Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

परिधीय लेंस संरचना, सेल आकृति विज्ञान और संगठन की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए पूरे माउंट इमेजिंग

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66017
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल छवि मात्रा का ठहराव के तरीकों के साथ ओकुलर लेंस में परिधीय संरचनाओं के दृश्य के लिए उपन्यास पूरे माउंट इमेजिंग का वर्णन करते हैं। इन प्रोटोकॉल का उपयोग लेंस माइक्रोस्केल संरचनाओं और लेंस विकास / फ़ंक्शन के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से समझने के लिए अध्ययन में किया जा सकता है।

Abstract

ओकुलर लेंस एक पारदर्शी लचीला ऊतक है जो रेटिना पर विभिन्न दूरी से प्रकाश को केंद्रित करने के लिए अपने आकार को बदल देता है। अंग के चारों ओर एक तहखाने झिल्ली के अलावा, जिसे कैप्सूल कहा जाता है, लेंस पूरी तरह से सेलुलर होता है जिसमें पूर्वकाल गोलार्ध पर उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर और लेंस फाइबर कोशिकाओं का एक बड़ा द्रव्यमान होता है। पूरे जीवन में, उपकला कोशिकाएं लेंस भूमध्य रेखा पर अंकुरण क्षेत्र में फैलती हैं, और भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं नवगठित फाइबर कोशिकाओं में माइग्रेट करती हैं, लम्बी होती हैं और अंतर करती हैं। भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं काफी हद तक आकृति विज्ञान को बेतरतीब ढंग से पैक किए गए कोबल-पत्थर के आकार की कोशिकाओं में संरेखित षट्भुज के आकार की कोशिकाओं में बदल देती हैं, जिससे मेरिडियल पंक्तियाँ बनती हैं। नवगठित लेंस फाइबर कोशिकाएं हेक्सागोनल सेल आकार को बनाए रखती हैं और पूर्वकाल और पीछे के ध्रुवों की ओर बढ़ती हैं, जिससे कोशिकाओं का एक नया खोल बनता है जो फाइबर की पिछली पीढ़ियों पर मढ़ा जाता है। उन तंत्रों के बारे में बहुत कम जानकारी है जो लेंस उपकला कोशिकाओं के उल्लेखनीय आकारिकी को फाइबर कोशिकाओं तक ले जाते हैं। लेंस संरचना, विकास और कार्य को बेहतर ढंग से समझने के लिए, ओकुलर लेंस के पूरे माउंट का उपयोग करके परिधीय संरचनाओं की छवि के लिए नए इमेजिंग प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। यहां, कैप्सूल मोटाई, उपकला सेल क्षेत्र, सेल परमाणु क्षेत्र और आकार, मेरिडियल पंक्ति सेल ऑर्डर और पैकिंग, और फाइबर सेल चौड़ाई की मात्रा निर्धारित करने के तरीके दिखाए जाते हैं। ये माप आजीवन लेंस विकास के दौरान होने वाले सेलुलर परिवर्तनों को स्पष्ट करने और उम्र या विकृति के साथ होने वाले परिवर्तनों को समझने के लिए आवश्यक हैं।

Introduction

ओकुलर लेंस आंख के पूर्वकाल क्षेत्र में स्थित एक लचीला, पारदर्शी ऊतक है जो रेटिना पर प्रकाश को ठीक करने का कार्य करता है। लेंस के कार्य करने की क्षमता को इसकी जटिल वास्तुकला और संगठन 1,2,3,4,5,6 के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। लेंस ऊतक के आसपास कैप्सूल है, लेंस संरचना और बायोमैकेनिकल गुणों 7,8,9 को बनाए रखने के लिए आवश्यक एक तहखाने झिल्ली. लेंस स्वयं पूरी तरह से सेलुलर है, जिसमें दो सेल प्रकार शामिल हैं: उपकला और फाइबर कोशिकाएं। उपकला परत cuboidal कोशिकाओं है कि लेंस10 के पूर्वकाल गोलार्द्ध को कवर की एक monolayer के होते हैं. जीवन भर, उपकला कोशिकाएं लेंस कैप्सूल के साथ लेंस भूमध्य रेखा की ओर बढ़ती हैं और पलायन करती हैं। पूर्वकाल उपकला कोशिकाओं पार अनुभाग में मौन और कोबल-पत्थर हैं, और लेंस भूमध्य रेखा के पास, उपकला कोशिकाओं प्रसार और नए फाइबर कोशिकाओं11,12 में भेदभाव प्रक्रिया से गुजरना शुरू. भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं बेतरतीब ढंग से पैक की गई कोशिकाओं से हेक्सागोन के आकार की कोशिकाओं के साथ संगठित मध्याह्न पंक्तियों में बदल जाती हैं। हेक्सागोनल सेल आकार इन विभेदक कोशिकाओं के बेसल पक्ष पर बनाए रखा जाता है, जबकि शिखर पक्ष लेंस फुलक्रम या मोडिओलस 4,13,14,15 पर संकुचित और लंगर डालता है। जैसे ही भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं नवगठित फाइबर कोशिकाओं में बढ़ने लगती हैं, कोशिकाओं की शिखर युक्तियां पूर्वकाल उपकला कोशिकाओं की शिखर सतह के साथ पूर्वकाल ध्रुव की ओर पलायन करती हैं, जबकि बेसल युक्तियां लेंस कैप्सूल के साथ पीछे के ध्रुव की ओर बढ़ती हैं। फाइबर कोशिकाओं की नई पीढ़ी कोशिकाओं की पिछली पीढ़ियों को ओवरले करती है, जिससे फाइबर के गोलाकार गोले बनते हैं। सेल बढ़ाव और परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान, फाइबर कोशिकाओं काफी हद तक उनके आकारिकी 11,12,16 में परिवर्तन. ये फाइबर कोशिकाएं लेंस द्रव्यमान 11,12,16,17,18 का बड़ा हिस्सा बनाती हैं।

आणविक तंत्र जो जटिल लेंस माइक्रोस्ट्रक्चर, सेल आकृति विज्ञान और अद्वितीय सेलुलर संगठन स्थापित करने में योगदान करते हैं, पूरी तरह से ज्ञात नहीं हैं। इसके अलावा, समग्र लेंस फ़ंक्शन (पारदर्शिता, लेंस आकार परिवर्तन) में लेंस कैप्सूल और सेल संरचना का योगदान स्पष्ट नहीं है। हालांकि, इन संबंधों को नई इमेजिंग पद्धति और लेंस संरचनात्मक और सेलुलर विशेषताओं 2,4,19,20,21,22 के मात्रात्मक आकलन का उपयोग करके स्पष्ट किया जा रहा है। पूरे लेंस की छवि के लिए नए प्रोटोकॉल जो लेंस कैप्सूल, उपकला कोशिकाओं और परिधीय फाइबर कोशिकाओं के उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देते हैं, विकसित किए गए हैं। इसमें कैप्सूल मोटाई, सेल आकार, सेल नाभिक आकार और परिपत्रता, मेरिडियल पंक्ति क्रम, फाइबर सेल पैकिंग और फाइबर सेल चौड़ाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए कार्यप्रणाली शामिल है। ये दृश्य और छवि परिमाणीकरण विधियां गहराई से मॉर्फोमेट्रिक परीक्षा की अनुमति देती हैं और समग्र 3 डी ऊतक संरचना को संरक्षित करके अन्य विज़ुअलाइज़ेशन विधियों (फ्लैट माउंट या ऊतक वर्गों की इमेजिंग) पर फायदे हैं। इन विधियों ने उपन्यास परिकल्पनाओं के परीक्षण के लिए अनुमति दी है और लेंस सेल पैटर्न विकास और कार्य की समझ में निरंतर प्रगति को सक्षम करेगा।

निम्नलिखित प्रयोगों के लिए, हम जंगली प्रकार और Rosa26-tdTomato चूहों अग्रानुक्रम डिमर-टमाटर (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (जैक्सन लेबोरेटरीज) का उपयोग C57BL/6J पृष्ठभूमि में 6 और 10 सप्ताह की उम्र के बीच, दोनों लिंगों के। tdTomato चूहों tdTomato प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से जीवित लेंस में सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं जो एन-टर्मिनल myristylation और आंतरिक सिस्टीन-palmitoylation साइटों23 के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित करता है कि एक उत्परिवर्तित MARCKS प्रोटीन के एन-टर्मिनल 8 एमिनो एसिड से जुड़े हुए हैं। हम मूल रूप से डॉ. रॉबर्ट एडेलस्टीन (नेशनल हार्ट, फेफड़े और ब्लड इंस्टीट्यूट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी) से प्राप्त NMIIAE1841K/E1841K चूहों24 का भी उपयोग करते हैं। जैसा कि पहलेवर्णित है 20, NMIIAE1841K/E1841K FvBN/129SvEv/C57Bl6 पृष्ठभूमि में चूहों में CP49 मनके मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन का नुकसान होता है (परिपक्व फाइबर सेल आकृति विज्ञान और पूरे लेंस बायोमैकेनिक्स को बनाए रखता है), C57BL6/J जंगली प्रकार के चूहों के साथ बैकक्रॉस किया जाता है। हमने जंगली प्रकार के CP49 एलील की उपस्थिति के लिए संतानों की जांच की।

कन्फोकल इमेजिंग एक 20x (एनए = 0.8, काम दूरी = 0.55 मिमी, 1x ज़ूम), एक 40x (एनए = 1.3 तेल उद्देश्य, काम दूरी = 0.2 मिमी, 1x ज़ूम), या एक 63x (एनए = 1.4 तेल उद्देश्य, काम दूरी = 0.19 मिमी, 1x ज़ूम) बढ़ाई के साथ एक लेजर-स्कैनिंग कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन किया गया था। सभी छवियों को एक पिनहोल आकार का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जो ऑप्टिकल सेक्शन मोटाई का एक निर्धारक है, 1 हवादार इकाई (परिणामी ऑप्टिकल मोटाई आंकड़ा किंवदंतियों में बताई गई है)। छवियों को ज़ेन सॉफ्टवेयर पर संसाधित किया गया था। छवियों को .tif प्रारूप में निर्यात किया गया था और फिर फिजी इमेजजे सॉफ्टवेयर (imageJ.net) में आयात किया गया था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

चूहों को डेलावेयर पशु सुविधा विश्वविद्यालय में रखा जाता है, जो रोगज़नक़ मुक्त वातावरण में बनाए रखा जाता है। सीओ2 इनहेलेशन द्वारा इच्छामृत्यु सहित सभी पशु प्रक्रियाएं, डेलावेयर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित की गई थीं।

1. पूरे लेंस माउंट तैयारी और इमेजिंग

  1. पूरे माउंट इमेजिंग के लिए लेंस का निर्धारण
    1. इच्छामृत्यु के बाद, आंखों और विच्छेदन लेंस के रूप में पहले वर्णित25. विच्छेदन के बाद, लेंस को तुरंत ताजा 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस; 1.1 एमएम केएच2पीओ4, 155 मिमी, एनएसीएल, 3.0 एमएम एनए2एचपीओ4-7 एच2ओ; पीएच 7.4) कमरे के तापमान पर स्थानांतरित करें।
      नोट: सेलुलर आकृति विज्ञान को बदला जा सकता है यदि लेंस पीबीएस में विस्तारित अवधि के लिए संग्रहीत होते हैं, इसलिए, विच्छेदन के ~ 10 मिनट के भीतर तुरंत ठीक करने की सिफारिश की जाती है।
    2. लेंस पूर्वकाल क्षेत्र के पूरे माउंट इमेजिंग के लिए, कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge ट्यूब में 1x पीबीएस में ताजा बनाया 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 0.5 एमएल में विसर्जित करके पूरे लेंस फिक्स. 30 मिनट के बाद, लेंस 3x (धोने प्रति 5 मिनट) 1x पीबीएस के साथ धो लें. चरण 1.2 के लिए आगे बढ़ें या 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में स्टोर करें। फिक्स्ड लेंस को 5 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. लेंस भूमध्यरेखीय क्षेत्र के पूरे माउंट इमेजिंग के लिए, कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge ट्यूब में 1x पीबीएस में ताजा बनाया 4% पीएफए के 0.5 एमएल में विसर्जित करके पूरे लेंस को ठीक करें। 1 घंटे के बाद, 1x पीबीएस के साथ लेंस 3x (5 मिनट प्रति धुने) धो लें। चरण 1.3 पर आगे बढ़ें या 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में स्टोर करें। फिक्स्ड लेंस को 5 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. पूर्वकाल लेंस क्षेत्र का पूरा माउंट (फिक्स्ड या लाइव)
    1. फिक्स्ड लेंस के पूरे माउंट इमेजिंग के लिए, चरण 1.2.3 पर आगे बढ़ें।
    2. लाइव लेंस की पूरे-माउंट इमेजिंग के लिए, लेंस को 48-वेल प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें मध्यम 199 (फिनोल लाल-मुक्त) के 1 एमएल होते हैं जिसमें 1% एंटीबायोटिक / एंटीमायोटिक होता है। इमेजिंग तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर लेंस सेते हैं। इमेजिंग से पहले, कम से कम 10 मिनट के लिए मध्यम 199 में फ्लोरोसेंट-लेबल वाले गेहूं रोगाणु एग्लूटीनिन (डब्ल्यूजीए-640, 1:500) और होचस्ट 33342 (1:500) युक्त समाधान में लेंस को इनक्यूबेट करें। चरण 1.5 पर आगे बढ़ें।
    3. लेंस कैप्सूल, एफ-एक्टिन और फिक्स्ड लेंस के नाभिक को दागने के लिए, लेंस को 500 माइक्रोन समाधान में रखें जिसमें डब्ल्यूजीए -640 (1:500), रोडामाइन-फालोइडिन (1:50), और होचस्ट 33342 (1:500) पारगम्यता / अवरुद्ध बफर में (1x पीबीएस जिसमें 0.3% ट्राइटन, 0.3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (अंश वी) और 3% बकरी सीरम) एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर लेंस दाग।
    4. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, लेंस 3x (धोने प्रति 5 मिनट) 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ धो लें. इमेजिंग लेंस के लिए आगे बढ़ें।
    5. कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए निश्चित लेंस को स्थिर करने के लिए, पहले21 (चित्रा 1) वर्णित के रूप में एक इमेजिंग डिश पर एगरोज में लेंस स्थिरीकरण डिवोट्स बनाएं।
      1. गर्मी और धीरे समाधान तरलीकृत है जब तक एक माइक्रोवेव का उपयोग पीबीएस में 2% agarose मिश्रण. पिपेट 250 माइक्रोन तरलीकृत 2% agarose एक गिलास नीचे पकवान (चित्रा 1 ए) में agarose और एक लचीला प्लास्टिक coverslip (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर पकवान भर में agarose चपटा. एक बार agarose ठंडा और पूरी तरह से जम गया है, ठीक टिप संदंश(चित्रा 1C)का उपयोग coverslip हटा दें और पकवान के केंद्र में agarose में एक छेद बनाने के लिए एक 3mm बायोप्सी पंच का उपयोग करें(चित्रा 1D).
      2. एक नाजुक कार्य पोंछ(चित्रा 1E)का उपयोग कर अतिरिक्त agarose निकालें. 1x पीबीएस के साथ अगारोज मोल्ड हाइड्रेटेड रखें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। अगारोज मोल्ड्स को 1 सप्ताह तक सफलतापूर्वक संग्रहीत किया गया है।
    6. भ्रूण संदंश का प्रयोग, धीरे 1x पीबीएस (फिक्स्ड लेंस) या फिनोल लाल मुक्त मध्यम 199 (लाइव लेंस) के ~ 2 एमएल युक्त agarose (चित्रा 1F) में divot में जीवित या तय लेंस हस्तांतरण, और फिर एक उल्टे खुर्दबीन मंच पर पकवान जगह. यह पुष्टि करने के लिए कि लेंस उद्देश्य का सामना करने वाले पूर्वकाल क्षेत्र के साथ स्थित है, नाभिक धुंधला की कल्पना करें। यदि कोई नाभिक नहीं देखा जाता है, तो पीछे का क्षेत्र उद्देश्य का सामना कर सकता है।
    7. लेंस उलटा करने के लिए, घुमावदार संदंश का उपयोग करें और धीरे लेंस ~ 180 डिग्री इतना है कि पूर्वकाल क्षेत्र उद्देश्य का सामना करना पड़ता बारी बारी से. एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग छवियों को प्राप्त करें.
    8. लेंस कैप्सूल के दृश्य के लिए, 0.3 माइक्रोन के एक कदम आकार के साथ एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर z-स्टैक छवियों का अधिग्रहण. लेंस कैप्सूल की सतह से पहले पहली छवि प्राप्त करें (डब्ल्यूजीए धुंधला द्वारा इंगित) और उपकला कोशिकाओं की शिखर सतह के बाद अंतिम छवि। उपकला कोशिकाओं कल्पना करने के लिए, लेंस उपकला कोशिकाओं के दृश्य के लिए 0.3 माइक्रोन के एक कदम आकार के साथ एक 63x उद्देश्य का उपयोग कर z-स्टैक छवियों का अधिग्रहण.
      नोट: ये माइक्रोस्कोप पैरामीटर छवियों के पर्याप्त तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देते हैं जो कैप्सूल मोटाई या उपकला सेल क्षेत्र की छवि मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक है। यह भी उपकला सेल monolayer अतीत इमेजिंग द्वारा लाइव लेंस tdTomato लेंस में टांके छवि के रूप मेंपहले वर्णित 4.
  3. लेंस भूमध्यरेखीय उपकला और फाइबर सेल धुंधला हो जाना
    1. रोडामाइन-फालोलाइडिन (1:300), डब्ल्यूजीए -640 (1:250), और होचस्ट 33342 (1:500) के 0.5 एमएल समाधान में पारगम्यता/अवरुद्ध समाधान (3% बीएसए, 3% बकरी सीरम और 0.3% ट्राइटन) में एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के भीतर निश्चित लेंस रखें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    2. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, 1mL 1x पीबीएस (5 मिनट प्रति धुने) में लेंस 3x धोएं।
    3. लेंस स्थिरीकरण agarose wedges के रूप में पहले 4,10 वर्णित बनाएँ.
      1. संक्षेप में, कांच के तले वाले व्यंजन (FD35-100, WPI) में अगारोज़ वेजेज बनाएं ~ 5-6 एमएल पिघला हुआ 2% agarose में 1x पीबीएस में व्यंजन (चित्रा 2A)। एक बार जब अगारोज जम जाता है (चित्र 2बी), एक तेज ब्लेड(चित्रा 2सी)के साथ त्रिकोणीय डिवोट बनाएं। अगारोज पच्चर निकालें और 1x पीबीएस के 1 एमएल को अगारोज डिश (चित्रा 2डी) में रखें।
      2. किसी भी अवशिष्ट agarose है कि agarose काटने से पीछे छोड़ा जा सकता है महाप्राण. कई अलग-अलग आकारों के लेंस (दिखाए गए नहीं) को फिट करने के लिए प्रति डिश कई वेजेज बनाए जा सकते हैं। अगारोज मोल्ड को स्टोर करने के लिए, अगारोज मोल्ड पर 1x पीबीएस के 1 एमएल रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। वेजेज को 1 सप्ताह तक रखा जा सकता है।
    4. घुमावदार चिमटी का प्रयोग, लेंस 1x पीबीएस के 1एमएल युक्त एक agarose कील के भीतर जगह और लेंस के भूमध्यरेखीय क्षेत्र confocal उद्देश्य (चित्रा 2E-F) के ऊपर खुर्दबीन कांच पर नीचे का सामना करना पड़ रहा है ताकि समायोजित करें. यह पुष्टि करने के लिए कि भूमध्यरेखीय क्षेत्र फोकस में है, नाभिक की कल्पना करें और सुनिश्चित करें कि नाभिक भूमध्य रेखा पर पंक्तियों में संरेखित हैं। भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाओं की पहचान भी की जा सकती है क्योंकि वे अनियमित रूप से पैक और आकार के होते हैं। साथ ही, मेरिडियल पंक्ति कोशिकाएं ठीक से संरेखित और हेक्सागोनल आकार की होती हैं, जो कोशिका झिल्ली पर एफ-एक्टिन धुंधला होने से संकेत देती हैं।
    5. यदि देखने के क्षेत्र में नाभिक बेतरतीब ढंग से पैक किए जाते हैं, तो लेंस का पूर्वकाल पक्ष उद्देश्य का सामना कर रहा है। यदि नाभिक को नहीं देखा जा सकता है, तो लेंस के पीछे की ओर सबसे अधिक संभावना उद्देश्य का सामना कर रही है। यदि लेंस अपने भूमध्य रेखा पर नहीं बैठा है, तो लेंस को फिर से उन्मुख करें, और लेंस को घुमाने के लिए घुमावदार चिमटी का उपयोग करें जब तक कि लेंस भूमध्य रेखा पर ठीक से संरेखित नाभिक नहीं देखा जाता है।
    6. लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (20x उद्देश्य, एनए = 0.8, चरण आकार 0.5 माइक्रोन और/या 40x तेल उद्देश्य, एनए = 1.3, चरण आकार 0.4 माइक्रोन) का उपयोग करके लेंस भूमध्यरेखीय उपकला और फाइबर कोशिकाओं की छवि बनाएं। जेड-स्टैक संग्रह से पहले छवियों को घुमाएं, जिसमें भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं शीर्ष पर होती हैं, इसके बाद मेरिडियल पंक्ति और फाइबर कोशिकाएं ठीक नीचे होती हैं।

2. छवि विश्लेषण पद्धति

  1. लेंस कैप्सूल मोटाई माप
    1. डब्ल्यूजीए के साथ लेबल किए गए लाइव टीडीटोमैटो लेंस या डब्ल्यूजीए और रो-फैलोलाइडिन के साथ लेबल किए गए फिक्स्ड लेंस के 40x उद्देश्य (0.3 माइक्रोन स्टेप साइज) के साथ प्राप्त जेड-स्टैक छवियों का उपयोग करके, 3 डी पुनर्निर्माण के एक्सजेड दृश्य में एक ऑप्टिकल 2 डी प्रक्षेपण प्राप्त करें और .tif प्रारूप में सहेजें। ज़ेन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को संसाधित करें।
    2. FIJI ImageJ सॉफ़्टवेयर में XZ स्लाइस (.tif) छवियाँ खोलें।
    3. लेंस कैप्सूल मोटाई को मापने के लिए, सीधी रेखा फ़ंक्शन ( चित्रा 3 ए, बी में चित्रित) का उपयोग करें। रेखा चौड़ाई > विकल्प >संपादित करें का चयन करके रेखा चौड़ाई को 50 पिक्सेल पर सेट करें. इस लाइन चौड़ाई अनुभवजन्य खुर्दबीन सेटिंग्स के साथ एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात प्रदान करने के लिए निर्धारित किया गया था. इष्टतम रेखा की चौड़ाई अन्य माइक्रोस्कोप/माइक्रोस्कोप सेटिंग्स पर या अन्य प्रजातियों के लेंस का उपयोग करते समय भिन्न हो सकती है। इसके बाद, कैप्सूल की ऊपरी सतह से उपकला कोशिकाओं के बेसल क्षेत्र के नीचे तक एक रेखा खींचें।
    4. Ctrl + T दबाकर रेखा को रुचि के क्षेत्र के रूप में सहेजें।
    5. छवि, रंग और विभाजित चैनलों के लिए चैनलों को टैब में अलग करें।
    6. Ctrl + K दबाकर कैप्सूल चैनल के लिए लाइन के साथ तीव्रता को मापें।
    7. एक स्प्रेडशीट में, दूरी के एक समारोह के रूप में तीव्रता मूल्यों को प्लॉट करें और कैप्सूल और एफ-एक्टिन के लिए तीव्रता चोटियों का निर्धारण करें, जो क्रमशः उपकला कोशिकाओं के कैप्सूल सतह और बेसल क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। x-अक्ष पर रेखा की दूरी है।
    8. अगला, कैप्सूल और उपकला फ्लोरोसेंट तीव्रता चोटियों(चित्रा 3सी, डी)के बीच की दूरी का निर्धारण करके कैप्सूल मोटाई की गणना.
  2. सेल क्षेत्र विश्लेषण
    1. लाइव tdTomato लेंस या phalloidin के साथ लेबल तय लेंस पर एक 63x उद्देश्य लेंस (एनए = 1.4; 0.3 माइक्रोन कदम आकार) का उपयोग कर प्राप्त z-स्टैक छवियों का उपयोग करना, एक जेड स्टैक confocal छवि जहां उपकला कोशिकाओं के मध्य (पार्श्व) क्षेत्र फोकस में है के अनुरूप एक XY दृश्य टुकड़ा का विश्लेषण. ध्यान दें कि पार्श्व झिल्ली tdटमाटर झिल्ली डाई का उपयोग करके या पार्श्व कोशिका झिल्ली पर मौजूद फालोलाइडिन की कल्पना करके दिखाई देती है।
      नोट: लेंस की वक्रता के कारण (जैसा कि XZ दृश्य में देखा गया है; चित्रा 4 ए-सी), सभी उपकला कोशिकाओं छवि में ध्यान में नहीं होगा. उपकला का मध्य क्षेत्र उस क्षेत्र से मेल खाता है जहां कोशिका पार्श्व झिल्ली (चित्र 4डी-ई) और नाभिक (चित्र 4जी-I) फोकस में हैं।
    2. छवि को .tif के रूप में निर्यात करें और इसे FIJI ImageJ में खोलें।
    3. विश्लेषण के लिए FIJI ImageJ में स्केल सेट करने के लिए, लाइन टूल का उपयोग एक ऐसी रेखा बनाने के लिए करें जो कॉन्फ़ोकल छवि से स्केल बार की लंबाई है।
    4. लाइन की पिक्सेल लंबाई और स्केल बार की लंबाई रिकॉर्ड करें। टूलबार मेनू पर विश्लेषण पर जाएं और स्केल सेट करें चुनें। पिक्सेल की संख्या इनपुट करें जो कि पिक्सेल में दूरी में रेखा की लंबाई है और ज्ञात दूरी में स्केल बार की ज्ञात लंबाई इनपुट करें।
    5. सेल सीमाओं के संकेत के रूप में tdTomato या rhodamine-phalloidin धुंधला का उपयोग करना, मैन्युअल रूप से बहुभुज उपकरण का उपयोग करके छवि के भीतर ध्यान केंद्रित करने वाली कोशिकाओं की आबादी को रेखांकित करता है। केवल ट्रेस कोशिकाओं जहां पार्श्व झिल्ली (चित्रा 4ई) दिखाई दे रहे हैं और आंशिक रूप से दिखाई कोशिकाओं (यानी, छवियों के किनारे पर) अनुरेखण से बचें. Ctrl+T दबाकर ROI सहेजें। टूलबार मेनू पर संपादित करें पर जाएं और बाहर साफ़ करें चुनें। अब FIJI ImageJ में Ctrl + M दबाकर कुल सेल क्षेत्र (ROI) को मापें।
    6. आरओआई क्षेत्र को कुल सेल नंबर से विभाजित करके औसत सेल क्षेत्र की गणना करें। कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने का एक सरल तरीका नाभिक की संख्या की गणना करना है। नाभिक चैनल (नीला) पर जाएं। आरओआई मेनू पर, कोशिकाओं की सहेजी गई आरओआई रूपरेखा (चित्रा 4 जी) का चयन करें। संपादित करें पर जाकर आरओआई के बाहर साफ़ करें और फिर बाहर साफ़ करें (चित्र 4H) पर क्लिक करें। मल्टी-पॉइंट टूल का उपयोग करके, अलग-अलग नाभिक पर क्लिक करके नाभिक की गणना करें।
  3. सेलुलर परमाणु क्षेत्र और आकार विश्लेषण
    1. नाभिक क्षेत्र और आकार विश्लेषण के लिए, एक जेड-स्टैक कॉन्फोकल छवि से एक एक्सवाई विमान दृश्य ऑप्टिकल अनुभाग का विश्लेषण करें, जहां टीडी टमाटर उपकला कोशिकाओं का मध्य (पार्श्व) क्षेत्र फोकस में है। एक confocal छवि से एक z-स्टैक टुकड़ा का विश्लेषण करें जहां परमाणु क्षेत्र सबसे बड़ा है (चित्रा 5A); यह नाभिक के मध्य भाग का प्रतिनिधित्व करता है।
      नोट: ध्यान दें कि लेंस की वक्रता के कारण, सभी नाभिक फोकस में नहीं होंगे, जैसा कि एक्सजेड दृश्य (चित्रा 4 जी और चित्रा 5 ए) में देखा जा सकता है।
    2. नाभिक की एक उप-जनसंख्या का चयन करें जो फोकस में हैं और एक आरओआई को बचाएं।
    3. बाहर साफ़ करें फ़ंक्शन का उपयोग करें। आरओआई के भीतर, फ्रीहैंड चयन उपकरण (बाईं ओर से चौथा मेनू बटन) का उपयोग करके, नाभिक की सीमाओं का सावधानीपूर्वक पता लगाएं (चित्र 5बी)। Ctrl+T दबाकर प्रत्येक परमाणु ट्रेस को ROI विंडो में सहेजें। केवल नाभिक की रूपरेखा जहां पूर्ण नाभिक देखा जा सकता है, और नाभिक एक दूसरे को छू नहीं रहे हैं।
    4. एक बार सभी नाभिक रेखांकित हो जाने के बाद, Ctrl + M दबाकर व्यक्तिगत कोशिकाओं के परमाणु क्षेत्र और आकार (यानी, परिपत्रता) को मापें।
    5. एक स्प्रेडशीट में डेटा कॉपी और पेस्ट करें और औसत परमाणु क्षेत्र और परिपत्रता (चित्रा 5 सी) की गणना करें।
  4. मेरिडियल पंक्ति उपकला पैकिंग
    1. मेरिडियल पंक्ति विकार को मापने के लिए, एक 20x उद्देश्य (0.5 माइक्रोन कदम आकार) का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण.
    2. प्रतिबिंबों पर लेंस फुलक्रम/मोडिओलस की पहचान कीजिए। फुलक्रम वह क्षेत्र है जहां लम्बी उपकला कोशिकाओं की शिखर युक्तियाँ भूमध्य रेखा पर प्रारंभिक फाइबर सेल भेदभाव और बढ़ाव के दौरान एक लंगर बिंदु बनाने के लिए संकुचित होती हैं। उज्ज्वल एफ-एक्टिन तीव्रता के आधार पर फुलक्रम की पहचान करें ( चित्र 6 ए में एक्सजेड दृश्य में तीर के निशान से इंगित; चित्र 6 बी में एक लाल धराशायी रेखा द्वारा इंगित) और एक्सवाई दृश्य में एकल ऑप्टिकल अनुभाग में सेलुलर संगठन में परिवर्तन।
      नोट: इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं के बेसल और एपिकल दोनों क्षेत्रों के एफ-एक्टिन धुंधला फुलक्रम के ऊपर स्पष्ट होते हैं, जबकि लम्बी कोशिकाओं का केवल बेसल क्षेत्र फुलक्रम (चित्रा 6ए)के नीचे स्पष्ट होता है। फुलक्रम लाइन के ऊपर उपकला कोशिकाएं अनियमित रूप से पैक की जाती हैं और रोसेट बनाती हैं, जबकि फुलक्रम के नीचे फाइबर कोशिकाओं को समानांतर पंक्तियों में व्यवस्थित किया जाता है, जो झिल्ली पर उज्ज्वल एफ-एक्टिन धुंधला हो जाना (चित्रा 6बी) द्वारा इंगित किया जाता है।
    3. एक बार फुलक्रम 2 महीने पुराने चूहों में पहचान की है, XY विमान में फुलक्रम (लेंस कैप्सूल की ओर) के लिए एकल ऑप्टिकल अनुभाग ~ 4.5-5 माइक्रोन परिधीय का चयन करें. इस दूरी को अवलोकन के आधार पर चुना जाता है कि 2 महीने के चूहों में मेरिडियल पंक्ति कोशिकाओं के सभी नाभिक फोकस में होते हैं जब वे फुलक्रम के लिए ~ 5 माइक्रोन परिधीय होते हैं। एकल ऑप्टिकल अनुभाग (.tif) सहेजें। फिजी पर छवि खोलें।
      नोट: यह विश्लेषण केवल 2 महीने के चूहों पर किया गया है और इसलिए, यह निष्कर्ष नहीं निकाला जा सकता है कि यह दूरी उम्र के साथ बदलती है या नहीं।
    4. छवि विश्लेषण करने से पहले, चरण 2.2.2 का उपयोग करके ImageJ में पैमाने को माइक्रोन पर सेट करें।
    5. मैन्युअल रूप से परमाणु संरेखण की पहचान करके फ्रीहैंड लाइन टूल (ब्याज / आरओआई का क्षेत्र) का उपयोग करके पूरे मेरिडियल पंक्ति क्षेत्रों को रेखांकित करें, जैसा कि चित्र 7 ए में दिखाया गया है। Ctrl+T दबाकर ROI सहेजें। टूलबार मेनू पर संपादित करें पर जाएं और बाहर साफ़ करें चुनें। FIJI ImageJ में Ctrl + M दबाकर कुल कक्ष क्षेत्र (ROI) को मापें।
    6. फिजी इमेजजे में फ्रीहैंड लाइन टूल का उपयोग करके रूपरेखा तैयार करके एफ-एक्टिन धुंधला द्वारा इंगित विकार के किसी भी क्षेत्र की पहचान करें। अव्यवस्थित क्षेत्रों के लिए मानदंड पंक्तियों की शाखा, अनियमित पैकिंग, और पंक्तियों के गलत संरेखण (चित्रा 7 बी) शामिल हैं, जैसा कि पहले20 दिखाया गया है।
    7. FIJI ImageJ में Ctrl + M दबाकर उल्लिखित अव्यवस्थित क्षेत्र/पैच को मापें। एक स्प्रेडशीट में कुल अव्यवस्थित क्षेत्र का योग करें।
    8. आरओआई क्षेत्र द्वारा कुल अव्यवस्थित क्षेत्र को विभाजित करें, फिर एक प्रतिशत अव्यवस्थित क्षेत्र प्राप्त करने के लिए 100 से गुणा करें। यदि कोई विकार नहीं देखा जाता है, तो अव्यवस्थित क्षेत्र के लिए 0% का मान रखें।
  5. पड़ोसी कोशिकाओं की मेरिडियल पंक्ति संख्या
    1. पड़ोसी कोशिकाओं की संख्या को मापने के लिए, 40x तेल उद्देश्य (0.4 माइक्रोन कदम आकार) के साथ अधिग्रहित एफ-एक्टिन-दाग वाली छवियों का उपयोग करें।
    2. लेंस कैप्सूल से अंदर की ओर मेरिडियल पंक्ति कोशिकाओं के बेसल क्षेत्र में एक ऑप्टिकल सेक्शन (एक्सवाई प्लेन) की पहचान करें जहां एफ-एक्टिन मेरिडियल पंक्ति कोशिकाओं की पूरी परिधि के आसपास समृद्ध होता है, सभी मेरिडियल पंक्ति कोशिकाएं फोकस में होती हैं और एक ही विमान पर होती हैं।
    3. आसन्न कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक मध्याह्न पंक्ति सेल (चित्रा 8) है. एक स्प्रेडशीट में छह आसन्न कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं का औसत प्रतिशत मापें।
      नोट: 20x उद्देश्य के साथ आसन्न कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें। हालांकि, 40x उद्देश्य के साथ षट्भुज आकार का निरीक्षण करना काफी आसान है।
  6. भूमध्यरेखीय फाइबर कोशिकाओं की छवि विश्लेषण
    1. एक 20x उद्देश्य (0.5 माइक्रोन कदम आकार) के साथ rhodamine phalloidin सना हुआ लेंस के z-स्टैक confocal छवियों ले लो.
    2. चरण 2.4.2 में दर्शाए अनुसार आधार की पहचान करें। एक बार फुलक्रम की पहचान हो जाने के बाद, एक एकल ऑप्टिकल अनुभाग का चयन करें। मानकीकरण प्रयोजनों के लिए और लेंस के बीच तुलना करने के लिए, फाइबर सेल चौड़ाई ~ 10 माइक्रोन आवक XY विमान (चित्रा 9A) में fulcrum से आवक यों है.
    3. कच्ची छवियों को FIJI ImageJ में निर्यात करें। फिजी इमेजजे में, एफ-एक्टिन-सना हुआ चोटियों (लाइन स्कैन विश्लेषण; चित्र 9A; गुलाबी रेखा)।
    4. Ctrl + K दबाकर FIJI में लाइन स्कैन दूरी पर फ्लोरोसेंट तीव्रता प्राप्त करें। अगला, इंटरपीक दूरी की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट में डेटा निर्यात करें (उदाहरण चित्र 9A-B में दिखाया गया है)। यह फाइबर सेल चौड़ाई से मेल खाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पूर्वकाल लेंस कैप्सूल, उपकला सेल क्षेत्र और परमाणु क्षेत्र
लेंस कैप्सूल मोटाई का विश्लेषण करने के लिए, हमने डब्ल्यूजीए के साथ लाइव या फिक्स्ड लेंस में लेंस कैप्सूल को दाग दिया। हमने जीवित लेंस(चित्रा 2ए)में टीडीटोमैटो के साथ झिल्ली को लेबल करके लेंस उपकला कोशिकाओं की पहचान की, या निश्चित लेंस(चित्रा 2बी)में कोशिका झिल्ली पर एफ-एक्टिन के लिए रोडामाइन-फालोलाइडिन धुंधला के माध्यम से। एक ऑर्थोगोनल (एक्सजेड) प्रक्षेपण में, डब्ल्यूजीए और टीडीटोमैटो/रोडामाइन-फालोइडिन के लिए धुंधला होना हमें प्रतिदीप्ति तीव्रता के पीक-टू-पीक लाइन स्कैन विश्लेषण करने की अनुमति देता है। डब्ल्यूजीए चैनल में प्रमुख शिखर कैप्सुलर सतह को इंगित करता है जबकि टीडी टोमैटो/रोडामाइन-फालोलाइडिन चैनल में प्रमुख शिखर उपकला कोशिकाओं के बेसल क्षेत्र को इंगित करता है। इन चोटियों के बीच की दूरी की गणना करके, हम कैप्सुलर मोटाई प्राप्त कर सकते हैं। लाइन स्कैन विश्लेषण से पता चलता है कि 9 सप्ताह पुराने चूहों के लाइव लेंस के कैप्सूल में 11.2 माइक्रोन की मोटाई थी, और 9 सप्ताह पुराने चूहों के फिक्स्ड लेंस के कैप्सूल में 12.5 माइक्रोन की मोटाई थी। ये मनाया कैप्सूल मोटाई पिछले निष्कर्षों 2,4 के प्रतिनिधि हैं.

tdTomato-लेबल ट्रांसजेनिक माउस लेंस (या rhodamine-phalloidin सना हुआ लेंस; नहीं दिखाया गया) की पूरी-माउंट इमेजिंग उपकला सेल आकृति विज्ञान के लाइव दृश्य के लिए अनुमति देती है। ऑर्थोगोनल (XZ) प्रक्षेपण लेंस उपकला सेल का एक साइड व्यू प्रदान करता है, जबकि पार्श्व क्षेत्रों में प्लानर (XY) दृश्य उपकला बहुभुज आकार के दृश्य की अनुमति देता है। स्वस्थ लेंस में, हम कोशिकाओं के बीच किसी भी अंतराल का निरीक्षण नहीं करते हैं। हम एक छवि में कोशिकाओं की आबादी का पता लगाकर और आरओआई के भीतर कोशिकाओं की संख्या से क्षेत्र को विभाजित करके औसत सेल क्षेत्र की गणना कर सकते हैं। कोशिकाओं की संख्या किसी दिए गए आरओआई में होचस्ट-दाग वाले नाभिक की संख्या की गणना करके निर्धारित की जाती है। विश्लेषण 260 माइक्रोन2 के एक औसत सेल क्षेत्र को दर्शाता है जो पिछले अध्ययनों 2,4 के अनुरूप है।

नाभिक का होचस्ट धुंधला भी उपकला कोशिकाओं में लेंस उपकला सेल परमाणु मॉर्फोमेट्री की परीक्षा के लिए अनुमति देता है। ऑर्थोगोनल (XZ) अनुमान नाभिक के एक पक्ष दृश्य के लिए अनुमति देते हैं। प्लानर (XY) दृश्य नाभिक के गोलाकार/दीर्घवृत्त आकृतियों को प्रदर्शित करता है। ट्रेसिंग नाभिक व्यक्तिगत कोशिकाओं के परमाणु क्षेत्र, और अन्य आकार मापदंडों जैसे परिपत्रता की गणना करने की अनुमति देता है। विश्लेषण 0.8 की औसत परिपत्रता के साथ 64 माइक्रोन2 के औसत परमाणु क्षेत्र को प्रदर्शित करता है। 1 के करीब परिपत्रता मान एक पूर्ण वृत्त का संकेत देते हैं, जबकि 0 के करीब आने वाले मान अधिक लम्बी आकृति विज्ञान का संकेत देते हैं।

भूमध्यरेखीय उपकला सेल पैकिंग, फाइबर सेल हेक्सागोनल पैकिंग, और फाइबर सेल चौड़ाई
लेंस भूमध्यरेखीय क्षेत्र का प्लानर (XY) दृश्य षट्भुज के आकार और नियमित रूप से पैक किए गए लेंस उपकला कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है जो फुलक्रम पर अभिसरण करते हैं। फुलक्रम वह जगह है जहां लम्बी उपकला कोशिकाओं की शिखर युक्तियाँ भूमध्य रेखा 4,13,14,15 (चित्रा 6बी, एक लाल धराशायी रेखा द्वारा इंगित) पर प्रारंभिक फाइबर सेल भेदभाव और बढ़ाव के दौरान एक लंगर बिंदु बनाने के लिए संकुचित होती हैं। फुलक्रम को बढ़े हुए एफ-एक्टिन धुंधला के आधार पर स्थानीयकृत किया जा सकता है, जो भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाओं और फाइबर कोशिकाओं (चित्रा 6 बी, लाल धराशायी रेखा) को अलग करने वाली एक सतत रेखा बनाता है। सेलुलर झिल्ली पर एफ-एक्टिन धुंधला भी सेल आकार में परिवर्तन को दर्शाता है, जिसमें फुलक्रम के नीचे की कोशिकाओं को ठीक से गठबंधन किया जाता है और समानांतर पंक्तियों (चित्रा 6) में व्यवस्थित किया जाता है। सेल नाभिक भी फुलक्रम के नीचे संरेखित होते हैं।

लेंस मेरिडियल पंक्ति उपकला कोशिकाओं और फाइबर कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, XY विमान में फुलक्रम (लेंस कैप्सूल की ओर) के लिए एक छवि 4.5-5 माइक्रोन परिधीय है, जहां मेरिडियल पंक्ति कोशिकाओं के बेसल क्षेत्र को देखने में हैं, पहले वर्णित20 के रूप में चुना गया है। मेरिडियल पंक्ति विकार को मापने के लिए, ब्याज का एक क्षेत्र (आरओआई) उल्लिखित है (चित्रा 7 ए; पीला बॉक्स)। वाइल्डटाइप लेंस छवि में आरओआई का क्षेत्र 15,833 माइक्रोन2 है। चूंकि कोई अवलोकन योग्य विकार नहीं है, विकार प्रतिशत का क्षेत्र 0 है। महत्वपूर्ण भूमिका है कि गैर मांसपेशी myosin IIA (NMIIA) एक NMIIA-E1841K उत्परिवर्तन के साथ चूहों का उपयोग सेल हेक्सागोनल पैकिंग में निभाता है पहले20 वर्णित किया गया है. चित्रा 7 ए मेरिडियल रो सेल विकार को प्रदर्शित करने के लिए एक प्रतिनिधि एनएमआईआईएई 1841 के / ई 1841 के लेंस भूमध्यरेखीय छवि दिखाता है। मेरिडियल रो ROI 20,757μm2 था। इसके बाद, अव्यवस्थित पैच के कुल क्षेत्र का पता लगाया गया था। विकार का कुल क्षेत्र 3,185 माइक्रोन2 था। विकार का गणना प्रतिशत 15.3% (अव्यवस्थित क्षेत्र x 100 / कुल आरओआई; चित्रा 7 बी)। यह प्रतिशत अव्यवस्थित क्षेत्र पिछले अध्ययन20 में सीमा के भीतर है।

अगला, जंगली प्रकार मेरिडियल पंक्ति कोशिकाओं में हेक्सागोनल पैकिंग की एक परीक्षा20 का प्रदर्शन किया गया था. क्योंकि एफ-एक्टिन मेरिडियल पंक्ति कोशिकाओं की पूरी परिधि के आसपास और जंगली प्रकार (यानी, एनएमआईआईए +/+) लेंस में सेल झिल्ली के बेसल क्षेत्रों के सभी छह शीर्षों पर समृद्ध होता है, एफ-एक्टिन धुंधला सेल आकार और पैकिंग संगठन का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया था। प्रतिनिधि छवि 1 में, कोशिकाओं लेबल किया गया था और प्रत्येक सेल के आसपास आसन्न कोशिकाओं की संख्या गिना गया था. छवि 1 में, सभी दस कोशिकाओं में छह आसन्न कोशिकाएं होती हैं, जो बताती हैं कि इन कोशिकाओं को मधुकोश पैकिंग संगठन (चित्रा 8) में व्यवस्थित किया जाता है। इसके विपरीत, 10 कोशिकाओं में से आठ (कोशिकाओं का 80%) छवि 2 में छह आसन्न कोशिकाएं हैं जो इंगित करती हैं कि कोशिकाएं अनियमित रूप से पैक की जाती हैं (चित्र 8)।

अंत में, फाइबर सेल चौड़ाई को मापने के लिए, परिधीय फाइबर कोशिकाओं रोडामाइन-phalloidin के साथ लेबल तय जंगली प्रकार लेंस में फुलक्रम से आवक ~ 10 माइक्रोन आवक स्थित जांच की गई(चित्रा 9A)2,4. ध्यान दें, लाइव tdTomato चूहों का उपयोग करके फाइबर सेल की चौड़ाई को मापना भी संभव है, हालांकि, लेंस से संकेत जो tdTomato के लिए विषमयुग्मजी हैं, भूमध्यरेखीय क्षेत्रों में कमजोर हो जाता है। इसलिए, tdTomato के लिए समरूप हैं कि चूहों का उपयोग करने की सिफारिश की है के रूप में वे मजबूत प्रतिदीप्ति है (नहीं दिखाया गया). लाइन-स्कैन विश्लेषण का उपयोग करके एफ-एक्टिन-सना हुआ सेल सीमाओं के बीच की दूरी को फाइबर सेल चौड़ाई 2,4(चित्रा 9बी)को इंगित करने के लिए पहले वर्णित के रूप में मापा गया था। इस विश्लेषण से पता चला है कि जंगली प्रकार के लेंस में औसत इंटरपीक दूरी 11.45 ± 2.11 माइक्रोन (4 अलग-अलग माउस लेंस छवियों, चित्रा 9 बी से एन = 117 फाइबर कोशिकाएं) है।

Figure 1
चित्रा 1: इमेजिंग के दौरान लेंस को स्थिर करने के लिए अगारोज डिवोट बनाने के लिए कदम। (ए) एक गिलास नीचे पकवान का प्रयोग, विंदुक 2% agarose तरल. (बी) एक लचीला कवर पर्ची के साथ चपटा और (सी) जब ठंडा, ठीक टिप संदंश का उपयोग कर हटा दें. (डी) डिवोट के लिए, 3 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके एक छेद बनाएं। (ई) अवशिष्ट agaros महाप्राण, पीबीएस के साथ कुल्ला, एक लिंट मुक्त ऊतक का उपयोग कर सतह साफ पोंछें। (F) पूरे लेंस को डिवोट के भीतर सावधानी से माउंट करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इमेजिंग लेंस भूमध्यरेखीय उपकला और फाइबर कोशिकाओं के लिए अगारोज डिवोट बनाने के लिए कदम। (ए) टिशू कल्चर डिश में 2% पिघला हुआ agarose डालो. (बी) कमरे के तापमान पर एगरोज़ को ठंडा करें जब तक कि यह पूरी तरह से जम न जाए। (सी) एक तेज ब्लेड के साथ, एक त्रिकोणीय डिवोट बनाएं। (डी)टिशू कल्चर डिश में 1x पीबीएस के 1 एमएल रखो. (ई) विच्छेदित लेंस को वेज में रखें (एफ) लेंस अपने भूमध्य रेखा पर अगारोज दीवारों (लाल तीर) के बीच स्थित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लेंस कैप्सूल मोटाई का निर्धारण। धनु (एक्स, जेड प्लेन व्यू) (ए) लाइव और (बी) फिक्स्ड लेंस कैप्सूल के कॉन्फोकल जेड-स्टैक के पुनर्निर्माण से ऑप्टिकल खंड। (सी) लाइव और (डी) फिक्स्ड लेंस के लाइन स्कैन की फ्लोरोसेंट तीव्रता एक एकल डब्ल्यूजीए (हरा) शिखर प्रदर्शित करती है जो कैप्सूल की ऊपरी सतह और कैप्सूल से सटे उपकला कोशिकाओं (लाल) के बेसल क्षेत्र से मेल खाती है। कैप्सूल की मोटाई निर्धारित करने के लिए दो चोटियों के बीच की दूरी को मापा जाता है। छवियों को 1 हवादार इकाई पिनहोल के साथ 40x तेल उद्देश्य का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः tdTomato/Rhodamine-Phalloidin और WGA चैनलों में 1.0 माइक्रोन और 1.2 माइक्रोन के ऑप्टिकल खंड होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: उपकला सेल क्षेत्र की मात्रा का ठहराव। (ए) एक्स, जेड लेंस उपकला कोशिकाओं के विमान दृश्य (बी) सेल झिल्ली के लिए टीडीटमाटर और नाभिक के लिए (सी) होचस्ट के साथ चिह्नित है। (डी) लेंस उपकला कोशिकाओं के मध्य क्षेत्र का एक्स, वाई विमान दृश्य। (ई) tdTomato संकेत का उपयोग फोकस में कोशिकाओं के समूह के अनुरूप ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए एक गाइड के रूप में किया जाता है। (च) परिभाषित क्षेत्र का क्षेत्रफल निर्धारित किया जाता है। (जी) नाभिक के लिए होचस्ट धुंधला परिभाषित क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (एच) नाभिक की संख्या को (I) FIJI ImageJ के मल्टीपॉइंट टूल का उपयोग करके गिना जाता है। औसत सेल क्षेत्र की गणना करने के लिए, कोशिकाओं की कुल संख्या से ब्याज के परिभाषित क्षेत्र के कुल क्षेत्र को विभाजित करें। छवियाँ एक 1 हवादार इकाई पिनहोल के साथ एक 63x तेल उद्देश्य का उपयोग कर अधिग्रहीत 0.7 माइक्रोन और 1.0 माइक्रोन के ऑप्टिकल वर्गों में जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः Hoechst और tdTomato चैनलों, में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: परमाणु क्षेत्र और आकार का निर्धारण। (ए) नाभिक के मध्य क्षेत्र का XY विमान दृश्य। (बी) ब्याज का एक क्षेत्र जहां नाभिक फोकस में हैं, परिभाषित किया गया था। आरओआई के भीतर नाभिक को रेखांकित किया गया है। (सी) व्यक्तिगत कोशिकाओं के नाभिक के क्षेत्र और परिपत्र को सारणीबद्ध किया गया था और क्षेत्र और परिपत्र के लिए औसत की गणना की गई थी। 1 हवादार इकाई पिनहोल के साथ 63x तेल उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त की गई छवियां, जिसके परिणामस्वरूप होचस्ट चैनल में 0.7 माइक्रोन का ऑप्टिकल सेक्शन होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: लेंस फुलक्रम की पहचान। एफ-एक्टिन और नाभिक का उपयोग फुलक्रम और मेरिडियल पंक्तियों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। (ए) एक्सजेड दृश्य एफ-एक्टिन के लिए समृद्ध फैलोलाइडिन धुंधला दिखाता है जो फुलक्रम से मेल खाता है। (बी) फोकस में लेंस फुलक्रम के साथ एकल ऑप्टिकल XY विमान दृश्य अनुभाग। नाभिक के लिए होचस्ट धुंधला होने से पता चलता है कि फुलक्रम के ऊपर नाभिक अनियमित रूप से पैक होते हैं जबकि फुलक्रम के नीचे के नाभिक ठीक से संरेखित होते हैं (ऊपर दाएं)। एफ-एक्टिन के लिए फालोलाइडिन धुंधला होने से पता चलता है कि फुलक्रम के ऊपर की कोशिकाएं अनियमित आकार की होती हैं जबकि फुलक्रम के नीचे की कोशिकाएं समानांतर पंक्तियों (नीचे बाएं) में पैक की जाती हैं। लाल धराशायी रेखा फुलक्रम का स्थान दिखाती है। छवियाँ एक 1 हवादार इकाई पिनहोल के साथ एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर अधिग्रहीत क्रमशः Hoechst, Rhodamine-Phalloidin, और WGA-640 चैनलों में 1.5 माइक्रोन, 2.0 माइक्रोन और 2.2 माइक्रोन के ऑप्टिकल वर्गों में जिसके परिणामस्वरूप. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: मेरिडियल पंक्ति विकार का निर्धारण। (ए) वाइल्डटाइप का सिंगल XY प्लेन व्यू ऑप्टिकल सेक्शन और NMIIAE1841K/E1841K मेरिडियल रो सेल ~ फुलक्रम से 5 माइक्रोन दूर (लेंस कैप्सूल की ओर)। पूरे मध्याह्न पंक्ति कोशिकाओं को परमाणु संरेखण के आधार पर नीले रंग में रेखांकित किया गया है। वाइल्डटाइप लेंस में एफ-एक्टिन (लाल) धुंधला होने से पता चलता है कि मेरिडियल पंक्ति कोशिकाओं को विकार (0%) के कोई संकेत नहीं के साथ ठीक से गठबंधन किया जाता है। वाइल्डटाइप में एक प्रतिनिधि आदेशित क्षेत्र उल्लिखित है (नारंगी)। अव्यवस्थित कोशिकाओं वाले लेंस में, हम अव्यवस्थित क्षेत्रों (पीले) को रेखांकित करते हैं। (बी) वाइल्डटाइप (ए में नारंगी बॉक्स) से आदेशित क्षेत्र का उच्च आवर्धन। (सी) विभिन्न प्रकार के विकार दिखाने वाले अव्यवस्थित क्षेत्रों का उच्च आवर्धन (I) पंक्तियों की शाखा, (II) अनियमित सेल आकार और मधुकोश पैकिंग का नुकसान, और (III) पंक्तियों का गलत संरेखण। NMIIAE1841K/E1841K लेंस की छवियां 15.3% मेरिडियल रो सेल डिसऑर्डर दिखाती हैं। छवियाँ एक 1 हवादार इकाई पिनहोल के साथ एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर अधिग्रहीत 1.5 माइक्रोन के ऑप्टिकल वर्गों में जिसके परिणामस्वरूप, और क्रमशः Hoechst और Rhodamine-Phalloidin चैनलों में 2.0 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: लेंस मेरिडियल पंक्ति सेल मधुकोश पैकिंग का विश्लेषण। (ए) एफ-एक्टिन के लिए रोडामाइन-फालोलाइडिन के साथ दाग मेरिडियल पंक्ति कोशिकाओं के एकल ऑप्टिकल एक्सवाई खंड। कम आवर्धन छवियों (शीर्ष पैनल), कोशिकाओं का मूल्यांकन किया जा रहा है (गुलाबी रंग में गिने हुए) दिखाएँ. पीले रंग में उल्लिखित क्षेत्र बढ़े हुए (निचला पैनल) है। पीले रोमन अंक आसन्न कोशिकाओं की गिनती हैं। चित्र 1 उन कोशिकाओं को दिखाता है जो आकार में सभी षट्भुज हैं, प्रत्येक में 6 आसन्न कोशिकाएं हैं। छवि 2 में सेल नंबर 1 और 5 के साथ क्रमशः 5 और 7 आसन्न कोशिकाएं हैं। (बी) डेटा की गणना हेक्सागोनल कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ दर्ज और सारणीबद्ध की जाती है। छवियाँ एक 1 हवादार इकाई पिनहोल के साथ एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर अधिग्रहीत Rhodamine-Phalloidin चैनल में 1.0 माइक्रोन के एक ऑप्टिकल खंड में जिसके परिणामस्वरूप. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: फाइबर सेल चौड़ाई का विश्लेषण। (ए) फुलक्रम से लेंस फाइबर कोशिकाओं ~ 10 माइक्रोन के एकल ऑप्टिकल XY दृश्य अनुभाग। कोशिकाओं को कोशिका झिल्ली पर एफ-एक्टिन दृश्य के लिए रोडामाइन-फैलोलाइडिन के साथ दाग दिया गया था। एक रेखा (गुलाबी; डैश) कई फाइबर कोशिकाओं पर खींची जाती है। (बी) दूरी के एक समारोह के रूप में एफ-एक्टिन तीव्रता का प्रतिनिधि लाइन स्कैन। इंटरपीक दूरी फाइबर सेल चौड़ाई का प्रतिनिधित्व करती है। छवियाँ एक 1 हवादार इकाई पिनहोल के साथ एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर अधिग्रहीत Rhodamine-Phalloidin चैनलों में 1.0 माइक्रोन के एक ऑप्टिकल अनुभाग में जिसके परिणामस्वरूप. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल लेंस के पूर्वकाल और भूमध्यरेखीय क्षेत्रों में परिधीय लेंस संरचनाओं और कोशिकाओं के उच्च स्थानिक संकल्प दृश्य को सक्षम करते हैं। इस अध्ययन में, बरकरार (लाइव या निश्चित) लेंस का उपयोग करके लेंस परिधीय संरचनाओं के दृश्य के लिए तरीके दिखाए गए थे जहां समग्र 3 डी लेंस वास्तुकला संरक्षित है। इसके अतिरिक्त, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध फिजी इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मॉर्फोमेट्रिक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सरल तरीके प्रदान किए गए थे। पिछले अध्ययनों में पूरे माउंट विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण विधियों का उपयोग किया गया है। इन विधियों ने हमें पूर्वकाल कैप्सूल और कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को लेंस आकार परिवर्तन याउम्र बढ़ने 2,4 को समझने की अनुमति दी। इन विधियों का उपयोग लेंस आकार परिवर्तन याउम्र बढ़ने 2,4 के कारण भूमध्यरेखीय फाइबर सेल विस्तार की जांच करने और सटीक हेक्सागोनल आकार और परिधीय फाइबर सेल संगठन20 स्थापित करने में एनएमआईआईए की भूमिका निर्धारित करने के लिए भी किया गया है।

पूरे माउंट इमेजिंग लेंस संरचना के उच्च स्थानिक संकल्प एन चेहरा इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. पूर्वकाल लेंस क्षेत्र में, पूरे-माउंट इमेजिंग क्षति को रोककर फ्लैट-माउंट इमेजिंग के लिए फायदेमंद है जो कैप्सूल संरचना अखंडता और / या उपकला सेलुलर आकृति विज्ञान को बदल सकता है। इसके अतिरिक्त, उपकला और फाइबर कोशिकाओं के बीच इंटरफ़ेस संरक्षित है। यह विधि लेंस अनुभागों के दृश्य पर लाभ प्रदान करती है क्योंकि एन फेस इमेजिंग अधिक स्थानिक संकल्प प्रदान करती है और उपकला सेल क्षेत्र और परमाणु क्षेत्र / इसके अलावा, इमेजिंग विधियां लेंस के भूमध्यरेखीय क्षेत्रों के साथ विशिष्ट बिंदुओं पर रूपात्मक विशेषताओं को निर्धारित करने की अनुमति देती हैं, जो हेक्सागोनल आकार, मेरिडियल पंक्ति सेल पैकिंग, फुलक्रम और फाइबर सेल चौड़ाई के दृश्य को सक्षम करती हैं, जो इमेजिंग-सना हुआ लेंस वर्गों के माध्यम से आसानी से प्राप्त नहीं होगी।

उल्लिखित प्रोटोकॉल समय के साथ विशिष्ट लेंस संरचनाओं और कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए लाइव लेंस की इमेजिंग के लिए भी अनुमति देते हैं। लाइव लेंस इमेजिंग प्रोटोकॉल पिछले अध्ययन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी, जहां लेंस चपटा करने के लिए प्रेरित करने के लिए लेंस संपीड़न से पहले और निम्नलिखित लेंस से कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या से कैप्सूल मोटाई और उपकला सेल क्षेत्र का बार-बार मापविश्लेषण किया गया था। यह निर्धारित किया गया था कि लेंस संपीड़न ने कैप्सूल मोटाई में कमी और उपकला सेल क्षेत्र में वृद्धि को प्रेरित किया। व्यक्तिगत लेंस के बीच कैप्सूल मोटाई और उपकला सेल क्षेत्र में पर्याप्त भिन्नता और लेंस संपीड़न के कारण इन मापदंडों पर प्रभाव की भयावहता के कारण, एक स्वतंत्र माप डिजाइन का उपयोग किया गया था (यानी, व्यक्तिगत गैर-संपीड़ित लेंस बनाम व्यक्तिगत संपीड़ित लेंस की तुलना में) मतभेदों का पता लगाना मुश्किल होगा। लाइव इमेजिंग विधियों का उपयोग करना, लाइव माउस लेंस पर पूरे-माउंट इमेजिंग जो कि उपकलाकोशिकाओं 22 में एफ-एक्टिन की कल्पना करने के लिए लाइफएक्ट-जीएफपी26 को अंतर्जात रूप से व्यक्त करते हैं, जो लाइव एपिथेलियल कोशिकाओं में एफ-एक्टिन पुनर्गठन पर नज़र रखने में सक्षम बनाता है, आयोजित किया गया है।

जबकि उल्लिखित प्रोटोकॉल इमेजिंग माउस लेंस के लिए विकसित किए गए थे और अन्य प्रजातियों में लेंस संरचनाओं की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, धुंधला प्रोटोकॉल अन्य कृंतक लेंस (चूहा, गिनी पिग) के साथ-साथ अन्य स्तनधारी लेंस (गाय, मकाक और मानव; डेटा नहीं दिखाया गया है) में पूर्वकाल और भूमध्यरेखीय परिधीय संरचनाओं दोनों की कल्पना करने के लिए। बड़े लेंस में संरचनाओं के दृश्य लंबे समय तक निर्धारण (4% पीएफए, बर्फ पर, 4 एच), अवरुद्ध (1 एच), और धुंधला (रातोंरात, 4 डिग्री सेल्सियस) की आवश्यकता होती है। ध्यान दें, विभिन्न प्रजातियों में इमेजिंग केवल निश्चित लेंस पर आयोजित की गई थी। अन्य प्रजातियों के लेंस की लाइव इमेजिंग चुनौतीपूर्ण हो सकती है क्योंकि लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक चूहों से लेंस का उपयोग करता है जो फ्लोरोजेनिक प्रोटीन को व्यक्त करते हैं। इसलिए, यह इमेजिंग अन्य प्रजातियों के इमेजिंग लेंस को रोक सकती है जहां आनुवंशिक संशोधन आम नहीं हैं। हालांकि, हम लिपोफिलिक जांच, एफएम 4-64 या एफ-एक्टिन बाध्यकारी जांच, सीआईआर-जसप्लाकिनोलाइड (एसआईआर-एक्टिन) के साथ माउस लेंस को बनाए रखकर लेंस उपकला कोशिका झिल्ली या एफ-एक्टिन के लाइव दृश्य का संचालन करने में सक्षम हैं, क्रमशः (दिखाया नहीं गया है)। अन्य प्रजातियों से लाइव लेंस की छवि के लिए ऐसी जांच का उपयोग करना संभव हो सकता है। हालांकि, ऑफ-टारगेट प्रभावों से बचने के लिए ऐसी जांच का उपयोग करते समय सावधानी बरतनी चाहिए; उदाहरण के लिए, SiR-Jasplakinolide परिवर्तित F-actin गतिशीलता27 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. धुंधला हो जाना तरीकों की एक और सीमा, चाहे लाइव या फिक्स्ड लेंस पर, यह है कि इस तरह की जांच में सीमित पैठ होती है। इसलिए, इमेजिंग परिधीय क्षेत्रों तक सीमित है। टीडी से लेंस का उपयोग करके आंतरिक क्षेत्रों (यानी, गहरी फाइबर कोशिकाओं) की छवि बनाना संभव हैटमाटर ट्रांसजेनिक चूहों4, जो फिर से फ्लोरोजेनिक प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। गहरी फाइबर कोशिकाओं में उज्ज्वल संकेतों के लिए अभिव्यक्ति भी काफी अधिक होनी चाहिए।

फिर भी, उल्लिखित प्रोटोकॉल परिधीय लेंस सुविधाओं 2,4,20 के प्रभावी रूपात्मक मात्रा का ठहराव सक्षम किया है. परिमाणीकरण के तरीके प्रभावी हैं और ओपन-सोर्स, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध फिजी इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं। जबकि ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए मैनुअल ट्रेसिंग टूल का उपयोग किया गया था, ब्याज के क्षेत्रों की पहचान को स्वचालित करना संभव हो सकता है। स्वचालन विशेष संरचनाओं (यानी, नाभिक सीमाओं) की फिजी इमेजजे-आधारित पहचान के लिए कंट्रास्ट बढ़ाने के लिए फ्लोरोसेंट थ्रेसहोल्डिंग को लागू करने के रूप में सरल हो सकता है, या सेल आकार के अंतर (यानी, अनियमित उपकला या फाइबर सेल आकार) का पता लगाने के लिए अधिक जटिल मशीन लर्निंग एल्गोरिदम। अधिक जटिल विश्लेषण के लिए या तो विशेष प्लगइन्स या इमेजिंग सॉफ़्टवेयर की आवश्यकता हो सकती है। विशिष्ट प्लगइन्स या सॉफ़्टवेयर अधिग्रहित जेड-स्टैक से 3 डी वॉल्यूमेट्रिक रूपात्मक उपायों को प्राप्त करने की अनुमति भी दे सकते हैं। कुल मिलाकर, जबकि वर्णित परिमाणीकरण विधियां आसानी से सुलभ, लागत प्रभावी, और कई उपयोगी परिणाम उपायों 2,4,20 के लिए उपयुक्त हैं, इमेजिंग प्रोटोकॉल प्लेटफॉर्म, परिष्कृत सॉफ्टवेयर विश्लेषण के साथ संयोजन में, भविष्य के अध्ययन के लिए अतिरिक्त रूपात्मक माप का खजाना प्रदान कर सकता है।

लेंस विशेष कार्यों के साथ एक जटिल जैविक ऊतक है जो कोशिकाओं के स्थान और गहराई-निर्भर ज्यामिति और उनके संबंधित संरचनाओं पर निर्भर करता है। इमेजिंग प्रोटोकॉल और परिमाणीकरण विधियों का उपयोग यहां प्रदर्शित कैसे लेंस संरचनाओं और लेंस के जटिल संगठन स्थापित कर रहे हैं की एक बड़ी समझ के लिए अनुमति देगा. इसके अलावा, इमेजिंग प्रोटोकॉल और परिमाणीकरण विधियां लेंस संरचना और कार्यों के बीच संबंधों को चित्रित करने में मदद करेंगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल आई इंस्टीट्यूट ग्रांट R01 EY032056 से CC और R01 EY017724 से VMF के साथ-साथ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज द्वारा अनुदान संख्या P20GM139760 के तहत समर्थित किया गया था। एसटीआई को एनआईएच-एनआईजीएमएस टी 32-GM133395 द्वारा रसायन विज्ञान-जीवविज्ञान इंटरफ़ेस प्रीडॉक्टोरल प्रशिक्षण कार्यक्रम के हिस्से के रूप में और डेलावेयर ग्रेजुएट स्कॉलर्स अवार्ड विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Biopsy Punch Acuderm Inc NC9084780
Agarose Apex BioResearch Products 20-102GP
Antimycotic/Antibiotic Cytiva SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Prometheus 25-529
Delicate task wipes Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish) World Precision International FD35-100
Hoescht 33342 Biotium 40046
Laser scanning confocal Microscope 880 Zeiss
MatTek Imaging Dish MatTek Life Sciences P35G-1.5-14
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 100503-917
PBS GenClone 25-507B
Phenol red-free medium 199 Gibco 11043023
Rhodamine-Phalloidin Thermo Fisher 00027
Triton X100 Sigma-Aldrich 11332481001
WGA-640 Biotium CF 640R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Tags

जीवविज्ञान अंक 203
परिधीय लेंस संरचना, सेल आकृति विज्ञान और संगठन की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए पूरे माउंट इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., … More

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., Fowler, V. M., Cheng, C., Parreno, J. Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization. J. Vis. Exp. (203), e66017, doi:10.3791/66017 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter