1.
Для выбора хит порог должен быть применен. Как правило, значения критериев, как: 2 <Z <-2 используется, но в зависимости от качества данных, изучал биологический процесс, или просто сферу экран, различные пороговые значения могут быть применимы. Помимо довольно легко Z-оценка статистика также более сложные математические методы оценки могут быть использованы (сначала внутри в широком поле статистической оценки отбора данных можно найти в Malo и соавт. 8).
5. Вторичный экран и нажмите проверки
- Дополнительный экран следует основной экран для исключения ложных срабатываний из-за погрешностей эксперимента или вне целевой эффекты. Для выбранного хитов же процедуру, что используются в основной экран должен быть повторен для большего количества дубликатов (3-5), чтобы лучше статистической оценки.
- Для проверено хитов вторичных неперекрывающихся esiRNA (или другой неперекрывающихся глушителей триггер) против цели, определенные в начальной экраны должны быть использованы. Же анализ и считывания должна применяться как для основного экрана.
- В конечном счете выбранных генов может быть проверена межвидовой RNAi спасения 9. Таким образом бактериальные искусственные хромосомы (BAC) кодирования, например, мыши ортолога ген стабильно трансфицированных в клетки. BAC-конструкты сохранить геном в его геномной контекста и позволяют почти-физиологическое выражение. RNAi против эндогенного гена человека оставят выражение мыши трансгенов неизменным, которая спасает RNAi-фенотипа. RNAi-спасательных обеспечивает золотым стандартом для проверки фенотипы RNAi доступных на сегодняшний день.
- Наконец, проверку кандидатов изучаются более подробно, чтобы в конечном итоге получить механистического понимания. Во многих случаях RNAi могут быть использованы в этих экспериментах, например, в средних, более сложные анализы.
Discussion
РНК-интерференция стала стандартной техникой для изучения потерей функции фенотипы. Масштабные коллекции RNAi-посредники имеются у различных поставщиков и обеспечивает простой, экономически эффективный и быстрый метод генной глушителей. Это открыло ворота для систематического скрининга для ключевых игроков во многих биологических процессов, создавая условия генома масштаба взгляд на широкий диапазон различных видов и типов клеток.
Высокий уровень ложных положительных и ложно отрицательные ставки общий вызов на экранах RNAi. Для решения этой проблемы, значительные усилия были вложены для улучшения эффективности и, в частности, специфику глушителей триггеров. Важным открытием было то, что бассейн различных siRNAs таргетинга же стенограмма значительно расширяет целевую специфику. Потому что очень сложный пул различных siRNAs производится endoribonuclease, esiRNAs высоки триггеры специфичность цели, снижения ложных срабатываний на экранах RNAi. esiRNAs также продемонстрировали, для достижения эффективного нокдаунов, уменьшая также ложно отрицательные ставки.
Потому что RNAi экраны технически сложных, они, вероятно, останется сложным для выполнения на регулярной основе в течение некоторого времени. Однако, как реагенты и приборы лучше и больше лабораторий делиться своим опытом, использование экранов RNAi в современной биологии, как считается, в будущем возрастет.
Disclosures
Авторы заявляют финансовые отношения с коммерческими структурами, которые могут быть заинтересованы в представленной работе.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность членам Бухгольц лабораторных и Sigma-Aldrich RNAi-команды для обсуждения. Мы хотели бы поблагодарить Общество Макса Планка и Bundesministerium für Bildung унд Forschung грандов Go-Био [0315105] за поддержку.
МИССИЯ ® является зарегистрированным товарным знаком компании Sigma-Aldrich биотехнологии LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
