Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66017
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים הדמיה חדשה של הר שלם להדמיית מבנים היקפיים בעדשת העין עם שיטות לכימות תמונה. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש במחקרים כדי להבין טוב יותר את הקשר בין מבנים מיקרוסקולריים של עדשה לבין התפתחות/תפקוד עדשה.

Abstract

עדשת העין היא רקמה גמישה שקופה המשנה את צורתה כדי למקד אור ממרחקים שונים על הרשתית. מלבד קרום מרתף המקיף את האיבר, הנקרא קפסולה, העדשה היא תאית לחלוטין המורכבת משכבה אחת של תאי אפיתל בחצי הכדור הקדמי וממסה גדולה של תאי סיבי עדשה. במהלך החיים, תאי אפיתל מתרבים באזור הנביטה בקו המשווה של העדשה, ותאי אפיתל משווניים נודדים, מתארכים, ומתמיינים לתאי סיבים שזה עתה נוצרו. תאי אפיתל משווניים משנים באופן משמעותי את המורפולוגיה מתאים בצורת אבן מרוצפת דחוסה באופן אקראי לתאים מיושרים בצורת משושה היוצרים שורות מרידיונליות. תאי סיבי עדשה חדשים שנוצרו שומרים על צורת התא המשושה ומתארכים לכיוון הקוטב הקדמי והאחורי, ויוצרים קליפה חדשה של תאים המונחים על דורות קודמים של סיבים. מעט ידוע על המנגנונים המניעים את המורפוגנזה יוצאת הדופן של תאי אפיתל עדשה לתאי סיבים. כדי להבין טוב יותר את מבנה העדשה, התפתחותה ותפקודה פותחו פרוטוקולי הדמיה חדשים כדי לדמות מבנים היקפיים באמצעות תושבות שלמות של עדשות עיניים. כאן מוצגות שיטות לכימות עובי הקפסולה, שטח תא אפיתל, אזור וצורה גרעיניים של התא, סדר ואריזה של תאי שורה מרידיאליים ורוחב תאי סיבים. מדידות אלה חיוניות להבהרת השינויים התאיים המתרחשים במהלך צמיחת העדשה לכל החיים ולהבנת השינויים המתרחשים עם הגיל או הפתולוגיה.

Introduction

עדשת העין היא רקמה גמישה ושקופה הממוקמת באזור הקדמי של העין ומתפקדת למיקוד עדין של האור על הרשתית. ניתן לייחס את יכולתה של העדשה לתפקד, בין השאר, לארכיטקטורה המורכבת שלהולארגון 1,2,3,4,5,6. סביב רקמת העדשה נמצאת הקפסולה, קרום מרתף חיוני לשמירה על מבנה העדשה ותכונות ביומכניות 7,8,9. העדשה עצמה היא תאית לחלוטין, ומורכבת משני סוגי תאים: תאי אפיתל ותאי סיבים. שכבת האפיתל מורכבת משכבה אחת של תאים קובואידים המכסים את ההמיספרה הקדמית של העדשה10. במהלך החיים, תאי האפיתל מתרבים ונודדים לאורך קפסולת העדשה לכיוון קו המשווה של העדשה. תאי אפיתל קדמיים הם שקטים ומרוצפים בחתך רוחב, וליד קו המשווה של העדשה, תאי אפיתל מתרבים ומתחילים לעבור את תהליך ההתמיינות לתאי סיבים חדשים11,12. תאי אפיתל משווניים הופכים מתאים ארוזים באופן אקראי לשורות מרידיונליות מאורגנות עם תאים בצורת משושה. צורת התא המשושה נשמרת בצד הבסיסי של תאים מתמיינים אלה בעוד הצד האפי מתכווץ ומעוגן בנקודת המשען של העדשה או modiolus 4,13,14,15. כאשר תאי האפיתל המשווני מתחילים להתארך לתאי סיבים שזה עתה נוצרו, הקצוות האפיקליים של התאים נודדים לאורך פני השטח האפיקליים של תאי אפיתל קדמיים לכיוון הקוטב הקדמי בעוד שקצות הבסיס נעים לאורך קפסולת העדשה לכיוון הקוטב האחורי. דורות חדשים של תאי סיבים מכסים את הדורות הקודמים של תאים, ויוצרים קליפות כדוריות של סיבים. במהלך תהליך התארכות והתבגרות התא, תאי סיבים משנים באופן משמעותי את המורפולוגיה שלהם 11,12,16. תאי סיבים אלה מהווים את עיקר מסת העדשה 11,12,16,17,18.

המנגנונים המולקולריים התורמים לביסוס מיקרו-מבנים מורכבים של עדשות, מורפולוגיה של תאים וארגון תאי ייחודי אינם ידועים לחלוטין. יתר על כן, תרומת קפסולת העדשה ומבנה התא לתפקוד הכולל של העדשה (שקיפות, שינוי צורת העדשה) אינה ברורה. עם זאת, יחסים אלה מובהרים באמצעות מתודולוגיית הדמיה חדשה והערכות כמותיות של תכונות מבניות ותאיות של עדשה 2,4,19,20,21,22. פותחו פרוטוקולים חדשים להדמיית עדשות שלמות המאפשרים הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה של קפסולת העדשה, תאי אפיתל ותאי סיבים היקפיים. זה כולל מתודולוגיה לכימות עובי הקפסולה, גודל התא, גודל גרעין התא ומעגליותו, סדר שורות מרידיונאלי, אריזת תאי סיבים ורוחב תאי סיבים. שיטות ויזואליזציה וכימות תמונה אלו מאפשרות בדיקה מורפומטרית מעמיקה ויש להן יתרונות על פני שיטות הדמיה אחרות (הדמיה של תושבות שטוחות או קטעי רקמות) על ידי שמירה על מבנה רקמה תלת ממדי כולל. שיטות אלה אפשרו לבחון השערות חדשות ויאפשרו המשך התקדמות בהבנת התפתחות תבנית תאי העדשה ותפקודם.

עבור הניסויים הבאים, אנו משתמשים בעכברי בר ועכברי Rosa26-tdTomato טנדם עגבנייה (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (מעבדות ג'קסון) ברקע C57BL/6J בין הגילאים 6 ל-10 שבועות, משני המינים. עכברי tdTomato מאפשרים הדמיה של קרומי פלזמה תאיים בעדשות חיות באמצעות ביטוי של חלבון tdTomato המאוחה לחומצות האמינו N-terminal 8 של חלבון MARCKS שעבר מוטציה ותוקף את קרום הפלזמה באמצעות N-terminal myristylation ואתרי ציסטאין-פלמיטוילציה פנימיים23. אנו משתמשים גם בעכברי NMIIAE1841K/E1841K 24 שהתקבלו במקור מד"ר רוברט אדלשטיין (המכון הלאומי ללב, ריאות ודם, המכונים הלאומיים לבריאות, בת'סדה, MD). כפי שתואר קודם לכן20, עכברי NMIIAE1841K/E1841K ברקע FvBN/129SvEv/C57Bl6 שיש להם אובדן של חלבון נימה בינוני חרוזים CP49 (שומר על מורפולוגיית תאי סיבים בוגרים וביומכניקה של עדשה שלמה), מוצלבים לאחור עם עכברי בר מסוג C57BL6/J. סקרנו את הצאצאים לנוכחות של אלל CP49 מסוג פראי.

הדמיה קונפוקלית בוצעה במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי סורק לייזר עם הגדלה של 20x (NA = 0.8, מרחק עבודה = 0.55 מ"מ, זום 1x), 40x (NA = 1.3 מטרת שמן, מרחק עבודה = 0.2 מ"מ, זום 1x), או 63x (NA = 1.4 מטרת שמן, מרחק עבודה = 0.19 מ"מ, זום 1x). כל התמונות נרכשו באמצעות גודל חור סיכה, שהוא דטרמיננטה של עובי חתך אופטי, ליחידה אוורירית אחת (העובי האופטי המתקבל מצוין במקרא האיור). התמונות עובדו בתוכנת זן. התמונות יוצאו לפורמט .tif ולאחר מכן יובאו לתוכנת FIJI ImageJ (imageJ.net).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עכברים שוכנים במתקן בעלי חיים של אוניברסיטת דלאוור, המתוחזקים בסביבה נטולת פתוגנים. כל ההליכים בבעלי חיים, כולל המתת חסד על ידי שאיפת CO2 , נערכו בהתאם לפרוטוקולים מאושרים של בעלי חיים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דלאוור (IACUC).

1. הכנה והדמיה של תושבת עדשה שלמה

  1. קיבוע עדשות להדמיית הרכבה שלמה
    1. לאחר המתת חסד, לחנך את העיניים ולנתח עדשות כפי שתואר קודם25. לאחר הנתיחה, יש להעביר את העדשות מיד לתמיסת מלח חוצצת 1x פוספט טרי (PBS; 1.1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3.0 mM Na2HPO 4-7H 2O; pH 7.4) בטמפרטורת החדר.
      הערה: מורפולוגיה תאית עשויה להשתנות אם עדשות מאוחסנות PBS לתקופה ממושכת של זמן, לכן, מומלץ לתקן מיד בתוך ~ 10 דקות של דיסקציה.
    2. להדמיה מלאה של האזור הקדמי של העדשה, תקן עדשות שלמות על ידי טבילה של 0.5 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) טרי ב-PBS 1x בצינור מיקרוצנטריפוגה בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, שטפו את העדשות 3x (5 דקות לכל כביסה) עם PBS אחד. המשך לשלב 1.2 או אחסן ב- PBS 1x ב- 4 ° C. עדשות קבועות ניתן לאחסן עד 5 ימים.
    3. להדמיה בהרכבה מלאה של האזור המשווני של העדשה, תקן עדשות שלמות על ידי טבילה של 0.5 מ"ל של 4% PFA טרי ב-1x PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, יש לשטוף את העדשות 3x (5 דקות לכל כביסה) עם PBS אחד. המשך לשלב 1.3 או אחסן ב- PBS 1x ב- 4 ° C. עדשות קבועות ניתן לאחסן עד 5 ימים.
  2. תושבת שלמה של אזור העדשה הקדמית (קבוע או חי)
    1. להדמיה בהרכבה מלאה של עדשות קבועות, המשך לשלב 1.2.3.
    2. להדמיה מלאה של עדשות חיות, יש להעביר את העדשות לבאר של צלחת 48 בארות המכילה 1 מ"ל של Medium 199 (נטול פנול אדום) המכיל 1% אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית. יש לדגור על עדשות בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 עד להדמיה. לפני ההדמיה, יש לדגור על עדשות בתמיסה המכילה Wheat Germ Agglutinin (WGA-640, 1:500) עם תווית פלואורסצנטית ו-Hoechst 33342 (1:500) ב-Medium 199 למשך 10 דקות לפחות. המשך לשלב 1.5.
    3. כדי להכתים את כמוסת העדשה, F-אקטין וגרעיני עדשות קבועות, יש להניח את העדשות בתמיסה של 500 μL המכילה WGA-640 (1:500), רודמין-פלואידין (1:50) ו-Hoechst 33342 (1:500) במאגר חדירה/חסימה (1x PBS המכיל 0.3% טריטון, 0.3% אלבומין בסרום בקר (חלק V) ו-3% סרום עיזים) בצינור מיקרוצנטריפוגה. יש להכתים עדשות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
    4. לאחר הדגירה של הלילה, יש לשטוף את העדשות 3x (5 דקות לכל שטיפה) עם 1 מ"ל של 1x PBS. המשך לעדשות הדמיה.
    5. כדי לייצב את העדשה הקבועה לצורך הדמיה קונפוקלית, צרו דיבוטי אימוביליזציה של עדשה באגרוז על צלחת הדמיה כפי שתואר קודם לכן21 (איור 1).
      1. מחממים ומערבבים בעדינות 2% אגרוז ב-PBS באמצעות מיקרוגל עד לתמיסה. פיפטה 250 μL של אגרוז נוזלי 2% לתוך צלחת תחתית זכוכית (איור 1A) ולשטח את האגרוז על פני הצלחת באמצעות כיסוי פלסטיק גמיש (איור 1B). לאחר שהאגרוז מקורר ומתמצק במלואו, הסירו את הכיסוי באמצעות מלקחיים עדינים (איור 1C) והשתמשו בניקוב ביופסיה של 3 מ"מ כדי ליצור חור באגרוז במרכז הצלחת (איור 1D).
      2. הסירו את עודפי האגרוז באמצעות מגבון משימה עדין (איור 1E). יש לשמור על עובש אגרוז לח עם 1x PBS ולשמור על טמפרטורה של 4°C עד לשימוש. תבניות Agarose אוחסנו בהצלחה עד שבוע אחד.
    6. באמצעות מלקחיים עובריים, העבירו בעדינות את העדשה החיה או הקבועה לדיווה באגרוז (איור 1F), המכילה ~2 מ"ל של 1x PBS (עדשה קבועה) או פנול ללא אדום Medium 199 (עדשה חיה), ולאחר מכן הניחו את המנה על שלב מיקרוסקופ הפוך. כדי לוודא שהעדשה ממוקמת כשהאזור הקדמי פונה למטרה, דמיינו צביעת גרעינים. אם לא נצפים גרעינים, האזור האחורי עשוי להיות מול המטרה.
    7. כדי להפוך את העדשה, השתמש במלקחיים מעוקלים וסובב בעדינות את העדשה ~ 180° כך שהאזור הקדמי פונה למטרה. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
    8. להדמיה של קפסולות עדשה, רכשו תמונות z-stack באמצעות מטרה של 40x עם גודל צעד של 0.3 מיקרומטר. רכוש את התמונה הראשונה לפני פני השטח של קפסולת העדשה (מסומן על ידי צביעת WGA) ואת התמונה האחרונה לאחר פני השטח האפי של תאי האפיתל. כדי להמחיש תאי אפיתל, רכוש תמונות מחסנית z באמצעות מטרה של 63x עם גודל צעד של 0.3 מיקרומטר להדמיה של תאי אפיתל עדשה.
      הערה: פרמטרים אלה של מיקרוסקופ מאפשרים שחזור תלת ממדי (3D) הולם של תמונות החיוני לכימות התמונה של עובי הקפסולה או שטח תא האפיתל. כמו כן, ניתן לבצע הדמיה של תפרים בעדשות tdTomato בעדשה חיה על ידי הדמיה מעבר לחד-שכבה של תאי אפיתלכפי שתואר קודם 4.
  3. עדשה אפיתל משווני וצביעת תאי סיבים
    1. הניחו עדשות קבועות בתמיסה של 0.5 מ"ל של רודאמין-פלואידין (1:300), WGA-640 (1:250) ו-Hoechst 33342 (1:500) בתמיסת חדירה/חסימה (3% BSA, 3% סרום עיזים ו-0.3% טריטון) בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
    2. לאחר דגירה של לילה, יש לשטוף את העדשות 3x ב-1 מ"ל 1x PBS (5 דקות לכל כביסה).
    3. צור טריזי אגרוז אימוביליזציית עדשה כמתואר לעיל 4,10.
      1. בקצרה, צרו טריזי אגרוז בכלים עם תחתית זכוכית (FD35-100, WPI) על-ידי מזיגת ~5-6 מ"ל של אגרוז מותך 2% ב-PBS 1x לתוך כלים (איור 2A). ברגע שהאגרוז מתמצק (איור 2B), צרו דיוות משולשות עם להב חד (איור 2C). הסירו את טריז האגרוז והכניסו 1 מ"ל של 1x PBS לתוך צלחת האגרוז (איור 2D).
      2. שאפו כל שארית אגרוז שעלולה להישאר מאחור מחיתוך האגרוז. ניתן ליצור טריזים מרובים לכל צלחת כדי להתאים למספר גדלים שונים של עדשות (לא מוצג). לאחסון תבנית האגרוז, יש להניח 1 מ"ל של 1x PBS על תבנית האגרוז ולשמור על טמפרטורה של 4°C. ניתן לשמור טריזים עד שבוע.
    4. באמצעות פינצטה מעוקלת, הניחו את העדשה בתוך טריז אגרוז המכיל 1 מ"ל של 1x PBS וכווננו כך שהאזור המשווני של העדשה פונה כלפי מטה אל זכוכית המיקרוסקופ מעל המטרה הקונפוקלית (איור 2E-F). כדי לוודא שהאזור המשווני נמצא במיקוד, דמיינו גרעינים וודאו שהגרעינים מיושרים בשורות בקו המשווה. ניתן לזהות את תאי האפיתל המשווניים גם מכיוון שהם ארוזים ומעוצבים באופן לא סדיר. כמו כן, תאי השורה המרידיונלית מיושרים במדויק ובצורת משושה, המסומנים על ידי צביעת F-actin בקרומי התא.
    5. אם גרעינים בשדה הראייה ארוזים באופן אקראי, הצד הקדמי של העדשה פונה למטרה. אם לא ניתן להבחין בגרעין, סביר להניח שהצד האחורי של העדשה פונה למטרה. אם העדשה אינה יושבת על קו המשווה שלה, כוון מחדש את העדשה, והשתמש בפינצטה המעוקלת כדי לסובב את העדשה עד לזיהוי הגרעינים המיושרים במדויק בקו המשווה של העדשה.
    6. דמיינו את תאי האפיתל והסיבים המשווניים של העדשה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר (20x objective, NA = 0.8, step size 0.5 μm ו/או 40x oil objective, NA = 1.3, step size 0.4 μm). סובב את התמונות לפני אוסף ערימת z, שבו תאי אפיתל משווניים נמצאים בחלק העליון, ואחריו שורה מרידיונלית ותאי סיבים ממש מתחת.

2. מתודולוגיית ניתוח תמונה

  1. מדידת עובי כמוסת עדשה
    1. באמצעות תמונות z-stack המתקבלות עם מטרה של 40x (גודל צעד של 0.3 מיקרומטר) של עדשות tdTomato חיות המסומנות ב- WGA או עדשות קבועות המסומנות ב- WGA ו- rho-phalloidin, קבל הקרנה דו-ממדית אופטית בתצוגת XZ של שחזור התלת-ממד ושמור בפורמט .tif. עבד תמונות באמצעות תוכנת זן.
    2. פתח XZ פרוסה (.tif) תמונות בתוכנת FIJI ImageJ.
    3. כדי למדוד את עובי כמוסת העדשה, השתמשו בפונקציית הקו הישר (המתוארת באיור 3A,B). הגדר את רוחב הקו ל- 50 פיקסלים על-ידי בחירה באפשרות ערוך אפשרויות > > רוחב קו. רוחב קו זה נקבע אמפירית כדי לספק יחס אות לרעש גבוה עם הגדרות המיקרוסקופ. רוחב הקו האופטימלי עשוי להשתנות בהגדרות אחרות של מיקרוסקופ/מיקרוסקופ או בעת שימוש בעדשות ממינים אחרים. לאחר מכן, ציירו קו מהמשטח העליון של הקפסולה אל מתחת לאזור הבסיס של תאי האפיתל.
    4. שמור את הקו כאזור עניין על-ידי הקשה על Ctrl + T.
    5. הפרד ערוצים לכרטיסיות עבור תמונה, צבע וערוצים מפוצלים.
    6. מדוד את העוצמה לאורך הקו עבור ערוץ הקפסולה על ידי הקשה על Ctrl + K.
    7. בגיליון אלקטרוני, ערכי עוצמת התווך כפונקציה של המרחק וקובעים שיאי עוצמה עבור הקפסולה ו- F-actin, המייצגים את פני השטח של הקפסולה ואת האזור הבסיסי של תאי אפיתל, בהתאמה. על ציר x הוא מרחק הקו.
    8. לאחר מכן, חשבו את עובי הקפסולה על-ידי קביעת המרחק בין שיאי העוצמה הפלואורסצנטית של הקפסולה והאפיתל (איור 3C, D).
  2. ניתוח אזור התא
    1. באמצעות תמונות z-stack המתקבלות באמצעות עדשה אובייקטיבית 63x (NA = 1.4; גודל צעד של 0.3 מיקרומטר) על עדשות tdTomato חיות או עדשות קבועות המסומנות בפאלואדין, נתח פרוסת תצוגת XY מתמונה קונפוקלית של ערימת z המתאימה למקום שבו האזור האמצעי (לרוחב) של תאי אפיתל נמצא במיקוד. שימו לב שהקרומים הרוחביים נראים לעין באמצעות צבע קרום tdTomato או על ידי הדמיה של פלואדין הנמצאים בקרומי התאים הצדיים.
      הערה: בשל העקמומיות של העדשה (כפי שניתן לראות בתצוגת XZ; איור 4A-C), לא כל תאי האפיתל יהיו בפוקוס בתמונה. האזור האמצעי של האפיתל מתאים לאזור שבו גם קרומי התא הצדיים (איור 4D-E) וגם הגרעינים (איור 4G-I) נמצאים במוקד.
    2. ייצא את התמונה כקובץ .tif ופתח אותה ב- FIJI ImageJ.
    3. לקביעת קנה מידה ב- FIJI ImageJ לצורך ניתוח, השתמשו בכלי קו ליצירת קו באורך סרגל קנה מידה מהתמונה הקונפוקלית.
    4. הקלט את אורך הפיקסלים של הקו ואת אורך סרגל קנה המידה. עבור אל נתח בתפריט סרגל הכלים ובחר קבע קנה מידה. הזן את מספר הפיקסלים שהוא אורך הקו ב- מרחק בפיקסלים וב- מרחק ידוע הזן את האורך הידוע של סרגל קנה המידה.
    5. באמצעות צביעת tdTomato או רודמין-פלואידין כאינדיקציה לגבולות התא, שרטט ידנית אוכלוסיית תאים הממוקדים בתוך התמונה באמצעות הכלי המצולע. עקבו רק אחר תאים שבהם נראים קרומים רוחביים (איור 4E) והימנעו ממעקב אחר תאים גלויים חלקית (כלומר, בקצה התמונות). שמור החזר השקעה על-ידי הקשה על Ctrl+T. עבור אל ערוך בתפריט סרגל הכלים ובחר נקה בחוץ. כעת מדוד את שטח התא הכולל (ROI) על-ידי הקשה על Ctrl + M ב- FIJI ImageJ.
    6. חשב את שטח התא הממוצע על-ידי חלוקת שטח החזר ההשקעה במספר התא הכולל. דרך פשוטה לקבוע את מספר התאים היא על ידי ספירת מספר הגרעינים. עבור אל ערוץ הגרעינים (כחול). בתפריט החזר השקעה, בחר את מיתאר החזר ההשקעה השמור של התאים (איור 4G). נקה מחוץ להחזר ההשקעה על-ידי מעבר אל ערוך ולאחר מכן לחיצה על נקה בחוץ (איור 4H). באמצעות הכלי Multi-point, ספור את הגרעינים על ידי לחיצה על גרעינים בודדים.
  3. ניתוח שטח גרעיני תאי וצורה
    1. לניתוח אזור גרעינים וצורות, נתחו מקטע אופטי של תצוגת מישור XY מתמונה קונפוקלית של מחסנית z המתאימה למקום שבו האזור האמצעי (הצידי) של תאי אפיתל tdTomato נמצא במוקד. נתחו פרוסת מחסנית z מתמונה קונפוקלית שבה האזור הגרעיני הוא הגדול ביותר (איור 5A); זה מייצג את החלק האמצעי של הגרעינים.
      הערה: שימו לב שבשל העקמומיות של העדשה, לא כל הגרעינים יהיו בפוקוס, כפי שניתן לראות בתצוגת XZ (איור 4G ואיור 5A).
    2. בחר תת-אוכלוסייה של גרעינים הנמצאים במוקד ושמור החזר השקעה.
    3. השתמש בפונקציה נקה בחוץ . בתוך החזר ההשקעה, באמצעות כלי הבחירה Freehand (כפתור התפריט הרביעי משמאל), עקבו בזהירות אחר גבולות הגרעינים (איור 5B). שמור כל מעקב גרעיני בחלון החזר ההשקעה על-ידי הקשה על Ctrl+T. רק שרטט גרעינים שבהם ניתן לראות את הגרעינים השלמים, והגרעינים אינם נוגעים זה בזה.
    4. לאחר שכל הגרעינים מסומנים, מדוד את השטח והצורה הגרעיניים של תאים בודדים (כלומר, מעגליות) על-ידי הקשה על Ctrl+M.
    5. העתק והדבק נתונים לתוך גיליון אלקטרוני וחשב את השטח הגרעיני הממוצע ואת המעגליות (איור 5C).
  4. אריזת אפיתל שורה מרידיונלית
    1. כדי למדוד הפרעת שורה מרידיונאלית, רכוש תמונות באמצעות מטרה של 20x (גודל צעד של 0.5 מיקרומטר).
    2. זהה את נקודת המשען/מודיולוס של העדשה בתמונות. נקודת המשען היא האזור שבו הקצוות האפיקליים של תאי אפיתל מתארכים מתכווצים ויוצרים נקודת עיגון במהלך התמיינות תאי סיבים ראשונית והתארכות בקו המשווה. זהו את נקודת המשען בהתבסס על עוצמת F-actin בהירה (מסומנת על-ידי ראש חץ בתצוגת XZ באיור 6A; מסומנת על-ידי קו מקווקו אדום באיור 6B) ושינוי בארגון התא במקטע אופטי יחיד בתצוגת XY.
      הערה: בנוסף, צביעת F-actin הן של האזור הבסיסי והן של האזור האפי של תאי אפיתל ניכרת מעל נקודת המשען, בעוד שרק האזור הבסיסי של התאים המתארכים ניכר מתחת לנקודת המשען (איור 6A). תאי האפיתל שמעל לקו נקודת המשען דחוסים באופן לא סדיר ונוטים ליצור רוזטות, בעוד שתאי הסיבים שמתחת לנקודת המשען מסודרים בשורות מקבילות, המסומנות על-ידי צביעת F-אקטין בהירה בממברנה (איור 6B).
    3. לאחר זיהוי נקודת המשען בעכברים בני חודשיים, בחר את החלק האופטי היחיד ~ 4.5-5 מיקרומטר היקפי לנקודת המשען (לכיוון קפסולת העדשה) במישור XY. מרחק זה נבחר על סמך התצפית שכל גרעיני תאי השורה המרידיונלית בעכברים בני חודשיים נמצאים בפוקוס כאשר הם ~5 מיקרומטר היקפיים לנקודת המשען. שמור את המקטע האופטי היחיד (.tif). פתח את התמונה ב- FIJI.
      הערה: ניתוח זה בוצע רק על עכברים בני חודשיים ולכן לא ניתן להסיק אם מרחק זה משתנה עם הגיל.
    4. לפני ביצוע ניתוח תמונה, הגדר את קנה המידה למיקרומטר ב- ImageJ באמצעות שלב 2.2.2.
    5. שרטט ידנית את כל אזורי השורות המרידיאליות באמצעות כלי הקו החופשי (אזור עניין/ ROI) על-ידי זיהוי יישור גרעיני, כפי שמוצג באיור 7A. שמור החזר השקעה על-ידי הקשה על Ctrl+T. עבור אל ערוך בתפריט סרגל הכלים ובחר נקה בחוץ. מדוד את שטח התא הכולל (ROI) על-ידי הקשה על Ctrl + M ב- FIJI ImageJ.
    6. זהה אזורים של אי סדר המצוינים על ידי צביעת F-actin על ידי מתאר באמצעות כלי הקו החופשי ב- FIJI ImageJ. קריטריונים לאזורים לא מסודרים כוללים הסתעפות של שורות, אריזה לא סדירה ואי יישור של שורות (איור 7B), כפי שמוצג קודם לכן20.
    7. מדוד את האזור הלא מסודר/המתוקן בחלוקה לרמות על-ידי הקשה על Ctrl + M ב- FIJI ImageJ. סכם את השטח הכולל ללא הפרעה בגיליון אלקטרוני.
    8. חלק את השטח הלא מסודר הכולל באזור החזר ההשקעה, ולאחר מכן הכפל ב- 100 כדי לקבל אזור לא מסודר באחוז. אם לא נצפתה הפרעה, מקם ערך של 0% עבור האזור הלא מסודר.
  5. מספר שורה מרידיונלית של תאים שכנים
    1. כדי למדוד את מספר התאים השכנים, השתמשו בתמונות מוכתמות באקטין F שנרכשו עם מטרת שמן של 40x (גודל צעד של 0.4 מיקרומטר).
    2. זהה חתך אופטי (מישור XY) באזור הבסיס של תאי השורה המרידיונלית פנימה מקפסולת העדשה שבה F-אקטין מועשר סביב כל היקף תאי השורה המרידיונלית, כל תאי השורה המרידיאונלית נמצאים בפוקוס ונמצאים באותו מישור.
    3. ספור את מספר התאים הסמוכים שיש לכל תא בשורה מרידיונלית (איור 8). מדוד את האחוז הממוצע של תאים עם שישה תאים סמוכים בגיליון אלקטרוני.
      הערה: קבע את מספר התאים הסמוכים עם מטרה של 20x. עם זאת, קל יותר באופן משמעותי לצפות בצורת המשושה עם מטרה פי 40.
  6. ניתוח תמונה של תאי סיבים משווניים
    1. צלם תמונות קונפוקליות מסוג z-stack של עדשות מוכתמות רודאמין פלואידין עם מטרה של פי 20 (גודל צעד של 0.5 מיקרומטר).
    2. זהה את נקודת המשען כפי שמצוין בשלב 2.4.2. לאחר זיהוי נקודת המשען, בחר מקטע אופטי יחיד. למטרות סטנדרטיזציה ולהשוואה בין עדשות, כמתו את רוחב תאי הסיבים ~10 מיקרומטר פנימה מנקודת המשען במישור XY (איור 9A).
    3. ייצוא תמונות גולמיות ל-FIJI ImageJ. ב- FIJI ImageJ, צייר קו (בדרך כלל ~ 300-400 מיקרומטר) על פני מספר תאי סיבים סמוכים כדי למדוד את המרחק בין פסגות מוכתמות באקטין F (ניתוח סריקת קו; איור 9א; קו ורוד).
    4. השג את עוצמת הפלואורסצנט מעל מרחק סריקת הקו ב- FIJI על-ידי הקשה על Ctrl+K. לאחר מכן, יצא נתונים לגיליון האלקטרוני כדי לחשב את המרחק בין השיא (דוגמה מוצגת באיור 9A-B). זה מתאים לרוחב תאי סיבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קפסולת עדשה קדמית, אזור תאי אפיתל ואזור גרעיני
כדי לנתח את עובי קפסולות העדשה, צבענו קפסולות עדשה, בעדשות חיות או קבועות, עם WGA. זיהינו תאי אפיתל של עדשה על-ידי תיוג קרומים עם tdTomato בעדשות חיות (איור 2A), או באמצעות צביעת רודמין-פלואידין עבור F-actin בקרומי התאים בעדשות קבועות (איור 2B). בהיטל אורתוגונלי (XZ), צביעה עבור WGA ו- tdTomato/rhodamine-phalloidin מאפשרת לנו לבצע ניתוח סריקה משיא לקו שיא של עוצמת פלואורסצנטיות. השיא העיקרי בערוץ WGA מציין את פני השטח הקופסילריים ואילו השיא העיקרי בערוץ tdTomato/rhodamine-phalloidin מציין את האזור הבסיסי של תאי אפיתל. על ידי חישוב המרחק בין פסגות אלה, אנו יכולים לקבל עובי הקופסית. ניתוח סריקת הקו מראה כי כמוסות מעדשה חיה של עכברים בני 9 שבועות היו בעובי של 11.2 מיקרומטר, וקפסולות מעדשה קבועה של עכברים בני 9 שבועות היו בעובי של 12.5 מיקרומטר. עובי הקפסולה שנצפה מייצג ממצאים קודמים 2,4.

הדמיה מלאה של עדשות עכבר טרנסגניות עם תווית tdTomato (או עדשות מוכתמות רודמין-פלואדין; לא מוצגות) מאפשרת הדמיה חיה של מורפולוגיה של תאי אפיתל. ההיטל האורתוגונלי (XZ) מספק מבט צדדי על תא האפיתל של העדשה, בעוד שהתצוגה המישורית (XY) באזורים הצדיים מאפשרת הדמיה של צורת מצולע האפיתל. בעדשות בריאות איננו רואים רווחים בין תאים. אנו יכולים לחשב את שטח התא הממוצע על ידי מעקב אחר אוכלוסיית תאים בתמונה וחלוקת השטח במספר התאים בתוך החזר ההשקעה. מספר התאים נקבע על ידי ספירת מספר הגרעינים המוכתמים על ידי הוכסט בהחזר השקעה נתון. הניתוח מדגים שטח תא ממוצע של 260 מיקרומטר2 אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים 2,4.

צביעת Hoechst של גרעינים מאפשרת גם בדיקה של מורפומטריה גרעינית של תאי אפיתל עדשה בתאי אפיתל. ההטלות האורתוגונליות (XZ) מאפשרות מבט צדדי על גרעינים. התצוגה המישורית (XY) מדגימה את הצורות המעגליות/אליפסואידיות של הגרעינים. גרעיני עקיבה מאפשרים לחשב את השטח הגרעיני של תאים בודדים, ופרמטרים צורניים אחרים כגון מעגליות. הניתוח מדגים שטח גרעיני ממוצע של 64 מיקרומטר2 עם מעגליות ממוצעת של 0.8. ערכים מעגליים קרובים ל-1 מציינים מעגל מושלם, ואילו ערכים המתקרבים ל-0 מצביעים על מורפולוגיה מוארכת יותר.

אריזת תאי אפיתל משווניים, אריזת תאי סיבים משושים ורוחב תאי סיבים
התצוגה המישורית (XY) של האזור המשווני של העדשה מדגימה תאי אפיתל עדשה בצורת משושה וארוזים באופן קבוע המתכנסים לנקודת המשען. נקודת המשען היא המקום שבו הקצוות האפיקליים של תאי אפיתל מתארכים מתכווצים ויוצרים נקודת עיגון במהלך התמיינות ראשונית של תאי סיבים והתארכות בקו המשווה 4,13,14,15 (איור 6B, מסומן בקו מקווקו אדום). נקודת המשען יכולה להיות ממוקמת בהתבסס על צביעת F-אקטין מוגברת היוצרת קו רציף המפריד בין תאי האפיתל המשווניים לבין תאי הסיבים (איור 6B, קו מקווקו אדום). צביעת F-actin בקרומי התאים מדגימה גם שינויים בצורת התא, שבה התאים מתחת לנקודת המשען מיושרים ומסודרים במדויק בשורות מקבילות (איור 6). גרעיני התא מיושרים גם הם מתחת לנקודת המשען.

כדי להמחיש תאי אפיתל בשורה המרידיאונלית של העדשה ותאי סיבים, נבחרה תמונה היקפית של 4.5-5 מיקרומטר לנקודת המשען (לכיוון קפסולת העדשה) במישור XY, שבו מוצג האזור הבסיסי של תאי שורה מרידיונאלית, כפי שתואר קודם לכן20. כדי למדוד הפרעת שורה מרידיונאלית, מתואר אזור עניין (ROI) (איור 7A; תיבה צהובה). שטח החזר ההשקעה בתמונת עדשת wildtype הוא 15,833 מיקרומטר2. מכיוון שאין הפרעה נצפית, אזור אחוז ההפרעה הוא 0. התפקיד הקריטי שממלא מיוזין שאינו שריר IIA (NMIIA) באריזת משושים של תאים באמצעות עכברים עם מוטציה NMIIA-E1841K תואר בעבר20. איור 7A מראה תמונה משוונית מייצגת של עדשת NMIIAE1841K/E1841K כדי להדגים הפרעה בתאי שורה מרידיונלית. החזר ההשקעה על השורה המרידיונלית היה 20,757μm2. לאחר מכן, השטח הכולל של טלאים לא מסודרים היה עקבות. השטח הכולל של אי הסדר היה 3,185 מיקרומטר2. אחוז ההפרעה המחושב נקבע על 15.3% (אזור לא מסודר x 100/החזר השקעה כולל; איור 7B). אחוז זה של אזורים לא מסודרים נמצא בטווח במחקר קודם20.

לאחר מכן, הודגמה בדיקה של אריזה משושה בתאי שורה מרידיונליים מסוג בר20. מכיוון שאקטין F מועשר סביב כל היקף תאי השורה המרידיונלית ובכל ששת הקודקודים של אזורי הבסיס של קרום התא בעדשות מסוג פרא (כלומר, NMIIA+/+), נעשה שימוש בצביעת F-actin כדי להעריך את צורות התאים ואת ארגון האריזה. בתמונה מייצגת 1, התאים סומנו ומספר התאים הסמוכים סביב כל תא נספר. בתמונה 1, לכל עשרת התאים יש שישה תאים סמוכים, מה שמרמז על כך שהתאים האלה מסודרים בארגון אריזת חלת דבש (איור 8). לעומת זאת, בשמונה מתוך 10 תאים (80% מהתאים) יש שישה תאים סמוכים בתמונה 2 שמצביעים על כך שהתאים ארוזים באופן לא סדיר (איור 8).

לבסוף, כדי למדוד את רוחב תא הסיב, נבדקו תאי הסיבים ההיקפיים הממוקמים ~10 מיקרומטר פנימה מנקודת המשען בעדשות קבועות מסוג פרא המסומנות ברודמין-פלואידין (איור 9A)2,4. יש לציין כי ניתן גם למדוד את רוחב תאי הסיבים באמצעות עכברי tdTomato חיים, אולם האות מעדשות הטרוזיגוטיות עבור tdTomato נוטה להיות חלש באזורים המשווניים. לכן, מומלץ להשתמש בעכברים הומוזיגוטיים עבור tdTomato מכיוון שנמצא שיש להם פלואורסצנטיות חזקה יותר (לא מוצגת). המרחק בין גבולות התא המוכתמים באקטין F באמצעות ניתוח סריקת קו נמדד כפי שתואר קודם לכן כדי לציין רוחב תא סיב 2,4 (איור 9B). ניתוח זה גילה כי המרחק הממוצע בין השיא בעדשות מסוג בר הוא 11.45 ± 2.11 מיקרומטר (N=117 תאי סיבים מארבע תמונות שונות של עדשות עכבר, איור 9B).

Figure 1
איור 1: שלבים ליצירת דיוות אגרוז כדי לשתק את העדשה במהלך ההדמיה. (A) בעזרת צלחת תחתית זכוכית, פיפטה נוזלית 2% אגרוז. (B) יש לשטח עם כיסוי גמיש ו-(C) כאשר מקורר, להסיר באמצעות מלקחיים עדינים. (D) עבור הדיבות יש ליצור חור באמצעות ניקוב ביופסיה בקוטר 3 מ"מ. (E) לשאוף שאריות אגרוס, לשטוף עם PBS, לנגב את פני השטח באמצעות רקמה ללא מוך. (F) הרכיבו בזהירות עדשה שלמה בתוך דיוות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צעדים ליצירת אגרוז דיוות עבור הדמיית עדשה, אפיתל משווני ותאי סיבים. (A) יוצקים 2% אגרוז מותך בצלחת תרבית הרקמה. (B) מצננים את האגרוז בטמפרטורת החדר עד שהוא מתמצק לחלוטין. (C) בעזרת להב חד, צור משולש. (D) שים 1 מ"ל של 1x PBS בצלחת תרבית הרקמה. (E) מקם את העדשה המנותחת בטריז כאשר (F) העדשה נשענת על קו המשווה שלה בין דפנות האגרוז (חץ אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: קביעת עובי קפסולת העדשה. Sagittal (X, Z מישור תצוגה) מקטעים אופטיים משחזורים של ערימות z קונפוקליות של (A) חיות ו-(B) קפסולות עדשה קבועה. עוצמה פלואורסצנטית של סריקת קו של (C) עדשות חיות ו-(D) קבועות מדגימה שיא WGA יחיד (ירוק) המתאים לפני השטח העליונים של הקפסולה ולאזור הבסיס של תאי אפיתל (אדום) הסמוך לכמוסה. המרחק בין שתי הפסגות נמדד כדי לכמת את עובי הקפסולה. תמונות שנרכשו באמצעות מטרת שמן 40x עם חור סיכה של יחידה אוורירית אחת וכתוצאה מכך מקטעים אופטיים של 1.0 מיקרומטר ו- 1.2 מיקרומטר בתעלות tdTomato/Rhodamine-Phalloidin ו- WGA, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כימות אזור תאי אפיתל. (A) X, Z מבט מישורי על תאי אפיתל העדשה המסומנים ב-(B) tdTomato עבור קרום התא ו-(C) Hoechst עבור גרעינים. (D) X, Y מבט מישורי של האזור האמצעי של תאי אפיתל העדשה. (E) אות tdTomato משמש כמדריך להגדרת אזור עניין המתאים לקבוצת תאים הנמצאים במיקוד. (ו) ייקבע שטח האזור המוגדר. (G) צביעת Hoechst לגרעינים משמשת לקביעת מספר התאים באזור המוגדר. (H) מספר הגרעינים נספר באמצעות (I) הכלי הרב-נקודתי של FIJI ImageJ. כדי לחשב את שטח התא הממוצע, חלק את השטח הכולל של אזור העניין המוגדר במספר התאים הכולל. תמונות שנרכשו באמצעות מטרת שמן 63x עם חור סיכה של יחידה אוורירית אחת וכתוצאה מכך מקטעים אופטיים של 0.7 מיקרומטר ו- 1.0 מיקרומטר בתעלות Hoechst ו- tdTomato, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: קביעת שטח וצורה גרעיניים. (A) מבט מישורי XY על האזור האמצעי של גרעינים. (B) הוגדר אזור עניין שבו גרעינים נמצאים במוקד. גרעינים בתוך החזר ההשקעה מתוארים. (C) השטח והמעגליות של גרעיני תאים בודדים עברו טבלה וחושבו ממוצעים של שטח ומעגליות. תמונות שנרכשו באמצעות מטרת שמן 63x עם חור סיכה של יחידה אוורירית אחת וכתוצאה מכך קטע אופטי של 0.7 מיקרומטר בתעלת Hoechst. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: זיהוי נקודת המשען של העדשה. ניתן להשתמש ב-F-אקטין ובגרעינים כדי לזהות את נקודות המשען ואת השורות המרידיונליות. (A) תצוגת XZ מציגה צביעת פלואידין מועשרת עבור F-actin המתאימה לנקודת המשען. (B) מקטע תצוגה אופטי יחיד של מישור XY עם נקודת המשען של העדשה בפוקוס. צביעת Hoechst לגרעינים מראה שהגרעינים שמעל נקודת המשען ארוזים באופן לא סדיר ואילו הגרעינים שמתחת לנקודת המשען מיושרים בדיוק (למעלה מימין). צביעת פלואדין עבור F-actin מראה כי התאים מעל נקודת המשען הם בעלי צורה לא סדירה ואילו התאים מתחת לנקודת המשען ארוזים בשורות מקבילות (למטה משמאל). הקו המקווקו האדום מציג את מיקום נקודת המשען. תמונות המתקבלות באמצעות מטרה של 20x עם חור סיכה של יחידה אוורירית אחת וכתוצאה מכך מקטעים אופטיים של 1.5 מיקרומטר, 2.0 מיקרומטר ו-2.2 מיקרומטר בתעלות Hoechst, Rhodamine-Phalloidin ו-WGA-640, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: קביעת הפרעת שורה מרידיונאלית. (A) מקטע אופטי של תצוגת מישור XY יחיד של הטיפוס הפראי ותאי השורה המרידיונליתNMIIA E1841K/E1841K ~ 5 מיקרומטר מנקודת המשען (לכיוון קפסולת העדשה). כל תאי השורה המרידיונלית מסומנים בכחול בהתבסס על יישור גרעיני. צביעת F-actin (אדום) בעדשת wildtype מראה כי תאי שורה meridional מיושרים במדויק ללא סימנים של הפרעה (0%). אזור מסודר מייצג ב- wildtype מסומן (כתום). בעדשות עם תאים לא מסודרים, אנו מתארים את האזורים הלא מסודרים (צהוב). (B) הגדלה גבוהה של אזור מסודר מטיפוס בר (תיבה כתומה ב-A). (C) הגדלה גבוהה של אזורים לא מסודרים המראים סוגים שונים של אי-סדר, כולל (I) הסתעפות של שורות, (II) צורת תא לא סדירה ואובדן אריזת חלת דבש, ו-(III) חוסר יישור של שורות. תמונות מעדשת NMIIAE1841K/E1841K מראות הפרעה של 15.3% בתאי שורה מרידיונלית. תמונות המתקבלות באמצעות מטרה של 20x עם חור סיכה של יחידה אוורירית אחת וכתוצאה מכך מקטעים אופטיים של 1.5 מיקרומטר, ו- 2.0 מיקרומטר בתעלות Hoechst ו- Rhodamine-Phalloidin, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: ניתוח אריזת חלת הדבש של תאי השורה המרידיאונלית של העדשה. (A) מקטעי XY אופטיים בודדים של תאי שורה מרידיונלית מוכתמים ברודמין-פלואידין עבור F-אקטין (F-actin). תמונות בהגדלה נמוכה (החלונית העליונה), מציגות את התאים המוערכים (ממוספרים בוורוד). אזור המסומן בצהוב מוגדל (לוח תחתון). הספרות הרומיות הצהובות הן ספירות של תאים סמוכים. תמונה 1 מציגה תאים שצורתם משושה כולה, שבכל אחד מהם 6 תאים סמוכים. בתמונה 2 יש אי-סדרים, כאשר לתאים מספר 1 ו-5 יש 5 ו-7 תאים סמוכים, בהתאמה. (B) הנתונים נרשמים ומוצגים בטבלה עם אחוז התאים המשושים מחושב. תמונות שנרכשו באמצעות מטרה של 40x עם חור סיכה של יחידה אוורירית אחת וכתוצאה מכך קטע אופטי של 1.0 מיקרומטר בתעלת רודאמין-פלואדין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: ניתוח רוחבי תאי סיבים. (A) מקטע תצוגה אופטי יחיד של XY של תאי סיבי העדשה ~10 מיקרומטר פנימה מנקודת המשען. התאים הוכתמו ברודמין-פלואידין לצורך הדמיה של F-actin בקרומי התא. קו (ורוד; מקף) משורטט על פני מספר תאי סיבים. (B) סריקת קו מייצג של עוצמות F-actin כפונקציה של מרחק. מרחק השיא מייצג את רוחב תא הסיב. תמונות שנרכשו באמצעות מטרה של 40x עם חור סיכה של יחידה אוורירית אחת וכתוצאה מכך קטע אופטי של 1.0 מיקרומטר בתעלות רודאמין-פלואדין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים מאפשרים הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה של מבני ותאים היקפיים של העדשה באזורים הקדמיים והמשווניים של העדשה. במחקר זה הוצגו שיטות להדמיה של מבנים היקפיים של עדשה באמצעות עדשות שלמות (חיות או קבועות) שבהן נשמרת ארכיטקטורת העדשה התלת-ממדית הכוללת. בנוסף, סופקו שיטות פשוטות לניתוח כמותי מורפומטרי באמצעות תוכנת FIJI ImageJ הזמינה לציבור. כל שיטות ההדמיה והכימות של הר שימשו במחקרים קודמים. שיטות אלה אפשרו לנו להבין את התגובה של הקפסולה הקדמית והתאים לשינוי צורת העדשה או הזדקנות 2,4. שיטות אלה שימשו גם כדי לבחון את התרחבות תאי הסיבים המשווניים עקב שינוי צורת העדשה או הזדקנות 2,4 ולקבוע את תפקידה של NMIIA בקביעת צורות משושים מדויקות וארגון תאי סיבים היקפיים20.

הדמיה בהרכבה מלאה מאפשרת רזולוציה מרחבית גבוהה של הדמיית פנים של מבנה העדשה. באזור העדשה הקדמית, הדמיה בהרכבה מלאה מועילה להדמיה בהרכבה שטוחה על ידי מניעת נזק שעלול לשנות את שלמות מבנה הקפסולה ו/או את המורפולוגיה של תאי האפיתל. בנוסף, נשמר הממשק בין תאי אפיתל וסיבים. שיטה זו מספקת יתרונות על פני הדמיה של חלקי עדשה מכיוון שהדמיית פנים מעניקה רזולוציה מרחבית גדולה יותר ומאפשרת ניתוח של שטח תא אפיתל ואזור / צורה גרעיניים האזור שנבחר (כלומר, אמצע צדדי, כפי שמוצג כאן) או אזורים אחרים של תאים. יתר על כן, שיטות ההדמיה מאפשרות לכמת תכונות מורפולוגיות בנקודות ספציפיות לאורך האזורים המשווניים של העדשה, ומאפשרות הדמיה של צורות משושים, אריזת תאי שורה מרידיונאלית, נקודת משען ורוחב תאי סיבים, שלא ניתן יהיה להשיג בקלות באמצעות קטעי עדשה מוכתמים בהדמיה בשל חוסר רזולוציה מרחבית ועיוות רקמות שיכול להתרחש במהלך חתך.

הפרוטוקולים המתוארים מאפשרים גם הדמיה של עדשות חיות כדי לעקוב אחר מבנים ותאים ספציפיים של עדשות לאורך זמן. פרוטוקול הדמיית העדשה החיה סייע במחקר קודם, שבו בוצע ניתוח מדידות חוזרות ונשנות של עובי הקפסולה ואזור תאי האפיתל מתת-אוכלוסייה של תאים מאותה עדשה לפני ואחרי דחיסת העדשה כדי לגרום להשטחת עדשה4. נקבע כי דחיסת העדשה גרמה לירידה בעובי הקפסולה ולעלייה בשטח תאי האפיתל. בשל השונות המשמעותית בעובי הקפסולה ובשטח תאי האפיתל בין עדשות בודדות ועוצמת ההשפעות על פרמטרים אלה הנגרמות על ידי דחיסת עדשה, יהיה קשה לזהות הבדלים אם נעשה שימוש בעיצוב מדידה עצמאי (כלומר, השוואת עדשות בודדות לא דחוסות לעומת עדשות דחוסות בודדות). באמצעות שיטות ההדמיה החיה, בוצעה הדמיה מלאה על עדשות עכבר חיות המבטאות באופן אנדוגני LifeACT-GFP26 כדי להמחיש F-אקטין בתאי אפיתל22, המאפשר מעקב אחר ארגון מחדש של F-actin בתאי אפיתל חיים.

בעוד שהפרוטוקולים המתוארים פותחו עבור עדשות עכבר הדמיה וניתן להתאים אותם כדי להמחיש מבני עדשות במינים אחרים, פרוטוקולי הצביעה להדמיית מבנים היקפיים קדמיים ומשווניים בעדשות מכרסמים אחרות (חולדה, שרקן) כמו גם בעדשות יונקים אחרות (פרה, מקוק ואדם; הנתונים אינם מוצגים). הדמיה של מבנים בעדשות גדולות דורשת קיבוע ארוך יותר (4% PFA, על קרח, 4 שעות), חסימה (1 שעות) וצביעה (לילה, 4 מעלות צלזיוס). יש לציין כי ההדמיה במינים שונים בוצעה רק על עדשות קבועות. הדמיה חיה של עדשות ממינים אחרים עשויה להיות מאתגרת מכיוון שפרוטוקול ההדמיה החיה משתמש בעדשות מעכברים טרנסגניים המבטאות חלבונים פלואורוגניים. לכן, הדמיה זו עשויה למנוע עדשות הדמיה של מינים אחרים שבהם שינויים גנטיים אינם נפוצים. עם זאת, הצלחנו לבצע הדמיה חיה של קרומי תאי אפיתל עדשה או F-actin על ידי הכתמת עדשות עכבר עם הבדיקה הליפופילית, FM4-64 או בדיקה קושרת F-actin, SiR-Jasplakinolide (SiR-actin), בהתאמה (לא מוצג). ייתכן שניתן יהיה להשתמש בגשושיות כאלה כדי לצלם עדשות חיות ממינים אחרים. עם זאת, יש לנקוט משנה זהירות בעת שימוש בבדיקות כאלה כדי למנוע השפעות מחוץ למטרה; לדוגמה, SiR-Jasplakinolide יכול להוביל לשינוי בדינמיקה של F-actin27. מגבלה נוספת של שיטות הצביעה, בין אם על עדשות חיות או קבועות, היא שלבדיקות כאלה יש חדירה מוגבלת. לכן, הדמיה מוגבלת לאזורים היקפיים. ניתן לדמיין אזורים פנימיים (כלומר, תאי סיבים עמוקים) באמצעות עדשות של עכברים טרנסגניים tdTomato4, אשר שוב מסתמך על ביטוי מהונדס של חלבונים פלואורוגניים. הביטוי גם חייב להיות גבוה מספיק עבור אותות בהירים בתאי סיבים עמוקים.

עם זאת, הפרוטוקולים המתוארים אפשרו כימות מורפולוגי יעיל של תכונות העדשה ההיקפית 2,4,20. מתודולוגיות הכימות יעילות ומשתמשות בתוכנת FIJI ImageJ בקוד פתוח, הזמינה לציבור. בעוד שכלי מעקב ידניים שימשו לזיהוי אזורי עניין, ייתכן שניתן יהיה להפוך את הזיהוי של אזורי עניין לאוטומטי. אוטומציה עשויה להיות פשוטה כמו החלת סף פלואורסצנטי כדי לשפר את הניגודיות עבור זיהוי מבוסס FIJI ImageJ של מבנים מסוימים (כלומר, גבולות גרעינים), או אלגוריתמים מורכבים יותר של למידת מכונה כדי לזהות הבדלים בצורת התא (כלומר, צורות אפיתל לא סדירות או צורות תאי סיבים). ניתוח מורכב יותר עשוי לדרוש תוספים מיוחדים או תוכנת הדמיה. תוספים או תוכנות מיוחדים עשויים גם לאפשר קבלת מדדים מורפולוגיים נפחיים תלת-ממדיים מערימות z שנרכשו. בסך הכל, בעוד ששיטות הכימות המתוארות נגישות, חסכוניות ומתאימות למדדי תוצאה שימושיים רבים 2,4,20, פלטפורמת פרוטוקול ההדמיה, בשילוב עם ניתוח תוכנה מתוחכם, יכולה לספק שפע של מדידות מורפולוגיות נוספות למחקרים עתידיים.

העדשה היא רקמה ביולוגית מורכבת בעלת פונקציות מיוחדות המסתמכות על מיקום וגיאומטריות תלויות עומק של התאים והמבנים הקשורים אליהם. שימוש בפרוטוקולי ההדמיה ובשיטות הכימות שהודגמו כאן יאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו מבנה העדשה והארגון המורכב של העדשה נקבעים. יתר על כן, פרוטוקולי ההדמיה ושיטות הכימות יסייעו לשרטט את היחסים בין מבנה העדשה לתפקודיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לעיניים מענק R01 EY032056 CC ו- R01 EY017724 ל- VMF, כמו גם המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תחת מענק מספר P20GM139760. S.T.I נתמך על ידי NIH-NIGMS T32-GM133395 כחלק מתוכנית ההכשרה הקדם-דוקטורנטית של ממשק כימיה-ביולוגיה, ועל ידי פרס חוקרים לתארים מתקדמים של אוניברסיטת דלאוור.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Biopsy Punch Acuderm Inc NC9084780
Agarose Apex BioResearch Products 20-102GP
Antimycotic/Antibiotic Cytiva SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Prometheus 25-529
Delicate task wipes Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish) World Precision International FD35-100
Hoescht 33342 Biotium 40046
Laser scanning confocal Microscope 880 Zeiss
MatTek Imaging Dish MatTek Life Sciences P35G-1.5-14
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 100503-917
PBS GenClone 25-507B
Phenol red-free medium 199 Gibco 11043023
Rhodamine-Phalloidin Thermo Fisher 00027
Triton X100 Sigma-Aldrich 11332481001
WGA-640 Biotium CF 640R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 203
הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., … More

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., Fowler, V. M., Cheng, C., Parreno, J. Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization. J. Vis. Exp. (203), e66017, doi:10.3791/66017 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter