Summary
Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.
Abstract
RNA enterferans (RNAi) gen ekspresyonunun kontrolü için temel bir hücresel mekanizmadır. RNAi küçük müdahale RNA'lar (siRNA) olarak da bilinen kısa çift iplikçikli RNA'lar tarafından indüklenir. Kısa çift iplikçikli RNA'lar Dicer, endonükleazları RNaz III ailesinin bir protein aktivitesini daha uzun çift zincirli öncüleri kaynaklanır. Çıkan parçaları cognate hedef mRNA yönetmenlik, RNA-indüklenmiş susturulması kompleksi (RISC) bileşenleridir. RISC böylece kodlanmış protein 1,2,3 ifade azaltılması hedef mRNA parçalayarak. RNAi küçük müdahale RNA'lar kullanan memeli hücrelerinde gen fonksiyon testleri kaybı için güçlü ve yaygın olarak kullanılan deneysel bir yöntem haline gelmiştir.
Şu anda küçük müdahale RNA'lar üretimi için iki ana yöntem mevcuttur. Bir yöntem, alternatif bir yöntem in vitro RNaz III hedef özgü uzun çift iplikçikli RNA'lar endonucleolytic bölünme istihdam ise kimyasal sentez içerir. Böylece, siRNA-benzeri çeşitli bir havuz oligonükleotidler endoribonuclease hazırlanmış siRNA veya esiRNA olarak da bilinir üretilir. Kimyasal olarak elde edilen siRNA'lar ve esiRNAs etkinliğinin karşılaştırılması, her iki tetikler hedef gen susturulması güçlü olduğunu gösterir. Özgüllüğü karşılaştırarak zaman Farklılıklar, ancak tanık olabilir. Birçok tek kimyasal olarak sentezlenmiş siRNA'lar esiRNAs doğasında karışım daha spesifik bir demonte 10 yol açar ise, önde gelen off-hedef efektler üretir.
Bu çalışmada, genom-ölçekli MİSYON esiRNA kütüphaneleri ve hücre döngüsünün ilerlemesi alan genlerin belirlenmesi için DNA içeriği ekran örneklediği RNAi tarama için kullanımı tasarım mevcut. Biz transfeksiyon protokolü ve yüksek verimlilik tarama testinin nasıl optimize göstermektedir. Biz de istatistiksel olarak değerlendirildi, ne kadar büyük olabilir veri setlerini göstermek ve birincil hit doğrulamak için yöntemler mevcut. Son olarak, valide vurur daha fazla fonksiyonel nitelendirmeler için potansiyel başlangıç noktalarını verir.
Protocol
1. Yüksek kaliteli MİSYON esiRNA kütüphaneler
- Ilgi her gen için DEQOR algoritma (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) kullanan RNAi için en duyarlı ve spesifik bir hedef bölge seçilen 4 DEQOR puanları tüm susturma potansiyeli state-of-sanat tasarım kısıtlamaları 4 dayalı bir hedef-mRNA mümkün 21 nükleotidler uzun siRNA'lar. Buna ek olarak, her bir potansiyel siRNA okudu organizmanın transcriptome karşı BLAST arama yaparak diğer genlerin olası çapraz reaktivite açısından analiz edilir. Bu program, böylece genel kalitesi ve potansiyel esiRNA (300-600 bp uzunluğunda) çapraz susturulması kapasiteleri bir analiz sağlar.
- CDNA hedef genin seçtiğiniz bölge bakteriyofaj RNA polimeraz-organizatörü dizileri ile çevrili gen-spesifik primerler kullanılarak PCR ile yükseltilir.
- MİSYON esiRNA üretimi için kullanılan her bir PCR ürünü kaliper Labchip analiz, sıralama tarafından kimlik ve saflık doğrulandı.
- Uzun çift iplikli RNA, RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu ipliklerini tavlama takip PCR ürün transkripsiyonu.
- esiRNAs Q-sepharose dönüş sütunlarını kullanarak anyon değişim kromatografisi ile saflaştırılması tarafından takip RNaseIII kullanarak uzun çift iplikli RNA sınırlı enzimatik sindirimi tarafından hazırlanmıştır.
- esiRNAs çöktürülmüş ve TE tamponunda yeniden süspanse. Verimi UV-emme ölçümleri ile ölçülür ve konsantrasyonu TE tamponu uygun bir hacim içinde eriterek ayarlanır. Nihai ürünün genel kalitesini kaliper Labchip analizi ile kontrol edilir.
2. Bir hücre hattı seçimi ve tarama için optimize transfeksiyon
- Titre esiRNA (pozitif ve negatif kontrol olarak renilla lusiferaz olarak kullanılması Eg5) ve 384 plaka transfeksiyon reaktif miktarları artan miktarda, hücre ve 48 saat süreyle inkübe ekleyin. Eg5 bipolar mili montaj ve tükenme için gerekli bir kinesin motor proteindir mitotik tutuklanmasına yol açar. Farklı transfeksiyon ayıraçları ve hücre hatları için bu yordamı tekrarlayın. Burada, transfeksiyon reaktif gibi standart prosedürler ve oligofectamine (Invitrogen) kültürlü HeLa hücreleri kullanır.
- Optimal transfeksiyon koşulları seçimi için bir mitotik arrest (yuvarlak) ve renilla lusiferaz (RLUC) esiRNA ışık mikroskobu ile transfekte hücrelerin toplam sayısı gösteriyor Eg5 esiRNAs transfekte hücreler sayılır. RLUC için en az toksisite ve Eg5 için en belirgin fenotip durumu seçin.
Transfeksiyon koşulları optimize etmek için alternatif bir yöntem EGFP (veya uygun başka bir muhabir geni) kurucu aktif organizatörü kontrol altında ifade istikrarlı bir hücre hattı içerir. EGFP (veya başka bir muhabir geni) ve RLUC (veya başka bir uygun negatif kontrol esiRNA) örneğin floresan destekli cep sıralama (FACS) ile ölçü knock-down etkinlik ve toksisite karşı esiRNA transfeksiyon sonra. EGFP için kullanılan esiRNA hedef mRNA tamamen tamamlayıcı olduğundan emin olun.
3. İlköğretim ekran 5,6 Kurma
- Pipetleme doğruluğu otomatik pipetleme istasyonu (örneğin, Kova, Tecan ve WellMate, Matrix) tüm bileşenleri için optimize edin. Pipetleme parametreleri çözüm, hacim ve plaka tipi türüne bağlı olarak değişir Bu nedenle optimizasyon her adımı için ayrı ayrı tekrarlanmalıdır. Mümkünse, pipetleme istasyonu Bulaşmayı önlemek için laminer akış kaputun altında yer olmalıdır. Tüm kullanılan bileşenler varsa otoklavlanarak veya% 75 etanol ile püskürterek birini kullanmadan önce sterilize edilmelidir. Kuyudan çapraz kontaminasyon hariç böylece yıkama protokolleri optimize edin. Optimizasyonu için otomatik pipetleme Ayrıntılar alan kısıtlamaları vermek ve büyük ölçüde kullanılan pipetleme istasyonu bağlı olamaz. Daha fazla bilgi için protokol üretmektedir bakın.
- Eg5 ve RLUC esiRNAs yukarıda optimize koşulları kullanarak 384-well formatında Transfect hücreleri. Eg5 ve RLUC esiRNA için bütün plaka kapsayan bir alternatif desen kullanın.
- 48 saat inkübasyon soğuk% 100 etanol ile hücreleri düzelttikten sonra, 1 mcg / ml DAPI ve 100 mg / ml RNaz A (Qiagen) içeren PBS ile 25 dakika leke, 15 dakika süreyle PBS içinde rehidrate. Son olarak 4 PBS ve mağaza ile yıkayın ° C
- DAPI-floresan mikroskopi örneğin Olympus ScanR sistemi Tedbir yoğunluğu. Hücre sayısı karşı DAPI yoğunluğu planladığı bir histogram oluşturun ve G1-faz için DNA içeriği 2N hücrelerin yüzdesi hesaplanarak hücre döngüsü dağıtım değerlendirmek; <2N> S-faz için 4N; G2/M-phase için 4N > anöploidi / poliploidi 4N.
- Homojenliği plaka üzerinde sonuçları değerlendirin. Konum effe dışlamak için önemli bir farklılık daha fazla optimizasyon gereklicts. Çok iyi plakaları kullanarak yaygın bir sorun, inkübasyon süresi sırasında kenar kuyularında gelişmiş buharlaşma. Bu genellikle plaka pozisyonu belirli etkileri çevirir farklı kuyular, farklı deneysel koşullar yol açar. Bu nedenle, boş bir ekran için tüm kenar kuyular terk tavsiye ederiz. Daha sonra buharlaşma inkübatörler yüksek nem muhafaza emin olun en aza indirmek için. Ayrıca rutin buharlaşma blok Corning Nefes Sızdırmazlık Tape gibi buharlaşma engelleri istihdam. Ayrıca diğer kaynaklar konumunu etkiler, göz okuma sistemi örneğin teknik varyasyonu (mikroskop, plaka okuyucu, vb.) Ya da sıvı taşıma varyasyonlar (degradeler, homojen çözüm, vb) içine alınmalıdır.
- Pozitif ve negatif kontroller arasında istatistiksel farklılık istihdam edilen testin önemi bir ölçü sağlar. Negatif kontrol (veya arka plan gürültüsü, mock-kontrol) arasında büyük bir fark ve örnek gerçek tarama başlatmadan önce kurulmuş olması gerekir. Istatistiksel anlamlılık için iyi bir önlem Z-faktördür. Z-faktör denklemi aşağıdaki şekilde hesaplanır:
Z = 1 - (3 SD [örnek] + 3 SD [alay]) * (| Av [örnek] - Av [alay] |) -1 SD: standart sapma, ortalamanın Av. A dan Z ye 1-faktör> Z> 0.5, negatif kontrol, pozitif kontroller 7 istatistiksel olarak anlamlı bir ayırma (gürültü) gösterir .
4. Birincil ekran
- Yukarıdan optimize koşullar kullanan esiRNAs transfeksiyon 384-iyi doku kültürü tabak hazırlayın. Burada, her iyi 5μl TE tampon içinde çözünmüş 15ng esiRNA kullanın. Plaka başına en az sekiz kontrol pozisyonları incelenen biyolojik bir süreç için uygun pozitif ve negatif kontroller (Eg5 ve RLUC) yüklü olmalıdır. Kenarına kuyu önlemek konumunu etkiler sadece 5μl TE tamponu ile yüklenir.
- 5μl OptiMEM (Invitrogen) yanı başına 0.2μl Oligofectamine içeren ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
- 72 saat hücre süspansiyonu ve inkübe;: (1000 hücre başına eşdeğer bir HeLa hücre süspansiyonu 25 hücre / ml konsantrasyonu 40μl) transfeksiyon karışımı üzerine ekleyin.
- Otomatik bir mikroskop (Olympus ScanR, yukarıya bakınız) DNA içeriği ölçün. Z-skoru, referans olarak negatif kontrol için sinyal kullanarak tüm numune esiRNAs hesaplanır: isabet seçim Z-skoru istatistikleri kullanarak değerlendirin. Not, Z-skoru Z-faktör olarak aynı değildir. Z-skoru (sahte) kontrol ile karşılaştırıldığında istatistiksel bir ölçüsüdür örnek değerler önemi sağlar. Bu denklemi şu şekilde hesaplanır:
Z = (değer [Örnek] - ortalama [alay]) * standart sapma [alay] -1.
Hit seçimi için bir eşik uygulanmak zorundadır. Tipik olarak, bir önemi kriterler: 2 <Z <-2, ancak veri kalitesine bağlı olarak, biyolojik bir süreç ya da sadece ekran kapsamında incelenir, farklı eşikleri geçerli olabilir. Oldukça kolay Z-skoru istatistikleri yanı sıra aynı zamanda daha ayrıntılı matematiksel değerlendirme yöntemleri kullanılabilir (tarama verilerinin istatistiksel değerlendirme geniş bir alana ilk iç Malo et al bulunabilir 8 ).
5. İkincil ekran ve hit doğrulama
- İkincil ekran nedeniyle yanlış pozitif deneysel hatalar ya da off-hedef etkilerini ortadan kaldırmak için birincil ekran izler. Seçilen hit için birincil ekran olarak kullanılan aynı prosedürü daha iyi bir istatistik değerlendirme izin çoğaltır, daha büyük bir sayı (3-5) tekrar edilmelidir.
- Doğrulanmış hit için ilk ekranlarında belirlenen hedeflere karşı ikincil bir örtüşmeyen esiRNA (veya başka bir örtüşmeyen susturulması tetik) kullanılmalıdır. Aynı tahlil ve okuma-out birincil ekran olarak uygulanmalıdır.
- Sonuçta seçilen genler, türler arası RNAi kurtarma 9 doğrulanabilir . Böylece örneğin bir bakteri geni fare orthologunu yapay kromozomu (BAC) kodlama stably hücrelerine transfekte. BAC-genomik bağlamda bir gen yapıları korumak ve neredeyse fizyolojik bir ifade için izin. Endojen insan gen karşı RNAi RNAi-fenotip kurtarır fare transgen ifadesi değişmeden bırakacaktır. RNAi-kurtarma, bugüne kadar RNAi fenotipleri doğrulanması için altın standart sağlar.
- Son olarak, doğrulanmış adaylar sonunda mekanistik anlayış elde etmek için daha ayrıntılı olarak incelenmiştir. Birçok durumda RNAi ikincil, daha ayrıntılı testlerin, örneğin, bu deneylerde kullanılan olabilir.
Discussion
RNA girişim-fonksiyon kaybı fenotipleri incelemek için standart bir teknik haline gelmiştir. RNAi mediatörlerin Büyük ölçekli koleksiyonları farklı tedarikçilerden mevcuttur ve gen susturulması için kolay, maliyet-etkin ve hızlı bir yöntem sağlamak. Bu farklı türler ve hücre türleri geniş bir yelpazede bir genom ölçekli bir bakış açısı sağlayan birçok biyolojik süreçlerde anahtar oyuncular için sistematik tarama için kapı açtı.
Yüksek yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları RNAi ekranlarında ortak bir meydan okuma. Bu sorunu çözmek için, etkinliğini artırmak için önemli çabalar yatırım ve özellikle de sessizliğini özgüllüğü tetikler edilmiştir. Önemli bir keşif aynı transkript hedefleyen farklı siRNA'lar bir havuz hedef özgüllüğü büyük ölçüde artırdığını oldu. Çok karmaşık, farklı siRNA'lar bir havuz endoribonuclease tarafından üretilen olduğundan, esiRNAs RNAi ekranlarında yalancı pozitiflik oranı azaltmak, yüksek hedef özgüllüğü tetikler. esiRNAs aynı zamanda da yanlış negatif oranının azaltılması, etkili knockdowns ulaşmak için göstermiştir.
RNAi ekranları teknik olarak zor olduğundan, muhtemelen bir süre için bir rutin olarak gerçekleştirmek zor kalacaktır. Ancak, reaktifler ve araçlar daha iyi ve daha laboratuvarlar kendi uzmanlık pay almak, modern biyolojinin RNAi ekranların kullanımı gelecekte artırmak için kabul edilir.
Disclosures
Yazarlar sunulan iş bir ilgi olabilir ticari kuruluşlar ile mali ilişkileri beyan ederim.
Acknowledgments
Biz tartışma için Buchholz laboratuar ve Sigma-Aldrich RNAi ekibi üyeleri kabul etmek istiyorum. Max-Planck-Society ve Bundesministerium für Bildung und Forschung grands destek için [0315105]-Bio teşekkür etmek istiyorum.
MİSYON ® Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP tescilli markasıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
