Summary
본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.
Abstract
수정체는 다양한 거리의 빛을 망막에 집중시키기 위해 모양을 바꾸는 투명하고 유연한 조직입니다. 캡슐이라고 하는 장기를 둘러싼 기저막을 제외하고, 수정체는 전반구에 있는 상피 세포의 단층과 수정체 섬유 세포의 벌크 덩어리로 구성된 완전한 세포입니다. 일생 동안 상피 세포는 수정체 적도의 발아 영역에서 증식하고 적도 상피 세포는 새로 형성된 섬유 세포로 이동, 연장 및 분화합니다. 적도 상피 세포는 무작위로 채워진 조약돌 모양의 세포에서 자오선을 형성하는 정렬된 육각형 모양의 세포로 형태를 실질적으로 변경합니다. 새로 형성된 수정체 섬유 세포는 육각형 세포 모양을 유지하고 전극과 후극을 향해 길쭉하게 뻗어 이전 세대의 섬유 위에 겹쳐진 새로운 세포 껍질을 형성합니다. 수정체 상피 세포의 놀라운 형태 형성을 섬유 세포로 유도하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 렌즈의 구조, 발달 및 기능을 더 잘 이해하기 위해 접안렌즈의 전체 마운트를 사용하여 주변 구조를 이미지화하는 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 여기서는 캡슐 두께, 상피 세포 면적, 세포 핵 면적 및 모양, 자오선 행 세포 순서 및 패킹, 섬유 세포 너비를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 측정은 평생 수정체가 성장하는 동안 발생하는 세포 변화를 설명하고 나이 또는 병리학에 따라 발생하는 변화를 이해하는 데 필수적입니다.
Introduction
수정체는 눈의 앞쪽에 위치한 유연하고 투명한 조직으로, 망막에 빛을 미세하게 초점을 맞추는 기능을 합니다. 렌즈의 기능 능력은 부분적으로는 렌즈의 복잡한 구조와 조직 1,2,3,4,5,6에 기인합니다. 수정체 조직을 둘러싸고 있는 캡슐은 수정체 구조와 생체역학적 특성을 유지하는 데 필수적인 기저막입니다 7,8,9. 수정체 자체는 완전히 세포형이며 상피 세포와 섬유 세포의 두 가지 세포 유형으로 구성됩니다. 상피층은 렌즈(10)의 전반구를 덮는 직육면체 세포의 단층으로 구성된다. 일생 동안 상피 세포는 증식하여 수정체 캡슐을 따라 수정체 적도를 향해 이동합니다. 전방 상피 세포는 단면이 정지되어 있고 조약돌이며, 수정체 적도 근처에서 상피 세포가 증식하여 새로운 섬유 세포로 분화 과정을 거치기 시작합니다11,12. 적도 상피 세포는 무작위로 포장된 세포에서 육각형 모양의 세포가 있는 조직화된 분열 열로 변형됩니다. 육각형 세포 모양은 이러한 분화 세포의 기저 쪽에서 유지되는 반면 정점 쪽은 수정체 받침점 또는 수정체 4,13,14,15에서 수축 및 고정됩니다. 적도 상피 세포가 새로 형성된 섬유 세포로 늘어나기 시작하면 세포의 정점 끝은 전방 상피 세포의 정점 표면을 따라 전극을 향해 이동하는 반면 기저 끝은 수정체 캡슐을 따라 후방 극을 향해 이동합니다. 새로운 세대의 섬유 셀은 이전 세대의 셀을 오버레이하여 섬유의 구형 껍질을 만듭니다. 세포 신장 및 성숙 과정 동안, 섬유 세포는 실질적으로 그들의 형태를 변화시킨다 11,12,16. 이 섬유 세포는 렌즈 질량 11,12,16,17,18의 대부분을 형성합니다.
복잡한 수정체 미세 구조, 세포 형태 및 독특한 세포 조직을 확립하는 데 기여하는 분자 메커니즘은 완전히 알려져 있지 않습니다. 또한, 수정체 캡슐과 세포 구조가 전체 수정체 기능(투명도, 수정체 형태 변화)에 기여하는 정도는 불분명합니다. 그러나 이러한 관계는 새로운 이미징 방법론과 수정체의 구조적 및 세포 특징에 대한 정량적 평가를 사용하여 해명되고 있습니다 2,4,19,20,21,22. 렌즈 캡슐, 상피 세포 및 말초 섬유 세포의 높은 공간 해상도 시각화를 가능하게 하는 전체 렌즈를 이미지화하는 새로운 프로토콜이 개발되었습니다. 여기에는 캡슐 두께, 세포 크기, 세포핵 크기 및 원형도, 자오선 행 순서, 섬유 세포 패킹 및 섬유 세포 너비를 정량화하는 방법론이 포함됩니다. 이러한 시각화 및 이미지 정량화 방법은 심층적인 형태 측정 검사를 가능하게 하며 전체 3D 조직 구조를 보존함으로써 다른 시각화 방법(평면 마운트 또는 조직 절편의 이미징)에 비해 장점이 있습니다. 이러한 방법은 새로운 가설을 검증할 수 있게 해주었으며, 수정체 세포 패턴의 발달과 기능에 대한 이해를 지속적으로 발전시킬 것입니다.
다음 실험에서는 남녀 모두 6주에서 10주 사이의 C57BL/6J 배경에서 야생형 및 Rosa26-tdTomato 마우스 탠덤 이량체-Tomato(B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories))를 사용합니다. tdTomato 마우스는 N-말단 미리스타일화 및 내부 시스테인-팔미토일화 부위를 통해 원형질막을 표적으로 하는 돌연변이된 MARCKS 단백질의 N-말단 8 아미노산에 융합된 tdTomato 단백질의 발현을 통해 살아있는 수정체에서 세포 원형질막을 시각화할 수 있습니다23. 또한 로버트 아델스타인 박사(National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD)로부터 얻은 NMIIAE1841K/E1841K 마우스(24 )를 사용합니다. 앞서 기술한 바와 같이,20, CP49 비드 중간 필라멘트 단백질의 손실(성숙한 섬유 세포 형태 및 전체 수정체 생체역학 유지)이 있는 FvBN/129SvEv/C57Bl6 배경의 NMIIAE1841K/E1841K 마우스는 C57BL6/J 야생형 마우스와 역교배됩니다. 우리는 야생형 CP49 대립유전자의 존재에 대해 자손을 스크리닝했습니다.
컨포칼 이미징은 20x(NA = 0.8, working distance = 0.55mm, 1x zoom), 40x(NA = 1.3 oil objective, working distance = 0.2mm, 1x zoom) 또는 63x(NA = 1.4 oil objective, working distance = 0.19mm, 1x zoom) 배율로 레이저 스캐닝 컨포칼 형광 현미경에서 수행되었습니다. 모든 이미지는 광학 단면 두께의 결정 요인인 핀홀 크기를 사용하여 1 Airy Unit까지 획득했습니다(결과 광학 두께는 그림 범례에 명시되어 있음). 이미지는 Zen Software에서 처리되었습니다. 이미지를 .tif 형식으로 내보낸 다음 FIJI ImageJ Software(imageJ.net)로 가져왔습니다.
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Protocol
생쥐는 병원체가 없는 환경에서 관리되는 델라웨어 대학교 동물 시설에 수용됩니다. CO2 흡입에 의한 안락사를 포함한 모든 동물 절차는 델라웨어 대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 전체 렌즈 마운트 준비 및 이미징
- 전체 마운트 이미징을 위한 렌즈 고정
- 안락사 후 눈의 적출과 수정체를 해부한다25. 해부 후 렌즈를 실온에서 신선한 1x 인산염 완충 식염수(PBS; 1.1mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3.0 mM Na2HPO 4-7H2O; pH 7.4)에 즉시 옮깁니다.
알림: 렌즈를 PBS에 장기간 보관하면 세포 형태가 변경될 수 있으므로 절제 후 ~10분 이내에 즉시 고정하는 것이 좋습니다. - 렌즈 전방 영역의 전체 마운트 이미징을 위해 실온의 마이크로 원심분리 튜브에 있는 1x PBS의 갓 만든 4% 파라포름알데히드(PFA) 0.5mL에 담가 전체 렌즈를 고정합니다. 30분 후 1x PBS로 렌즈를 3번(세탁당 5분) 세척합니다. 1.2단계로 진행하거나 4°C에서 1x PBS에 보관합니다. 고정 렌즈는 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
- 렌즈 적도 영역의 전체 마운트 이미징을 위해 실온의 마이크로 원심분리 튜브에 1x PBS로 갓 만든 4% PFA 0.5mL를 담가 전체 렌즈를 고정합니다. 1시간 후 1x PBS로 렌즈를 3회(세탁 당 5분) 세척합니다. 1.3단계로 진행하거나 4°C에서 1x PBS에 보관합니다. 고정 렌즈는 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
- 안락사 후 눈의 적출과 수정체를 해부한다25. 해부 후 렌즈를 실온에서 신선한 1x 인산염 완충 식염수(PBS; 1.1mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3.0 mM Na2HPO 4-7H2O; pH 7.4)에 즉시 옮깁니다.
- 전방 렌즈 영역의 전체 마운트(고정 또는 라이브)
- fixed lens의 whole-mount 이미징의 경우 1.2.3단계로 진행합니다.
- 살아있는 렌즈의 전체 마운트 이미징의 경우, 1% 항생제/항진균제가 함유된 1mL의 Medium 199(페놀 레드 프리)가 들어 있는 48웰 플레이트의 웰로 렌즈를 옮깁니다. 이미징할 때까지 37°C 및 5%CO2 에서 렌즈를 배양합니다. 이미징하기 전에 형광 표지된 밀 배아 응집체(WGA-640, 1:500) 및 Hoechst 33342(1:500)를 함유한 용액에서 Medium 199에서 최소 10분 동안 렌즈를 배양합니다. 1.5단계로 진행합니다.
- 렌즈 캡슐, F-액틴 및 고정 렌즈의 핵을 염색하려면 WGA-640(1:500), 로다민-팔로이딘(1:50) 및 Hoechst 33342(1:500)가 포함된 500μL 용액에 투과성/차단 완충액(0.3% 트리톤, 0.3% 소 혈청 알부민(분획 V) 및 3% 염소 혈청을 함유한 PBS 1개)를 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 밤새 4°C에서 렌즈를 염색합니다.
- 하룻밤 배양 후 1x PBS 1mL로 렌즈를 3회(세척 당 5분) 세척합니다. 이미징 렌즈로 진행합니다.
- 컨포칼 이미징을 위해 fixed lens를 안정화하려면 앞서 설명한 대로 이미징 접시 상의 agarose에 lens immobilization divots를 생성합니다21 (그림 1).
- 가열하고 용액이 액화될 때까지 전자레인지를 사용하여 PBS에서 2% 아가로스를 부드럽게 혼합합니다. 액화 2% 아가로스 250μL를 유리 바닥 접시에 피펫팅하고(그림 1A) 유연한 플라스틱 커버슬립을 사용하여 접시 전체에 아가로스를 평평하게 만듭니다(그림 1B). 아가로스가 냉각되고 완전히 응고되면 가는 팁 겸자(그림 1C)를 사용하여 커버슬립을 제거하고 3mm 생검 펀치를 사용하여 접시 중앙에 아가로스에 구멍을 만듭니다(그림 1D).
- 섬세한 작업 와이프를 사용하여 과도한 아가로스를 제거합니다(그림 1E). 아가로스 몰드를 1x PBS로 수화하고 사용할 때까지 4°C에서 유지합니다. 아가로스 몰드는 최대 1주일 동안 성공적으로 보관되었습니다.
- 배아 겸자를 사용하여 살아있는 렌즈 또는 고정 렌즈를 1x PBS(고정 렌즈) 또는 페놀 적색이 없는 배지 199(라이브 렌즈)의 ~2mL가 들어 있는 아가로스(그림 1F)의 디봇으로 부드럽게 옮긴 다음 접시를 도립 현미경 스테이지에 놓습니다. 렌즈가 대물렌즈를 향하는 앞쪽 영역에 위치하는지 확인하려면 핵 염색을 시각화합니다. 핵이 관찰되지 않으면 후방 영역이 대물렌즈를 향하고 있을 수 있습니다.
- 렌즈를 뒤집으려면 구부러진 집게를 사용하고 렌즈를 ~180° 부드럽게 회전시켜 앞쪽 영역이 대물렌즈를 향하도록 합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.
- 렌즈 캡슐의 시각화를 위해 스텝 크기가 0.3μm인 40x 대물렌즈를 사용하여 z-stack 이미지를 획득합니다. 렌즈 캡슐 표면 이전의 첫 번째 이미지(WGA 염색으로 표시)와 상피 세포의 정점 표면 이후의 마지막 이미지를 획득합니다. 상피 세포를 시각화하려면 렌즈 상피 세포의 시각화를 위해 스텝 크기가 0.3μm인 63x 대물렌즈를 사용하여 z-stack 이미지를 획득하십시오.
참고: 이러한 현미경 매개변수는 캡슐 두께 또는 상피 세포 면적의 이미지 정량화에 필수적인 이미지의 적절한 3차원(3D) 재구성을 허용합니다. 또한 앞서 설명한 바와 같이 상피 세포 단층을 지나 이미징하여 라이브 렌즈 tdTomato 렌즈에서 봉합사를 이미지화할 수 있습니다4.
- 수정체 적도 상피 및 섬유 세포 염색
- 미세 원심분리 튜브 내의 투과성/차단 용액(3% BSA, 3% 염소 혈청 및 0.3% Triton)에 있는 rhodamine-phalloidin(1:300), WGA-640(1:250) 및 Hoechst 33342(1:500)의 0.5mL 용액에 고정 렌즈를 넣습니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 유지합니다.
- 하룻밤 배양 후 렌즈를 1mL 1x PBS에 3번 세척합니다(세척 당 5분).
- 앞서 설명한 바와 같이 렌즈 고정화 아가로스 웨지를 생성합니다 4,10.
- 간단히 말해서, 35x PBS에서 ~6-5mL의 용융된 2% 아가로스를 접시에 부어 유리 바닥 접시(FD1-100, WPI)에 아가로스 웨지를 만듭니다(그림 2A). 아가로스가 응고되면(그림 2B) 날카로운 칼날이 있는 삼각형 디봇을 만듭니다(그림 2C). 아가로스 웨지를 제거하고 1x PBS 1mL를 아가로스 접시에 넣습니다(그림 2D).
- 아가로스를 절단할 때 남을 수 있는 잔여 아가로스를 흡인합니다. 다양한 크기의 렌즈(표시되지 않음)에 맞도록 접시당 여러 개의 웨지를 만들 수 있습니다. 아가로스 몰드를 보관하려면 1x PBS 1mL를 아가로스 몰드에 놓고 4°C에서 보관합니다. 웨지는 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
- 곡선형 핀셋을 사용하여 1x PBS 1mL가 들어 있는 아가로스 웨지 안에 렌즈를 놓고 렌즈의 적도 영역이 컨포칼 대물렌즈 위의 현미경 유리를 아래로 향하도록 조정합니다(그림 2E-F). 적도 영역에 초점이 맞춰져 있는지 확인하려면 핵을 시각화하고 핵이 적도에서 일렬로 정렬되어 있는지 확인합니다. 적도 상피 세포는 불규칙하게 포장되고 모양이 형성되어 있기 때문에 식별 할 수 있습니다. 또한 자오선 행 세포는 정밀하게 정렬되고 육각형 모양이며 세포막에서 F-actin 염색으로 표시됩니다.
- 시야의 핵이 무작위로 채워져 있으면 수정체의 앞쪽이 대물렌즈를 향하게 됩니다. 핵을 관찰할 수 없는 경우 수정체의 뒤쪽이 대물렌즈를 향하고 있을 가능성이 큽니다. 렌즈가 적도에 있지 않으면 렌즈의 방향을 바꾸고 렌즈 적도에 정확하게 정렬된 핵이 관찰될 때까지 곡선 핀셋을 사용하여 렌즈를 회전시킵니다.
- 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경(20x objective, NA = 0.8, step size 0.5 μm 및/또는 40x oil objective, NA = 1.3, step size 0.4 μm)을 사용하여 렌즈 적도 상피 및 섬유 세포를 이미지화합니다. 적도 상피 세포가 맨 위에 있고 그 뒤에 자오선 열과 섬유 세포가 바로 아래에 있는 z-stack 수집 전에 이미지를 회전합니다.
2. 이미지 분석 방법론
- 렌즈 캡슐 두께 측정
- WGA로 라벨링된 라이브 tdTomato 렌즈 또는 WGA 및 rho-phalloidin으로 라벨링된 고정 렌즈의 40x 대물렌즈(0.3μm 스텝 크기)로 얻은 z-stack 이미지를 사용하여 3D 재구성의 XZ 뷰에서 광학 2D 프로젝션을 얻고 .tif 형식으로 저장합니다. Zen 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다.
- FIJI ImageJ 소프트웨어에서 XZ 슬라이스(.tif) 이미지를 엽니다.
- 렌즈 캡슐 두께를 측정하려면 직선 기능( 그림 3A, B 참조)을 사용하십시오. Edit > Options > Line width를 선택하여 선 너비를 50픽셀로 설정합니다. 이 선폭은 현미경 설정에서 높은 신호 대 잡음비를 제공하기 위해 경험적으로 결정되었습니다. 최적의 선폭은 다른 현미경/현미경 설정 또는 다른 종의 렌즈를 사용할 때 다를 수 있습니다. 다음으로, 캡슐의 상단 표면에서 상피 세포의 기저 영역 아래까지 선을 그립니다.
- Ctrl + T를 눌러 선을 관심 영역으로 저장합니다.
- 채널을 이미지, 색상 및 분할 채널에 대한 탭으로 구분합니다.
- Ctrl + K를 눌러 캡슐 채널의 선을 따라 강도를 측정합니다.
- 스프레드시트에서 강도 값을 거리의 함수로 플로팅하고 상피 세포의 캡슐 표면과 기저 영역을 각각 나타내는 캡슐 및 F-액틴의 강도 피크를 결정합니다. x축에는 선 거리가 있습니다.
- 다음으로, 캡슐과 상피 형광 강도 피크 사이의 거리를 결정하여 캡슐 두께를 계산합니다(그림 3C, D).
- 세포 면적 분석
- 63x 대물렌즈(NA = 1.4, 0.3μm 단계 크기)를 사용하여 얻은 z-stack 이미지를 라이브 tdTomato 렌즈 또는 phalloidin으로 표지된 고정 렌즈에서 상피 세포의 중간(측면) 영역에 초점이 맞춰진 위치에 해당하는 z-stack 컨포칼 이미지에서 XY 뷰 슬라이스를 분석합니다. tdTomato 멤브레인 염료를 사용하거나 외측 세포막에 존재하는 팔로이딘을 시각화하여 외측 막은 볼 수 있습니다.
참고: 렌즈의 곡률로 인해(XZ에서 볼 수 있듯이; 그림 4A-C), 모든 상피 세포가 이미지에서 초점이 맞춰지는 것은 아닙니다. 상피의 중간 영역은 세포 측막(그림 4D-E)과 핵(그림 4G-I)에 초점이 맞춰진 영역에 해당합니다. - 이미지를 .tif로 내보내고 FIJI ImageJ에서 엽니다.
- 분석을 위해 FIJI ImageJ에서 축척을 설정하려면 선 도구를 사용하여 공초점 이미지에서 축척 막대 길이인 선을 만듭니다.
- 선의 픽셀 길이와 축척 막대의 길이를 기록합니다. 도구 모음 메뉴에서 Analyze(분석)로 이동하여 Set Scale(배율 설정)을 선택합니다. Distance in Pixels(픽셀 단위 거리)에 선의 길이인 픽셀 수를 입력하고 Known Distance(알려진 거리) 입력에 축척 막대의 알려진 길이를 입력합니다.
- tdTomato 또는 rhodamine-phalloidin 염색을 세포 경계 표시로 사용하여 다각형 도구를 사용하여 이미지 내에서 초점이 맞춰진 세포 집단의 윤곽을 수동으로 그립니다. 외측막이 보이는 세포만 추적하고(그림 4E) 부분적으로 보이는 세포(예: 이미지 가장자리)는 추적하지 않습니다. Ctrl+T를 눌러 ROI를 저장합니다. 도구 모음 메뉴에서 Edit(편집)로 이동하여 Clear Outside(외부 지우기)를 선택합니다. 이제 FIJI ImageJ에서 Ctrl + M 을 눌러 총 셀 면적(ROI)을 측정합니다.
- ROI 영역을 총 셀 수로 나누어 평균 셀 면적을 계산합니다. 세포의 수를 결정하는 간단한 방법은 핵의 수를 세는 것입니다. 핵 채널(파란색)로 이동합니다. ROI 메뉴에서 저장된 셀의 ROI 개요를 선택합니다(그림 4G). Edit(편집)로 이동한 다음 Clear outside(외부 지우기 )를 클릭하여 ROI 외부를 지웁니다(그림 4H). Multi-point 도구를 사용하여 개별 핵을 클릭하여 핵을 계산합니다.
- 63x 대물렌즈(NA = 1.4, 0.3μm 단계 크기)를 사용하여 얻은 z-stack 이미지를 라이브 tdTomato 렌즈 또는 phalloidin으로 표지된 고정 렌즈에서 상피 세포의 중간(측면) 영역에 초점이 맞춰진 위치에 해당하는 z-stack 컨포칼 이미지에서 XY 뷰 슬라이스를 분석합니다. tdTomato 멤브레인 염료를 사용하거나 외측 세포막에 존재하는 팔로이딘을 시각화하여 외측 막은 볼 수 있습니다.
- 세포 핵 영역 및 형상 분석
- 핵 면적 및 형상 분석의 경우, tdTomato 상피 세포의 중간(측면) 영역에 초점이 맞춰진 위치에 해당하는 z-stack 공초점 이미지에서 XY 평면도 광학 단면을 분석합니다. 핵 영역이 가장 큰 공초점 이미지에서 z-stack 슬라이스를 분석합니다(그림 5A). 이것은 핵의 중간 부분을 나타냅니다.
NOTE: 렌즈의 곡률로 인해 XZ 뷰에서 볼 수 있듯이 모든 핵에 초점이 맞춰지는 것은 아닙니다(그림 4G 및 그림 5A). - 초점이 맞춰진 핵의 부분집단을 선택하고 ROI를 저장합니다.
- 외부 지우기 기능을 사용합니다. ROI 내에서 자유형 선택 도구(왼쪽에서 네 번째 메뉴 버튼)를 사용하여 핵의 경계를 주의 깊게 추적합니다(그림 5B). Ctrl+T를 눌러 각 핵 추적을 ROI 창에 저장합니다. 완전한 핵을 볼 수 있고 핵이 서로 닿지 않는 외곽선 핵만 있습니다.
- 모든 핵의 윤곽이 잡히면 Ctrl+M을 눌러 개별 세포의 핵 영역과 모양(즉, 원형도)을 측정합니다.
- 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣고 평균 핵 면적과 원형도를 계산합니다(그림 5C).
- 핵 면적 및 형상 분석의 경우, tdTomato 상피 세포의 중간(측면) 영역에 초점이 맞춰진 위치에 해당하는 z-stack 공초점 이미지에서 XY 평면도 광학 단면을 분석합니다. 핵 영역이 가장 큰 공초점 이미지에서 z-stack 슬라이스를 분석합니다(그림 5A). 이것은 핵의 중간 부분을 나타냅니다.
- 자오선 행 상피 패킹
- 자오선 장애를 측정하려면 20x 대물렌즈(0.5μm 스텝 크기)를 사용하여 이미지를 획득합니다.
- 이미지에서 렌즈 받침점/수정체를 식별합니다. 받침점은 길쭉한 상피 세포의 정점 끝이 수축하여 적도에서 초기 섬유 세포 분화 및 신장 중에 앵커 포인트를 형성하는 영역입니다. 밝은 F-액틴 강도( 그림 6A의 XZ 보기에서는 화살촉으로 표시, 그림 6B에서는 빨간색 점선으로 표시)를 기반으로 받침점을 식별하고 XY 보기의 단일 광학 섹션에서 세포 조직의 변화를 식별합니다.
참고: 또한, 상피 세포의 기저 영역과 정점 영역 모두의 F-액틴 염색은 받침점 위에서 뚜렷하게 나타나는 반면, 길쭉한 세포의 기저 영역만 받침점 아래에서 뚜렷하게 나타납니다(그림 6A). 지렛대 선 위의 상피 세포는 불규칙하게 채워져 있고 로제트를 형성하는 경향이 있는 반면, 지렛대 아래의 섬유 세포는 평행한 줄로 배열되어 있으며 막에서 밝은 F-액틴 염색으로 표시됩니다(그림 6B). - 2개월 된 마우스에서 받침점이 확인되면 XY 평면의 받침점(렌즈 캡슐 쪽)에 대한 주변 ~4.5-5μm의 단일 광학 섹션을 선택합니다. 이 거리는 2개월 된 마우스의 자오선 행 세포의 모든 핵이 받침점 주변부에 ~5μm 있을 때 초점이 맞춰져 있다는 관찰을 기반으로 선택됩니다. 단일 광학 섹션(.tif)을 저장합니다. FIJI에서 이미지를 엽니다.
참고: 이 분석은 2개월 된 쥐에 대해서만 수행되었으므로 이 거리가 나이에 따라 변하는지 여부를 결론지을 수 없습니다. - 이미지 분석을 수행하기 전에 2.2.2단계를 사용하여 ImageJ에서 스케일을 μm로 설정합니다.
- 그림 7A와 같이 핵 정렬을 식별하여 자유형 라인 도구(관심 영역/ROI)를 사용하여 전체 자오선 행 영역의 윤곽을 수동으로 그립니다. Ctrl+T를 눌러 ROI를 저장합니다. 도구 모음 메뉴에서 Edit(편집)로 이동하여 Clear Outside(외부 지우기)를 선택합니다. FIJI ImageJ에서 Ctrl + M을 눌러 총 셀 면적(ROI)을 측정합니다.
- FIJI ImageJ의 자유형 라인 도구를 사용하여 윤곽을 그려 F-액틴 염색으로 표시된 무질서 영역을 식별합니다. 무질서한 영역에 대한 기준에는 앞의20과 같이 행의 분기, 불규칙한 패킹, 행의 정렬 불량이 포함됩니다(그림 7B).
- FIJI ImageJ에서 Ctrl + M 을 눌러 윤곽선이 있는 무질서한 영역/패치된 영역을 측정합니다. 스프레드시트의 전체 무질서 영역을 합산합니다.
- 전체 무질서 영역을 ROI 영역으로 나눈 다음 100을 곱하여 무질서 영역 백분율을 구합니다. 장애가 관찰되지 않으면 장애 영역에 대해 0% 값을 설정합니다.
- 인접 세포의 자오선 행 수
- 인접 세포의 수를 측정하려면 40x 오일 대물렌즈(0.4μm 단계 크기)로 획득한 F-액틴 염색 이미지를 사용하십시오.
- F-액틴이 자오선 행 세포의 전체 둘레에 농축되어 있는 렌즈 캡슐에서 안쪽으로 자오선 행 세포의 기저 영역에서 광학 섹션(XY 평면)을 식별하고, 모든 자오선 행 세포는 초점이 맞춰져 있고 동일한 평면에 있습니다.
- 각 자오선 행 셀에 있는 인접 셀의 수를 계산합니다(그림 8). 스프레드시트에서 6개의 인접한 셀이 있는 셀의 평균 백분율을 측정합니다.
참고: 20x 대물렌즈로 인접한 셀의 수를 결정합니다. 그러나 40x 대물렌즈로 육각형 모양을 관찰하는 것이 훨씬 쉽습니다.
- 적도 섬유 세포의 이미지 분석
- 20x 대물렌즈(0.5μm 단계 크기)로 로다민 팔로이딘 염색 렌즈의 z-stack 컨포칼 이미지를 촬영합니다.
- 2.4.2단계에 표시된 대로 받침점을 식별합니다. 받침점이 식별되면 단일 광학 섹션을 선택합니다. 표준화를 위해 렌즈를 비교하기 위해 XY 평면의 받침점에서 안쪽으로 ~10μm fiber cell 너비를 정량화합니다(그림 9A).
- Raw 이미지를 FIJI ImageJ로 내보냅니다. FIJI ImageJ에서 F-액틴 염색 피크 사이의 거리를 측정하기 위해 여러 인접 섬유 셀을 가로질러 선(보통 ~300-400μm 길이)을 그립니다(라인 스캔 분석; 그림 9A; 분홍색 선).
- Ctrl+K를 눌러 FIJI의 라인 스캔 거리에 대한 형광 강도를 구합니다. 그런 다음 데이터를 스프레드시트로 내보내 피크 간 거리를 계산합니다(그림 9A-B 참조). 이것은 섬유 셀 너비에 해당합니다.
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Representative Results
수정체 전방 캡슐, 상피 세포 영역 및 핵 영역
렌즈 캡슐 두께를 분석하기 위해 WGA를 사용하여 라이브 렌즈 또는 고정 렌즈의 렌즈 캡슐을 염색했습니다. 살아있는 렌즈에서 tdTomato로 막을 표지하거나(그림 2A) 고정 렌즈의 세포막에서 F-actin에 대한 로다민-팔로이딘 염색을 통해 수정체 상피 세포를 식별했습니다(그림 2B). 직교(XZ) 투영에서 WGA 및 tdTomato/rhodamine-phalloidin에 대한 염색을 통해 형광 강도의 피크 대 피크 라인 스캔 분석을 수행할 수 있습니다. WGA 채널의 주요 피크는 수정체 표면을 나타내는 반면 tdTomato/rhodamine-phalloidin 채널의 주요 피크는 상피 세포의 기저 영역을 나타냅니다. 이 봉우리 사이의 거리를 계산하여 수정체 두께를 얻을 수 있습니다. 라인 스캔 분석 결과, 생후 9주 된 생쥐 라이브 렌즈의 캡슐은 11.2μm, 생후 9주 생쥐 고정 렌즈의 캡슐은 12.5μm의 두께를 보였다. 이렇게 관찰된 캡슐 두께는 이전 발견 2,4를 대표합니다.
tdTomato-labeled transgenic mouse lenses(또는 rhodamine-phalloidin stained lenses, 표시되지 않음)의 whole-mount 이미징을 통해 상피 세포 형태를 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 직교(XZ) 투영은 수정체 상피 세포의 측면도를 제공하는 반면, 측면 영역의 평면(XY) 투영은 상피 다각형 모양을 시각화할 수 있습니다. 건강한 수정체에서는 세포 사이의 틈이 관찰되지 않습니다. 이미지에서 세포 모집단을 추적하고 면적을 ROI 내의 세포 수로 나누어 평균 세포 면적을 계산할 수 있습니다. 세포의 수는 주어진 ROI에서 Hoechst 염색 핵의 수를 계산하여 결정됩니다. 이 분석은 260μm2의 평균 세포 면적을 보여주며, 이는 이전 연구 2,4와 일치합니다.
핵의 Hoechst 염색은 또한 상피 세포에서 수정체 상피 세포 핵 형태 측정을 검사할 수 있습니다. 직교(XZ) 투영은 핵의 측면 보기를 허용합니다. 평면(XY) 보기는 핵의 원형/타원체 모양을 보여줍니다. 핵 추적을 통해 개별 세포의 핵 면적과 원형도와 같은 기타 형상 매개변수를 계산할 수 있습니다. 이 분석은 평균 원형도가 0.8인 64μm2의 평균 핵 면적을 보여줍니다. 원형도 값이 1에 가까울수록 완벽한 원을 나타내고, 값이 0에 가까울수록 형태가 더 길어짐을 나타냅니다.
적도 상피 세포 패킹, 섬유 세포 육각형 패킹 및 섬유 셀 너비
수정체 적도 영역의 평면(XY) 보기는 받침점에 수렴하는 육각형 모양의 규칙적으로 포장된 수정체 상피 세포를 보여줍니다. 받침점은 길쭉한 상피 세포의 정점 끝이 수축하여 적도 4,13,14,15에서 초기 섬유 세포 분화 및 신장 중에 앵커 포인트를 형성하는 곳입니다(그림 6B, 빨간색 점선으로 표시). 지렛대는 적도 상피 세포와 섬유 세포를 분리하는 연속선을 형성하는 증가된 F-액틴 염색을 기반으로 국소화할 수 있습니다(그림 6B, 빨간색 점선). 세포막의 F-액틴 염색은 또한 받침점 아래의 세포가 평행한 행으로 정밀하게 정렬되고 배열되는 세포 모양의 변화를 보여줍니다(그림 6). 세포핵도 받침점 아래에 정렬되어 있습니다.
수정체 자오선 열 상피 세포 및 섬유 세포를 시각화하기 위해, 자오선 행 세포의 기저 영역이 시야에 있는 XY 평면에서 받침점(렌즈 캡슐 쪽으로)에 주변 4.5-5μm의 이미지가 앞서 설명된 바와 같이 선택된다(20). 자오선 장애를 측정하기 위해 관심 영역(ROI)이 윤곽이 그려져 있습니다(그림 7A, 노란색 상자). wildtype lens image의 ROI 면적은 15,833μm2입니다. 관찰 가능한 장애가 없으므로 장애 백분율 영역은 0입니다. NMIIA-E1841K 돌연변이가 있는 마우스를 사용하여 세포 육각형 패킹에서 비근육 미오신 IIA(NMIIA)가 수행하는 중요한 역할은 이전에 설명되었습니다20. 그림 7A는 자오선 행 세포 장애를 보여주기 위한 대표적인 NMIIAE1841K/E1841K 렌즈 적도 이미지를 보여줍니다. 자오선 ROI는 20,757μm2였습니다. 다음으로, 무질서한 패치의 전체 면적을 추적했습니다. 무질서의 총 면적은 3,185μm2였다. 계산된 무질서 비율은 15.3%(무질서 면적 x 100/총 ROI; 그림 7B). 이 백분율 무질서 영역은 이전 연구20의 범위 내에 있습니다.
다음으로, 야생형 자오선 행 세포에서 육각형 패킹에 대한 검사를 시연하였다20. F-액틴은 야생형(즉, NMIIA+/+) 렌즈에서 자오선 행 세포의 전체 둘레와 세포막의 기저 영역의 6개 꼭짓점 모두에 농축되어 있기 때문에 F-액틴 염색을 사용하여 세포 모양과 패킹 조직을 평가했습니다. 대표 이미지 1에서는 세포를 라벨링하고 각 세포 주위의 인접 세포의 수를 계수하였다. 이미지 1에서 10개의 세포는 모두 6개의 인접한 세포를 가지고 있으며, 이는 이러한 세포가 벌집 모양의 패킹 조직으로 배열되어 있음을 시사합니다(그림 8). 대조적으로, 10개의 세포 중 8개(세포의 80%)에는 세포가 불규칙하게 포장되어 있음을 나타내는 6개의 인접한 세포가 있습니다(그림 8).
마지막으로, 섬유 세포 너비를 측정하기 위해 로다민-팔로이딘으로 표지된 고정 야생형 렌즈에서 받침점에서 안쪽으로 ~10μm 떨어진 주변 섬유 세포를 검사했습니다(그림 9A)2,4. 참고로, 살아있는 tdTomato 마우스를 사용하여 섬유 세포 너비를 측정하는 것도 가능하지만, tdTomato에 대한 이형접합 렌즈의 신호는 적도 영역에서 약한 경향이 있습니다. 따라서 tdTomato에 대해 동형접합 마우스를 사용하는 것이 더 강한 형광을 갖는 것으로 밝혀졌기 때문에 권장됩니다(표시되지 않음). 라인 스캔 분석을 사용하여 F-액틴 염색된 세포 경계 사이의 거리는 섬유 세포 너비 2,4를 나타내기 위해 앞서 설명한 대로 측정되었습니다(그림 9B). 이 분석 결과, wild-type lens의 평균 interpeak distance는 11.45 ± 2.11 μm인 것으로 나타났습니다(4개의 서로 다른 마우스 렌즈 이미지에서 추출한 N=117 fiber cell, 그림 9B).
그림 1: 이미징 중 렌즈를 고정하기 위해 아가로스 디봇을 만드는 단계. (A) 유리 바닥 접시를 사용하여 피펫은 2% 아가로스를 액화했습니다. (B) 유연한 커버 슬립으로 평평하게 하고 (C) 식히면 가는 팁 집게를 사용하여 제거합니다. (D) 디봇의 경우 3mm 생검 펀치를 사용하여 구멍을 만듭니다. (E) 잔류 아가로스를 흡입하고 PBS로 헹구고 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 표면을 깨끗이 닦습니다. (F) 전체 렌즈를 디봇 안에 조심스럽게 장착합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 렌즈 적도 상피 및 섬유 세포를 이미징하기 위한 아가로스 디봇을 만드는 단계. (A) 조직 배양 접시에 2% 용융 아가로스를 붓습니다. (B) 아가로스가 완전히 굳을 때까지 실온에서 식힌다. (C) 날카로운 칼날로 삼각형 디봇을 만듭니다. (D) 조직 배양 접시에 1x PBS 1mL를 넣습니다. (E) 절개된 렌즈를 쐐기에 놓고 (F) 렌즈를 적도에 받쳐 놓고 아가로스 벽(빨간색 화살표) 사이에 끼웁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 렌즈 캡슐 두께의 결정. (A) 라이브 렌즈 캡슐 및 (B) 고정 렌즈 캡슐의 공초점 z-스택을 재구성한 Sagittal (X, Z plane view) 광학 단면. (C) 라이브 및 (D) 고정 렌즈의 라인 스캔의 형광 강도는 캡슐의 상단 표면과 캡슐에 인접한 상피 세포(빨간색)의 기저 영역에 해당하는 단일 WGA(녹색) 피크를 보여줍니다. 캡슐 두께를 정량화하기 위해 두 피크 사이의 거리를 측정합니다. 1개의 에어리 유닛 핀홀이 있는 40x 오일 대물렌즈를 사용하여 획득한 이미지는 tdTomato/Rhodamine-Phalloidin 및 WGA 채널에서 각각 1.0μm 및 1.2μm의 광학 절편을 얻습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 상피 세포 면적의 정량화. (A) 세포막에 대해 (B) tdTomato, 핵에 대해 (C) Hoechst로 표시된 수정체 상피 세포의 X, Z 평면도. (D) 수정체 상피 세포의 중간 영역의 X, Y 평면도. (E) tdTomato 신호는 초점이 맞춰진 세포 그룹에 해당하는 관심 영역을 정의하기 위한 가이드로 사용됩니다. (F) 정의된 영역의 면적이 결정됩니다. (G) 핵에 대한 Hoechst 염색은 정의된 영역 내의 세포 수를 결정하는 데 사용됩니다. (H) 핵의 수는 (I) FIJI ImageJ의 멀티포인트 도구를 사용하여 계산됩니다. 평균 셀 면적을 계산하려면 정의된 관심 영역의 전체 면적을 총 셀 수로 나눕니다. 1개의 통풍이 잘되는 단위 핀홀이 있는 63x 오일 대물렌즈를 사용하여 획득한 이미지는 Hoechst 및 tdTomato 채널에서 각각 0.7μm 및 1.0μm의 광학 단면을 얻었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 핵 면적 및 형상 결정. (A) 핵의 중간 영역의 XY 평면도. (B) 핵에 초점이 맞춰진 관심 영역이 정의되었습니다. ROI 내의 핵이 요약되어 있습니다. (C) 개별 세포의 핵의 면적과 원형도를 표로 만들고 면적 및 원형도에 대한 평균을 계산했습니다. 63x 오일 대물렌즈를 사용하여 1개의 에어리 유닛 핀홀을 사용하여 획득한 이미지는 Hoechst 채널에서 0.7μm의 광학 단면을 얻습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 렌즈 받침점의 식별. F-액틴과 핵은 지렛대와 자오선을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. (A) XZ 뷰는 받침점에 해당하는 F-액틴에 대한 농축된 팔로이딘 염색을 보여줍니다. (B) 렌즈 받침점에 초점이 맞춰진 단일 광학 XY 평면 뷰 섹션. 핵에 대한 Hoechst 염색은 지렛대 위의 핵이 불규칙하게 채워져 있는 반면 지렛대 아래의 핵은 정확하게 정렬되어 있음을 보여줍니다(오른쪽 상단). F-액틴에 대한 팔로이딘 염색은 지렛대 위의 세포가 불규칙한 모양인 반면 지렛대 아래의 세포는 평행한 줄로 채워져 있음을 보여줍니다(왼쪽 하단). 빨간색 점선은 지렛대의 위치를 나타냅니다. Hoechst, Rhodamine-Phalloidin 및 WGA-640 채널에서 각각 1.5μm, 2.0μm 및 2.2μm의 광학 단면을 얻을 수 있는 1개의 통풍 장치 핀홀이 있는 20x 대물렌즈를 사용하여 획득한 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 자오선 장애의 결정. (A) 단일 XY 평면 view 야생형 및 NMIIAE1841K/E1841K 자오선 행 셀의 광학 단면은 받침점(렌즈 캡슐 쪽으로)에서 ~5μm 떨어져 있습니다. 전체 자오선 행 세포는 핵 정렬에 따라 파란색으로 윤곽선이 표시됩니다. 야생형 렌즈에서 F-액틴(적색) 염색은 자오선 행 세포가 장애의 징후 없이 정확하게 정렬되어 있음을 보여줍니다(0%). 와일드 타입의 대표적인 순서 지정 영역이 윤곽선(주황색)으로 표시됩니다. 세포가 무질서한 렌즈에서는 무질서한 영역(노란색)의 윤곽을 그립니다. (B) 야생형에서 정렬된 영역의 고배율(A의 주황색 상자). (C) (I) 행의 분지, (II) 불규칙한 세포 모양 및 벌집 패킹의 손실, (III) 행의 정렬 불량을 포함하여 다양한 유형의 장애를 나타내는 무질서한 영역의 고배율. NMIIAE1841K/E1841K 렌즈의 이미지는 15.3%의 자오선 열 세포 장애를 보여줍니다. 1개의 통풍이 잘되는 단위 핀홀이 있는 20x 대물렌즈를 사용하여 획득한 이미지는 Hoechst 및 Rhodamine-Phalloidin 채널에서 각각 1.5μm 및 2.0μm의 광학 절편을 얻었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 렌즈 자오선 행 세포 허니컴 패킹 분석. (A) F-actin에 대해 rhodamine-phalloidin으로 염색된 자오선 행 세포의 단일 광학 XY 절편. 저배율 이미지(상단 패널)는 평가 중인 셀을 보여줍니다(분홍색으로 번호가 매겨짐). 노란색 윤곽선으로 표시된 영역이 확대됩니다(아래쪽 패널). 노란색 로마 숫자는 인접한 셀의 개수입니다. 이미지 1은 모두 육각형 모양이며 각각 6개의 인접한 셀이 있는 셀을 보여줍니다. 이미지 2에는 셀 번호 1과 5에 각각 5개와 7개의 인접한 셀이 있는 불규칙성이 있습니다. (B) 데이터는 계산된 육각형 세포의 백분율로 기록되고 표로 작성됩니다. 40x 대물렌즈와 1개의 통풍이 잘되는 단위 핀홀을 사용하여 획득한 이미지는 Rhodamine-Phalloidin 채널에서 1.0μm의 광학 단면을 얻습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: fiber cell 너비 분석. (A) 단일 광학 XY view 렌즈 섬유 셀의 섹션 받침점에서 ~10μm in. 세포막에서 F-액틴을 시각화하기 위해 로다민-팔로이딘으로 세포를 염색했습니다. 선(분홍색, 대시)이 여러 섬유 셀 위에 그려집니다. (B) 거리의 함수로 나타낸 F-액틴 강도의 대표적인 라인 스캔. 피크 간 거리는 섬유 셀 너비를 나타냅니다. 40x 대물렌즈와 1개의 통풍이 잘되는 단위 핀홀을 사용하여 획득한 이미지는 로다민-팔로이딘 채널에서 1.0μm의 광학 절편을 얻습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명된 프로토콜은 렌즈의 전방 및 적도 영역에서 주변 렌즈 구조와 세포의 높은 공간 해상도를 시각화할 수 있습니다. 본 연구에서는 전체 3D 렌즈 구조가 보존된 온전한(라이브 또는 고정) 렌즈를 사용하여 렌즈 주변 구조를 시각화하는 방법을 보여주었습니다. 또한 공개적으로 사용 가능한 FIJI ImageJ 소프트웨어를 사용한 형태 측정 정량 분석을 위한 간단한 방법이 제공되었습니다. 전체 마운트 시각화 및 정량화 방법은 이전 연구에서 사용되었습니다. 이러한 방법을 통해 수정체 모양 변화 또는 노화에 대한 전방 캡슐과 세포의 반응을 이해할 수 있었습니다 2,4. 이러한 방법은 또한 수정체 모양 변화또는 노화로 인한 적도 섬유 전지 확장을 조사하고 2,4 정확한 육각형 모양 및 주변 섬유 세포 조직을 확립하는 데 있어 NMIIA의 역할을 결정하는 데 사용되었습니다20.
Whole-mount imaging은 렌즈 구조의 높은 공간 해상도 en face 이미징을 가능하게 합니다. 수정체 전방 영역에서, whole-mount imaging은 캡슐 구조 무결성 및/또는 상피 세포 형태를 변경할 수 있는 손상을 방지함으로써 flat-mount imaging 에 유리합니다. 또한 상피 세포와 섬유 세포 사이의 계면이 보존됩니다. 이 방법은 en face 이미징이 더 큰 공간 해상도를 제공하고 상피 세포 영역 및 핵 영역/선택한 영역(즉, 여기에 표시된 것처럼 중간 측면) 또는 세포의 다른 영역을 형성할 수 있기 때문에 렌즈 절편의 시각화에 비해 이점을 제공합니다. 또한, 이미징 방법을 사용하면 렌즈의 적도 영역을 따라 특정 지점에서 형태학적 특징을 정량화할 수 있어 육각형 모양, 자오선 행 셀 패킹, 받침점 및 섬유 셀 너비를 시각화할 수 있으며, 이는 공간 해상도 부족 및 절편 중에 발생할 수 있는 조직 왜곡으로 인해 이미징 염색된 렌즈 절편을 통해 쉽게 얻을 수 없습니다.
또한 설명된 프로토콜을 통해 라이브 렌즈의 이미징을 통해 시간 경과에 따른 특정 렌즈 구조와 세포를 추적할 수 있습니다. 라이브 렌즈 이미징 프로토콜은 이전 연구에서 중요한 역할을 했으며, 렌즈 평탄화를 유도하기 위해 렌즈 압축 전후에 동일한 렌즈의 세포 하위 집단에서 캡슐 두께 및 상피 세포 면적을 반복적으로 측정하여 분석했습니다4. 수정체 압축은 캡슐 두께의 감소와 상피 세포 면적의 증가를 유도하는 것으로 확인되었습니다. 개별 렌즈 간의 캡슐 두께와 상피 세포 면적의 상당한 차이와 렌즈 압축으로 인한 이러한 매개변수에 대한 영향의 크기로 인해 독립적인 측정 설계를 사용하는 경우(즉, 개별 비압축 렌즈와 개별 압축 렌즈 비교) 차이를 감지하기 어려울 수 있습니다. 살아있는 상피 세포에서 F-액틴 재편성을 추적할 수 있는 상피 세포22에서 F-액틴을 시각화하기 위해 LifeACT-GFP26을 내인성으로 발현하는 라이브 마우스 렌즈에 대한 전체 마운트 이미징을 라이브 이미징 방법을 사용하여 수행했습니다.
개략적인 프로토콜은 마우스 렌즈의 이미징을 위해 개발되었으며 다른 종의 렌즈 구조를 시각화하도록 조정될 수 있는 반면, 염색 프로토콜은 다른 설치류 렌즈(쥐, 기니피그) 및 다른 포유류 렌즈(소, 마카크 및 인간, 데이터 미표시)에서 수정체 전방 및 적도 주변 구조를 모두 시각화하기 위한 것입니다. 대형 렌즈에서 구조를 시각화하려면 더 긴 고정(4%PFA, 얼음 위, 4시간), 차단(1시간) 및 염색(야간, 4°C)이 필요합니다. 주목할 점은 다른 종의 이미징은 고정 렌즈에서만 수행되었습니다. 다른 종의 렌즈에 대한 실시간 이미징은 라이브 이미징 프로토콜이 형광 단백질을 발현하는 형질전환 마우스의 렌즈를 사용하기 때문에 어려울 수 있습니다. 따라서 이 이미징은 유전자 변형이 일반적이지 않은 다른 종의 이미징 렌즈를 배제할 수 있습니다. 그러나 친유성 프로브인 FM4-64 또는 F-액틴 결합 프로브인 SiR-Jasplakinolide(SiR-actin)를 각각 사전 염색하여 수정체 상피 세포막 또는 F-액틴의 실시간 시각화를 수행할 수 있었습니다(표시되지 않음). 이러한 프로브를 사용하여 다른 종의 라이브 렌즈를 이미지화하는 것이 가능할 수 있습니다. 그러나 이러한 프로브를 사용할 때는 표적을 벗어난 효과를 피하기 위해 주의해야 합니다. 예를 들어, SiR-Jasplakinolide는 F-액틴 역학을 변화시킬 수 있다27. 라이브 렌즈 또는 고정 렌즈에 대한 염색 방법의 또 다른 한계는 이러한 프로브의 침투가 제한되어 있다는 것입니다. 따라서 이미징은 주변 영역으로 제한됩니다. 형광 단백질의 형질전환 발현에 의존하는 tdTomato 형질전환 마우스(4)의 렌즈를 사용하여 내부 영역(즉, 심부 섬유 세포)을 이미지화할 수 있습니다. 또한 발현은 심부 섬유 세포의 밝은 신호에 대해 충분히 높아야 합니다.
그럼에도 불구하고, 개략적으로 설명한 프로토콜은 주변 렌즈 특징 2,4,20의 효과적인 형태학적 정량을 가능하게 했습니다. 정량화 방법론은 효과적이며 공개적으로 사용 가능한 오픈 소스 FIJI ImageJ 소프트웨어를 사용합니다. 수동 추적 도구는 관심 영역을 식별하는 데 사용되었지만 관심 영역 식별을 자동화할 수 있습니다. 자동화는 특정 구조(예: 핵 경계)의 FIJI ImageJ 기반 식별을 위해 대비를 향상시키기 위해 형광 임계값을 적용하거나 세포 모양 차이(예: 불규칙한 상피 또는 섬유 세포 모양)를 감지하기 위해 더 복잡한 기계 학습 알고리즘을 적용하는 것만큼 간단할 수 있습니다. 더 복잡한 분석에는 특수 플러그인이나 이미징 소프트웨어가 필요할 수 있습니다. 특수 플러그인 또는 소프트웨어를 사용하면 획득한 z-스택에서 3D 체적 형태학적 측정값을 얻을 수도 있습니다. 전반적으로, 설명된 정량화 방법은 쉽게 접근할 수 있고, 비용 효율적이며, 많은 유용한 결과 측정에 적합하지만(2,4,20), 이미징 프로토콜 플랫폼은 정교한 소프트웨어 분석과 결합되어 향후 연구를 위한 풍부한 추가 형태학적 측정을 제공할 수 있습니다.
수정체는 세포 및 관련 구조의 위치 및 깊이 의존적 형상에 의존하는 특수 기능을 가진 복잡한 생물학적 조직입니다. 여기에 설명된 이미징 프로토콜과 정량화 방법을 사용하면 렌즈 구조와 렌즈의 복잡한 조직이 어떻게 설정되는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 또한 이미징 프로토콜과 정량화 방법은 렌즈 구조와 기능 간의 관계를 설명하는 데 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 National Eye Institute Grant R01 EY032056 CC와 R01 EY017724 VMF와 National Institute of General Medical Sciences의 보조금 번호 P20GM139760의 지원을 받았습니다. STI는 화학-생물학 인터페이스 박사 전 교육 프로그램의 일환으로 NIH-NIGMS T32-GM133395의 지원을 받았으며 델라웨어 대학교 대학원 학자 상을 수상했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
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