Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Helmonteringsavbildning for å visualisere og kvantifisere perifer linsestruktur, cellemorfologi og organisasjon

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66017
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

Summary

De foreliggende protokollene beskriver ny helmonteringsavbildning for visualisering av perifere strukturer i okularlinsen med metoder for bildekvantifisering. Disse protokollene kan brukes i studier for å bedre forstå forholdet mellom linsemikroskalastrukturer og linsens utvikling/funksjon.

Abstract

Den okulære linsen er et gjennomsiktig, fleksibelt vev som endrer form for å fokusere lys fra forskjellige avstander på netthinnen. Bortsett fra en kjellermembran som omgir orgelet, kalt kapselen, er linsen helt cellulær bestående av et monolag av epitelceller på den fremre halvkule og en bulkmasse av linsefiberceller. Gjennom livet prolifererer epitelceller i den spirende sonen ved linseekvator, og ekvatoriale epitelceller migrerer, forlenger og differensierer til nydannede fiberceller. Ekvatoriale epitelceller endrer vesentlig morfologi fra tilfeldig pakkede brosteinformede celler til justerte sekskantformede celler som danner meridionale rader. Nydannede linsefiberceller beholder den sekskantede celleformen og strekker seg mot de fremre og bakre polene, og danner et nytt skall av celler som er lagt på tidligere generasjoner av fibre. Lite er kjent om mekanismene som driver den bemerkelsesverdige morfogenesen av linseepitelceller til fiberceller. For bedre å forstå linsestruktur, utvikling og funksjon, har nye bildebehandlingsprotokoller blitt utviklet for å avbilde perifere strukturer ved hjelp av hele monteringer av okulære linser. Her vises metoder for å kvantifisere kapseltykkelse, epitelcelleareal, cellekjerneområde og form, meridional radcelleorden og pakking, og fibercellebredder. Disse målingene er avgjørende for å belyse de cellulære endringene som skjer under livslang linsevekst og forstå endringene som skjer med alder eller patologi.

Introduction

Den okulære linsen er et fleksibelt, gjennomsiktig vev som ligger i den fremre delen av øyet som fungerer for å finfokusere lys på netthinnen. Linsens evne til å fungere kan delvis tilskrives dens intrikate arkitektur og organisasjon 1,2,3,4,5,6. Rundt linsevevet er kapselen, en kjellermembran som er avgjørende for å opprettholde linsestruktur og biomekaniske egenskaper 7,8,9. Linsen i seg selv er helt cellulær, bestående av to celletyper: epitel- og fiberceller. Epitellaget består av et monolag av kuboidale celler som dekker linsens fremre halvkule10. Gjennom livet sprer epitelcellene seg og migrerer langs linsekapselen mot linseekvator. Fremre epitelceller er hvilende og brostein i tverrsnitt, og nær linseekvator prolifererer epitelceller og begynner å gjennomgå differensieringsprosessen til nye fiberceller11,12. Ekvatoriale epitelceller forvandles fra tilfeldig pakkede celler til organiserte meridionale rader med sekskantformede celler. Sekskantet celleform opprettholdes på basalsiden av disse differensierende cellene mens den apikale siden trekker seg sammen og forankres ved linsens dreiepunkt eller modiolus 4,13,14,15. Når de ekvatoriale epitelcellene begynner å strekke seg til nydannede fiberceller, migrerer de apikale spissene av cellene langs den apikale overflaten av fremre epitelceller mot den fremre polen mens basalspissene beveger seg langs linsekapselen mot den bakre polen. Nye generasjoner av fiberceller legger over tidligere generasjoner av celler, og skaper sfæriske skall av fibre. Under celleforlengelses- og modningsprosessen endrer fiberceller vesentlig sin morfologi 11,12,16. Disse fibercellene danner hoveddelen av linsemassen 11,12,16,17,18.

De molekylære mekanismene som bidrar til å etablere intrikate linsemikrostrukturer, cellemorfologi og unik cellulær organisasjon er ikke helt kjent. Videre er linsekapselens og cellestrukturens bidrag til den generelle linsefunksjonen (gjennomsiktighet, linseformendring) uklart. Imidlertid blir disse forholdene belyst ved hjelp av ny bildebehandlingsmetodikk og kvantitative vurderinger av linsestrukturelle og cellulære egenskaper 2,4,19,20,21,22. Nye protokoller for å avbilde hele linser som muliggjør visualisering med høy romlig oppløsning av linsekapselen, epitelceller og perifere fiberceller har blitt utviklet. Dette inkluderer metodikk for å kvantifisere kapseltykkelse, cellestørrelse, cellekjernestørrelse og sirkularitet, meridional radrekkefølge, fibercellepakking og fibercellebredder. Disse visualiserings- og bildekvantifiseringsmetodene tillater grundig morfometrisk undersøkelse og har fordeler i forhold til andre visualiseringsmetoder (avbildning av flate fester eller vevsseksjoner) ved å bevare den generelle 3D-vevstrukturen. Disse metodene har gjort det mulig å teste nye hypoteser og vil muliggjøre fortsatt fremgang i forståelsen av linsecellemønsterutvikling og funksjon.

For følgende eksperimenter bruker vi villtype og Rosa26-tdTomatmus tandemdimer-tomat (B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) (tdTomato) 23 (Jackson Laboratories) i C57BL/6J-bakgrunnen mellom 6 og 10 uker, av begge kjønn. tdTomato-musene tillater visualisering av cellulære plasmamembraner i levende linser via ekspresjon av tdTomatoprotein fusjonert til N-terminal 8-aminosyrene i et mutert MARCKS-protein som retter seg mot plasmamembranen via N-terminal myristylering og interne cysteinpalmitoyleringssteder23. Vi bruker også NMIIAE1841K / E1841K mus24 hentet opprinnelig fra Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Som beskrevet tidligere20, NMIIAE1841K / E1841K mus i FvBN / 129SvEv / C57Bl6 bakgrunn som har tap av CP49 beaded intermediært filament protein (opprettholder moden fibercellemorfologi og hel linse biomekanikk), er tilbakekrysset med C57BL6 / J villtype mus. Vi screenet avkommet for tilstedeværelse av villtype CP49-allelet.

Konfokal avbildning ble utført på et laserskanning konfokalfluorescensmikroskop med en 20x (NA = 0.8, arbeidsavstand = 0.55mm, 1x zoom), en 40x (NA = 1.3 oljemål, arbeidsavstand = 0.2mm, 1x zoom), eller en 63x (NA = 1.4 oljeobjektiv, arbeidsavstand = 0.19mm, 1x zoom) forstørrelse. Alle bildene ble tatt ved hjelp av en pinhole størrelse, som er en determinant av optisk seksjon tykkelse, til 1 Airy Unit (de resulterende optiske tykkelser er angitt i figur legender). Bilder ble behandlet på Zen Software. Bildene ble eksportert til .tif format og deretter importert til FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus er plassert i University of Delaware dyreavdeling, opprettholdt i et patogenfritt miljø. Alle dyreprosedyrer, inkludert eutanasi ved CO2 -innånding, ble utført i samsvar med godkjente dyreprotokoller fra University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Klargjøring og avbildning av hele objektivfatningen

  1. Fiksering av linser for bildebehandling med hele fatningen
    1. Etter eutanasi, enucleate øyne og dissekere linser som tidligere beskrevet25. Etter disseksjon overføres linsene umiddelbart til frisk 1x fosfatbufret saltvann (PBS; 1,1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na2HPO 4-7H2O; pH 7,4) ved romtemperatur.
      MERK: Cellulær morfologi kan endres hvis linser lagres i PBS i lengre tid, derfor anbefales det å fikse umiddelbart innen ~ 10 min av disseksjon.
    2. For helmontering av linsens fremre region, fikser hele linser ved å senke ned i 0,5 ml nylaget 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i et mikrosentrifugerør ved romtemperatur. Etter 30 min, vask linsene 3x (5 min per vask) med 1x PBS. Gå videre til trinn 1.2 eller oppbevar i 1x PBS ved 4 °C. Faste linser kan lagres i opptil 5 dager.
    3. For helmontering av linsens ekvatoriale region, fikser hele linser ved å senke ned i 0,5 ml nylaget 4% PFA i 1x PBS i et mikrosentrifugerør ved romtemperatur. Etter 1 time, vask linser 3x (5 min per vask) med 1x PBS. Gå videre til trinn 1.3 eller oppbevar i 1x PBS ved 4 °C. Faste linser kan lagres i opptil 5 dager.
  2. Hele monteringen av fremre linseregion (fast eller live)
    1. For helmontering av faste linser, gå videre til trinn 1.2.3.
    2. For helmontering av levende linser, overfør linser til en brønn på en 48-brønnsplate som inneholder 1 ml Medium 199 (fenol rødfri) som inneholder 1% antibiotika / antimykotisk. Inkuber linser ved 37 °C og 5 % CO2 inntil avbildning. Før avbildning, inkuber linser i en løsning som inneholder fluorescerende merket hvetekimagglutinin (WGA-640, 1:500) og Hoechst 33342 (1:500) i medium 199 i minst 10 minutter. Gå videre til trinn 1.5.
    3. For å flekke linsekapsel, F-aktin og kjerner av faste linser, plasser linser i en 500 μL-løsning inneholdende WGA-640 (1:500), rhodamin-falloidin (1:50) og Hoechst 33342 (1:500) i permeabiliserings-/blokkeringsbuffer (1x PBS inneholdende 0,3% Triton, 0,3% bovint serumalbumin (fraksjon V) og 3% geiteserum) i et mikrosentrifugerør. Beiseglass ved 4 °C over natten.
    4. Etter inkubering over natten, vask linsene 3x (5 min per vask) med 1 ml 1x PBS. Fortsett til bildelinser.
    5. For å stabilisere den faste linsen for konfokal avbildning, lag linseimmobiliseringsdivoter i agarose på en bildeparabol som tidligere beskrevet21 (figur 1).
      1. Varm opp og bland forsiktig 2% agarose i PBS ved hjelp av en mikrobølgeovn til løsningen er flytende. Pipett 250 μL flytende 2 % agarose til en glassfatform (figur 1A) og flat agarosen over fatet med et fleksibelt plastdeksel (figur 1B). Når agarose er avkjølt og helt størknet, fjern dekselet med fintupptang (figur 1C) og bruk en 3 mm biopsistans for å lage et hull i agarose i midten av fatet (figur 1D).
      2. Fjern overflødig agarose med en delikat arbeidsserviett (figur 1E). Hold agarosemugg hydrert med 1x PBS og opprettholdes ved 4 °C til bruk. Agaroseformer har blitt lagret i opptil 1 uke.
    6. Bruk embryotang, overfør forsiktig den levende eller faste linsen til divoten i agarose (figur 1F), som inneholder ~ 2 ml 1x PBS (fast linse) eller fenol rødfri Medium 199 (levende linse), og legg deretter parabolen på et omvendt mikroskoptrinn. For å bekrefte at linsen er plassert med den fremre regionen mot målet, visualiser kjernefarging. Hvis ingen kjerner observeres, kan den bakre regionen stå overfor målet.
    7. For å invertere linsen, bruk buet tang og roter linsen forsiktig ~ 180 ° slik at den fremre regionen vender mot målet. Skaff bilder ved hjelp av et konfokalmikroskop.
    8. For visualisering av linsekapsler, skaff deg z-stack-bilder ved hjelp av et 40x objektiv med en trinnstørrelse på 0,3 μm. Ta det første bildet før overflaten av linsekapselen (indikert ved WGA-farging) og det siste bildet etter den apikale overflaten av epitelcellene. For å visualisere epitelceller, ta z-stack-bilder ved hjelp av et 63x objektiv med en trinnstørrelse på 0,3 μm for visualisering av linseepitelceller.
      MERK: Disse mikroskopparametrene tillater tilstrekkelig tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av bilder som er avgjørende for bildekvantifisering av kapseltykkelse eller epitelcelleareal. Det er også mulig å avbilde suturer i levende linse tdTomato linser ved avbildning forbi epitelcellemonolaget som tidligere beskrevet4.
  3. Lens ekvatorial epitel- og fibercellefarging
    1. Plasser faste linser i en 0,5 ml oppløsning av rhodamin-falloidin (1:300), WGA-640 (1:250) og Hoechst 33342 (1:500) i permeabiliserings-/blokkeringsløsning (3 % BSA, 3 % geiteserum og 0,3 % Triton) i et mikrosentrifugerør. Opprettholdes ved 4 °C over natten.
    2. Etter inkubasjon over natten, vask linser 3x i 1ml 1x PBS (5 min per vask).
    3. Lag linse immobilisering agarose kiler som tidligere beskrevet 4,10.
      1. Lag kort agarosekiler i glassbunnede retter (FD35-100, WPI) ved å helle ~ 5-6 ml smeltet 2% agarose i 1x PBS i retter (figur 2A). Når agarosen størkner (figur 2B), lager du en trekantet divot med et skarpt blad (figur 2C). Fjern agarosekilen og legg 1 ml 1x PBS i agarosefatet (figur 2D).
      2. Aspirer eventuelle gjenværende agarose som kan være igjen fra å kutte agarose. Flere kiler kan opprettes per tallerken for å passe til flere forskjellige størrelser av linser (ikke vist). For å lagre agaroseformen, plasser 1 ml 1x PBS på agaroseformen og hold ved 4 ° C. Kiler kan holdes i opptil 1 uke.
    4. Bruk buet pinsett, plasser linsen i en agarosekile som inneholder 1 ml 1x PBS og juster slik at ekvatorialområdet av linsen vender ned på mikroskopglass over konfokalmålet (figur 2E-F). For å bekrefte at ekvatorialregionen er i fokus, visualiser kjerner og sørg for at kjerner er justert i rader ved ekvator. De ekvatoriale epitelcellene kan også identifiseres da de er uregelmessig pakket og formet. I tillegg er de meridionale radcellene nøyaktig justert og sekskantet formet, indikert ved F-aktinfarging ved cellemembranene.
    5. Hvis kjerner i synsfeltet er tilfeldig pakket, vender den fremre siden av linsen mot målet. Hvis kjerner ikke kan observeres, er den bakre siden av linsen mest sannsynlig vendt mot målet. Hvis linsen ikke sitter på ekvator, må du orientere linsen på nytt og bruke den buede pinsetten til å rotere linsen til de nøyaktig justerte kjernene ved linseekvator er observert.
    6. Ta bilde av linsens ekvatoriale epitel- og fiberceller ved hjelp av et laserskanning konfokalmikroskop (20x objektiv, NA = 0,8, trinnstørrelse 0,5 μm og/eller 40x oljemål, NA = 1,3, trinnstørrelse 0,4 μm). Roter bildene før z-stack-samlingen, der ekvatoriale epitelceller er øverst, etterfulgt av meridional rad og fiberceller rett under.

2. Metodikk for bildeanalyse

  1. Måling av linsekapseltykkelse
    1. Ved å bruke z-stack-bilder oppnådd med en 40x objektiv (0,3 μm trinnstørrelse) av enten levende tdTomato-linser merket med WGA eller faste linser merket med WGA og rho-phalloidin, oppnå en optisk 2D-projeksjon i XZ-visningen av 3D-rekonstruksjonen og lagre i .tif format. Behandle bilder ved hjelp av Zen-programvare.
    2. Åpne XZ skivebilder (.tif) i FIJI ImageJ-programvaren.
    3. For å måle tykkelsen på linsekapselen, bruk funksjonen med rett linje (vist i figur 3A,B). Angi linjebredden til 50 bildepunkter ved å velge Rediger > Alternativer > Linjebredde. Denne linjebredden ble empirisk bestemt for å gi et høyt signal-støy-forhold med mikroskopinnstillingene. Optimal linjebredde kan variere på andre mikroskoper / mikroskopinnstillinger eller ved bruk av linser fra andre arter. Deretter tegner du en linje fra kapselens øverste overflate til under epitelcellenes basale region.
    4. Lagre linjen som et interesseområde ved å trykke CTRL+T.
    5. Skill kanaler i faner for bilde-, farge- og delte kanaler.
    6. Mål intensiteten langs linjen for kapselkanalen ved å trykke Ctrl + K.
    7. I et regneark plotter intensitetsverdier som en funksjon av avstand og bestemmer intensitetstopper for kapselen og F-aktinet, som representerer henholdsvis kapseloverflaten og basalområdet til epitelceller. På x-aksen er linjeavstanden.
    8. Deretter beregner du kapseltykkelsen ved å bestemme avstanden mellom kapsel- og epitelfluorescerende intensitetstopper (figur 3C, D).
  2. Analyse av celleområde
    1. Ved hjelp av z-stack-bilder oppnådd ved hjelp av en 63x objektivlinse (NA = 1.4; 0.3 μm trinnstørrelse) på levende tdTomatlinser eller faste linser merket med falloidin, analyser et XY-visningsstykke fra et z-stack konfokalbilde som tilsvarer hvor det midterste (laterale) området av epitelceller er i fokus. Legg merke til at sidemembranene er synlige ved hjelp av tdTomatmembranfargen eller ved å visualisere falloidin, som er tilstede ved sidecellemembranene.
      MERK: På grunn av krumningen av linsen (som sett i en XZ-visning; Figur 4A-C), vil ikke alle epitelceller være i fokus i bildet. Den midterste delen av epitelet tilsvarer regionen der både cellelaterale membraner (figur 4D-E) og kjerner (figur 4G-I) er i fokus.
    2. Eksporter bildet som en .tif og åpne det i FIJI ImageJ.
    3. For å angi skalaen i FIJI ImageJ for analyse, bruk linjeverktøyet til å lage en linje som er lengden på en skalalinje fra konfokalbildet.
    4. Registrer piksellengden på linjen og lengden på skalalinjen. Gå til Analyser på verktøylinjemenyen, og velg Angi skala. Skriv inn antall piksler som er lengden på linjen i Avstand i piksler og i Kjent avstand skriv inn den kjente lengden på skalalinjen.
    5. Ved å bruke tdTomat- eller rhodamin-falloidinfargingen som en indikasjon på cellegrenser, skisserer du manuelt en populasjon av celler som er i fokus i bildet ved hjelp av det polygonale verktøyet. Spor bare celler der sidemembraner er synlige (figur 4E), og unngå å spore delvis synlige celler (dvs. i kanten av bildene). Spar avkastning ved å trykke CTRL+T. Gå til Rediger på verktøylinjemenyen og velg Fjern utenfor. Mål nå totalt celleareal (ROI) ved å trykke Ctrl + M i FIJI ImageJ.
    6. Beregn det gjennomsnittlige celleområdet ved å dele avkastningsområdet med det totale cellenummeret. En enkel måte å bestemme antall celler på er ved å telle antall kjerner. Gå til kjernekanalen (blå). På ROI-menyen velger du den lagrede ROI-oversikten over celler (figur 4G). Fjern utenfor avkastningen ved å gå til Rediger og deretter klikke på Fjern utenfor (figur 4H). Bruk flerpunktsverktøyet til å telle kjernene ved å klikke på individuelle kjerner.
  3. Cellulært nukleært område og formanalyse
    1. For kjerneområde- og formanalyse, analyser en XY-planvisning optisk seksjon fra et z-stack konfokalt bilde som tilsvarer hvor den midtre (laterale) regionen av tdTomatepitelceller er i fokus. Analyser en z-stack-skive fra et konfokalbilde der kjerneområdet er det største (figur 5A); Dette representerer den midtre delen av kjernene.
      MERK: Merk at på grunn av linsens krumning vil ikke alle kjerner være i fokus, som det fremgår av XZ-visningen (figur 4G og figur 5A).
    2. Velg en underpopulasjon av kjerner som er i fokus, og spar avkastning.
    3. Bruk Clear Extern-funksjonen . I ROI, ved hjelp av frihåndsvalgverktøyet (fjerde menyknapp fra venstre), sporer du nøye kantene til kjernene (figur 5B). Lagre hvert kjernefysiske spor i ROI-vinduet ved å trykke Ctrl + T. Bare omriss kjerner der de komplette kjernene kan sees, og kjernene ikke berører hverandre.
    4. Når alle kjernene er skissert, måler du individuelle cellers nukleære område og form (dvs. sirkularitet) ved å trykke Ctrl + M.
    5. Kopier og lim inn data i et regneark og beregn gjennomsnittlig kjernefysisk område og sirkularitet (figur 5C).
  4. Meridional radepitel pakking
    1. For å måle meridional radforstyrrelse, ta bilder ved hjelp av et 20x mål (0,5 μm trinnstørrelse).
    2. Identifiser linsens dreiepunkt / modiolus på bilder. Omdreiningspunktet er regionen der de apikale spissene til forlengende epitelceller trekker seg sammen for å danne et ankerpunkt under innledende fibercelledifferensiering og forlengelse ved ekvator. Identifiser dreiepunktet basert på lys F-aktinintensitet (indikert med pilspiss i XZ-visning i figur 6A; indikert med en rød stiplet linje i figur 6B) og endring i cellulær organisasjon i en enkelt optisk seksjon ved XY-visning.
      MERK: I tillegg er F-aktinfarging av både basal- og apikale regioner av epitelceller tydelig over dreiebenet, mens bare basalregionen av de forlengende cellene er synlig under dreiepunktet (figur 6A). Epitelcellene over dreiebenet er uregelmessig pakket og har en tendens til å danne rosetter, mens fibercellene under dreiepunktet er ordnet i parallelle rader, indikert med lys F-aktinfarging ved membranen (figur 6B).
    3. Når dreiepunktet er identifisert i 2 måneder gamle mus, velg den enkle optiske delen ~ 4,5-5 μm perifer til dreiepunktet (mot linsekapselen) i XY-planet. Denne avstanden er valgt basert på observasjonen at alle kjernene til meridionale radceller i 2 måneder gamle mus er i fokus når de er ~ 5 μm perifere til dreiepunktet. Lagre den ene optiske delen (.tif). Åpne bildet på FIJI.
      MERK: Denne analysen har bare blitt utført på 2 måneder gamle mus, og det kan derfor ikke konkluderes om denne avstanden endres med alderen.
    4. Før du utfører bildeanalyse, sett skalaen til μm i ImageJ ved hjelp av trinn 2.2.2.
    5. Skisser manuelt hele meridionale radregioner ved hjelp av frihåndslinjeverktøyet (interesseområde / avkastning) ved å identifisere kjernefysisk justering, som vist i figur 7A. Spar avkastning ved å trykke CTRL+T. Gå til Rediger på verktøylinjemenyen og velg Fjern utenfor. Mål totalt celleareal (ROI) ved å trykke Ctrl + M i FIJI ImageJ.
    6. Identifiser eventuelle regioner av uorden indikert ved F-aktinfarging ved å skissere ved hjelp av frihåndslinjeverktøyet i FIJI ImageJ. Kriterier for uordnede områder inkluderer forgrening av rader, uregelmessig pakking og feiljustering av rader (figur 7B), som vist tidligere20.
    7. Mål det skisserte uordnede området / lappet ved å trykke Ctrl + M i FIJI ImageJ. Summer det totale uordnede området i et regneark.
    8. Del det totale uordnede området med avkastningsområdet, og multipliser deretter med 100 for å få et prosent uordnet område. Hvis ingen lidelse observeres, plasser en verdi på 0% for det uordnede området.
  5. Meridional rad nummer av nærliggende celler
    1. For å måle antall naboceller, bruk F-aktinfargede bilder tatt med 40x oljemål (0,4 μm trinnstørrelse).
    2. Identifiser et optisk snitt (XY-planet) ved basalområdet av meridionale radceller innover fra linsekapselen hvor F-aktin er anriket rundt hele omkretsen av meridionale radceller, alle meridionale radceller er i fokus og er på samme plan.
    3. Tell antall tilstøtende celler hver meridional radcelle har (figur 8). Mål gjennomsnittlig prosentandel av celler med seks tilstøtende celler i et regneark.
      MERK: Bestem antall tilstøtende celler med et 20x-mål. Det er imidlertid betydelig lettere å observere sekskantformen med et 40x mål.
  6. Bildeanalyse av ekvatoriale fiberceller
    1. Ta z-stack konfokale bilder av rhodamine falloidin farget linser med en 20x objektiv (0,5 μm trinnstørrelse).
    2. Identifiser dreiepunktet som angitt i trinn 2.4.2. Når dreiepunktet er identifisert, velg en enkelt optisk seksjon. For standardiseringsformål og for å sammenligne mellom linser, kvantifiser fibercellebredder ~ 10 μm innover fra dreiepunktet i XY-planet (figur 9A).
    3. Eksporter RAW-bilder til FIJI ImageJ. I FIJI ImageJ tegner du en linje (vanligvis ~300-400 μm lang) over flere tilstøtende fiberceller for å måle avstanden mellom F-aktinfargede topper (linjeskanningsanalyse; Figur 9A; rosa linje).
    4. Få fluorescerende intensitet over linjeskanningsavstanden i FIJI ved å trykke Ctrl + K. Deretter eksporterer du data til regnearket for å beregne interpeak-avstanden (eksempel vist i figur 9A-B). Dette tilsvarer fibercellebredder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremre linsekapsel, epitelcelleområde og nukleært område
For å analysere linsekapseltykkelsen farget vi linsekapsler, enten i levende eller faste linser, med WGA. Vi identifiserte linseepitelceller ved å merke membraner med tdTomato i levende linser (figur 2A), eller via rhodamin-falloidinfarging for F-aktin ved cellemembranene i faste linser (figur 2B). I en ortogonal (XZ) projeksjon lar farging for WGA og tdTomat / rhodamin-falloidin oss utføre topp-til-topplinjeskanningsanalyse av fluorescensintensitet. Hovedtoppen i WGA-kanalen indikerer kapseloverflate, mens hovedtoppen i tdTomat/rhodamin-falloidinkanalen indikerer epitelcellenes basale region. Ved å beregne avstanden mellom disse toppene, kan vi oppnå kapseltykkelse. Linjeskanningsanalysen viser at kapsler fra en 9 uker gammel mus levende linse hadde en tykkelse på 11, 2 μm, og kapsler fra en 9 uker gammel mus fast linse hadde en tykkelse på 12, 5 μm. Disse observerte kapseltykkelsene er representative for tidligere funn 2,4.

Helmontering avbildning av tdTomat-merkede transgene muselinser (eller rhodamin-phalloidinfargede linser; ikke vist) muliggjør levende visualisering av epitelcellemorfologi. Den ortogonale (XZ) projeksjonen gir en sidevisning av linseepitelcellen, mens den plane (XY) visningen på sideområdene muliggjør visualisering av epitelpolygonal form. I friske linser observerer vi ingen mellomrom mellom celler. Vi kan beregne det gjennomsnittlige celleområdet ved å spore en populasjon av celler i et bilde og dele området med antall celler i avkastningen. Antall celler bestemmes ved å telle antall Hoechst-fargede kjerner i en gitt avkastning. Analysen viser et gjennomsnittlig celleareal på 260 μm2 som er i tråd med tidligere studier 2,4.

Hoechst-farging av kjerner tillater også undersøkelse av linseepitelcellekjernemorfometri i epitelceller. De ortogonale (XZ) projeksjonene gir mulighet for en sidevisning av kjerner. Den plane (XY) visningen demonstrerer de sirkulære/ellipsoide formene til kjernene. Sporing av kjerner gjør det mulig å beregne individuelle cellers kjernefysiske område og andre formparametere som sirkularitet. Analysen viser et gjennomsnittlig nukleært område på 64 μm2 med en gjennomsnittlig sirkularitet på 0, 8. Sirkularitetsverdier nær 1 indikerer en perfekt sirkel, mens verdier som nærmer seg 0 indikerer en mer langstrakt morfologi.

Ekvatorial epitelcellepakking, fibercelle sekskantet pakking og fibercellebredder
Det plane (XY) bildet av linsens ekvatoriale region demonstrerer sekskantformede og regelmessig pakkede linseepitelceller som konvergerer ved dreiepunktet. Dreiepunktet er der de apikale spissene til langstrakte epitelceller trekker seg sammen for å danne et ankerpunkt under innledende fibercelledifferensiering og forlengelse ved ekvator 4,13,14,15 (figur 6B, indikert med en rød stiplet linje). Dreiepunktet kan lokaliseres basert på økt F-aktinfarging som danner en kontinuerlig linje som skiller ekvatorialepitelceller og fiberceller (figur 6B, rødstiplet linje). F-aktinfargingen ved cellemembranene viser også endringer i celleform, der cellene under dreiepunktet er nøyaktig justert og arrangert i parallelle rader (figur 6). Cellekjerner er også justert under dreiebenet.

For å visualisere linsemeridionale radepitelceller og fiberceller velges et bilde 4,5-5 μm perifert til dreiepunktet (mot linsekapselen) i XY-planet, der basalregionen av meridionale radceller er til syne, som beskrevet tidligere20. For å måle meridional radforstyrrelse er en interesseregion (ROI) skissert (figur 7A; gul boks). Arealet av avkastningen i wildtype-objektivbildet er 15 833 μm2. Siden det ikke er noen observerbar lidelse, er arealet av lidelsesprosent 0. Den kritiske rollen som ikke-muskelmyosin IIA (NMIIA) spiller i cellesekskantet pakking ved bruk av mus med en NMIIA-E1841K-mutasjon er tidligere beskrevet20. Figur 7A viser et representativt NMIIAE1841K/E1841K-objektiv ekvatorialbilde for å demonstrere meridional radcelleforstyrrelse. Den meridionale radavkastningen var 20 757 μm2. Deretter ble det totale arealet av uordnede flekker sporet. Det totale arealet av lidelse var 3.185 μm2. Den beregnede prosentandelen av lidelse ble bestemt til å være 15,3 % (uordnet område x 100/total avkastning; Figur 7B). Dette prosentuordnede området er innenfor området i en tidligere studie20.

Deretter ble det påvist en undersøkelse av sekskantet pakking i meridionale radceller av villtype20. Fordi F-aktin er anriket rundt hele omkretsen av meridionale radceller og ved alle seks hjørner av basalområdene av cellemembraner i villtype (dvs. NMIIA +/+) linser, ble F-aktinfarging brukt til å vurdere celleformer og pakkeorganisasjon. I representativt bilde 1 ble celler merket og antall tilstøtende celler rundt hver celle ble talt. I bilde 1 har alle ti cellene seks tilstøtende celler, noe som antyder at disse cellene er ordnet i en bikakepakkeorganisasjon (figur 8). Derimot har åtte av 10 celler (80 % av cellene) seks tilstøtende celler i bilde 2 som indikerer at cellene er uregelmessig pakket (figur 8).

Til slutt, for å måle fibercellebredden, ble de perifere fibercellene plassert ~ 10 μm innover fra dreiepunktet i faste villlinser merket med rhodamin-falloidin undersøkt (figur 9A) 2,4. Merk at det også er mulig å måle fibercellebredder ved hjelp av levende tdTomat-mus, men signalet fra linser som er heterozygote for tdTomato har en tendens til å være svake ved ekvatorialområdene. Derfor anbefales det å bruke mus som er homozygot for tdTomato, da de har vist seg å ha sterkere fluorescens (ikke vist). Avstanden mellom de F-aktinfargede cellegrensene ved hjelp av linjeskanningsanalyse ble målt som beskrevet tidligere for å indikere fibercellebredde 2,4 (figur 9B). Denne analysen viste at den gjennomsnittlige interpeakavstanden i villtypelinser er 11,45 ± 2,11 μm (N = 117 fiberceller fra 4 forskjellige muselinsebilder, figur 9B).

Figure 1
Figur 1: Trinn for å lage agarosedivot for å immobilisere linsen under avbildning. (A) Ved hjelp av en glassfatfat, pipette flytende 2% agarose. (B) Flat ut med en fleksibel dekkslip og (C) fjern med tynn tupptang når den er avkjølt. (D) For divot, lag et hull ved hjelp av en 3 mm biopsistans. (E) Aspirate gjenværende agaros, skyll med PBS, tørk overflaten ren med et lofritt vev. (F) Monter forsiktig hele objektivet i divot. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Trinn for å lage agarosedivot for avbildning av linsens ekvatoriale epitel- og fiberceller. (A) Hell 2% smeltet agarose i vevskulturskålen. (B) Avkjøl agarosen ved romtemperatur til den stivner helt. (C) Lag et trekantet dykk med et skarpt blad. (D) Ha 1 ml 1x PBS i vevskulturskålen. (E) Plasser den dissekerte linsen i kilen med (F) linsen støttet opp på ekvator klemt mellom agaroseveggene (rød pil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse av linsekapseltykkelse. Sagittale (X, Z plane view) optiske seksjoner fra rekonstruksjoner av konfokale z-stabler av (A) levende og (B) faste linsekapsler. Fluorescerende intensitet av linjeskanning av (C) levende og (D) faste linser viser en enkelt WGA (grønn) topp som tilsvarer kapselens øverste overflate og den basale regionen av epitelceller (rød) ved siden av kapselen. Avstanden mellom de to toppene måles for å kvantifisere kapseltykkelsen. Bilder tatt ved hjelp av et 40x oljeobjektiv med et 1 luftig enhetshull som resulterer i optiske seksjoner på 1,0 μm og 1,2 μm i henholdsvis tdTomato/Rhodamine-Phalloidin- og WGA-kanalene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kvantifisering av epitelcelleareal. (A) X, Z-planvisning av linseepitelceller merket med (B) tdTomato for cellemembraner og (C) Hoechst for kjerner. (D) X, Y-planvisning av den midterste delen av linseepitelceller. (E) tdTomato-signal brukes som en veiledning for å definere et interesseområde som tilsvarer en gruppe celler som er i fokus. (F) Området for den definerte regionen er bestemt. (G) Hoechst-farging for kjerner brukes til å bestemme antall celler innenfor det definerte området. (H) Antall kjerner telles ved hjelp av (I) FIJI ImageJs flerpunktsverktøy. For å beregne det gjennomsnittlige celleområdet, del det totale arealet av det definerte interesseområdet med det totale antall celler. Bilder tatt ved hjelp av et 63x oljeobjektiv med et 1 luftig enhetshull som resulterer i optiske seksjoner på henholdsvis 0,7 μm og 1,0 μm i Hoechst- og tdTomato-kanalene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bestemmelse av kjernefysisk område og form. (A) XY-planbilde av den midterste regionen av kjerner. (B) Et interesseområde der kjerner er i fokus ble definert. Kjerner innenfor avkastningen er skissert. (C) Arealet og sirkulariteten til kjerner av individuelle celler ble tabulert og gjennomsnitt for areal og sirkularitet ble beregnet. Bilder tatt ved hjelp av et 63x oljemål med et 1 luftig enhetshull, noe som resulterer i en optisk seksjon på 0,7 μm i Hoechst-kanalen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Identifisering av linsens dreiepunkt. F-aktin og kjerner kan brukes til å identifisere dreiepunktet og meridionale rader. (A) XZ-visning viser beriket falloidinfarging for F-aktin som tilsvarer dreiepunktet. (B) Enkelt optisk XY-planvisningsseksjon med linsedreiepunktet i fokus. Hoechst-farging for kjerner viser at kjernene over dreiepunktet er uregelmessig pakket, mens kjernene under dreiepunktet er nøyaktig justert (øverst til høyre). Falloidinfarging for F-aktin viser at cellene over dreiepunktet er uregelmessig formet, mens cellene under dreiepunktet er pakket i parallelle rader (nederst til venstre). Den røde stiplede linjen viser plasseringen av dreiebenet. Bilder tatt ved hjelp av et 20x objektiv med en 1 luftig enhet pinhole som resulterer i optiske seksjoner på 1,5 μm, 2,0 μm og 2,2 μm i Hoechst, Rhodamine-Phalloidin og WGA-640 kanaler, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7 Bestemmelse av meridional radforstyrrelse. (A) Enkelt XY-planvisning optisk seksjon av villtypen og NMIIAE1841K / E1841K meridionale radceller ~ 5 μm vekk fra dreiepunktet (mot linsekapselen). Hele meridionale radceller er skissert i blått basert på kjernefysisk justering. F-aktin (rød) farging i wildtype-linse viser at meridionale radceller er nøyaktig justert uten tegn på lidelse (0%). En representativ ordnet region i villtype er skissert (oransje). I linser med uordnede celler skisserer vi de uordnede områdene (gul). (B) Høy forstørrelse av ordnet region fra villtype (oransje boks i A). (C) Høy forstørrelse av uordnede områder som viser forskjellige typer forstyrrelser, inkludert (I) forgrening av rader, (II) uregelmessig celleform og tap av bikakepakking, og (III) feiljustering av rader. Bilder fra NMIIAE1841K/E1841K-objektivet viser 15,3 % meridionale radcelleforstyrrelser. Bilder tatt ved hjelp av et 20x objektiv med en 1 luftig enhet pinhole som resulterer i optiske seksjoner på 1,5 μm og 2,0 μm i Hoechst og Rhodamine-Phalloidin kanaler, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Analyse av linse meridional radcelle honeycomb pakking. (A) Enkle optiske XY-seksjoner av meridionale radceller farget med rhodamin-falloidin for F-aktin. Bilder med lav forstørrelse (Topppanelet) viser cellene som evalueres (nummerert i rosa). Område markert med gult er forstørret (nederste panel). De gule romertallene er tellingene av tilstøtende celler. Bilde 1 viser celler som alle er sekskantede i form, hver med 6 tilstøtende celler. Bilde 2 har uregelmessigheter med celle nummer 1 og 5 som har henholdsvis 5 og 7 tilstøtende celler. (B) Data registreres og tabuleres med prosentandelen av sekskantede celler beregnet. Bilder tatt ved hjelp av et 40x objektiv med en 1 luftig enhet pinhole som resulterer i en optisk seksjon på 1,0 μm i Rhodamine-Phalloidin-kanalen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Analyse av fibercellebredder. (A) Enkelt optisk XY-visningsdel av linsefibercellene ~ 10 μm inn fra dreiebenet. Cellene ble farget med rhodamin-falloidin for F-aktinvisualisering ved cellemembranene. En linje (rosa; strek) trekkes over en rekke fiberceller. (B) Representativ linjeskanning av F-aktinintensiteter som funksjon av avstand. Interpeak-avstanden representerer fibercellebredden. Bilder tatt ved hjelp av et 40x objektiv med en 1 luftig enhet pinhole som resulterer i en optisk seksjon på 1,0 μm i Rhodamine-Phalloidin kanaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beskrevne protokollene muliggjør visualisering av høy romlig oppløsning av perifere linsestrukturer og celler i linsens fremre og ekvatoriale regioner. I denne studien ble det vist metoder for visualisering av linsens perifere strukturer ved bruk av intakte (levende eller faste) linser der den generelle 3D-linsearkitekturen er bevart. I tillegg ble enkle metoder for morfometrisk kvantitativ analyse ved hjelp av offentlig tilgjengelig FIJI ImageJ-programvare gitt. Hele monteringsvisualiserings- og kvantifiseringsmetodene har blitt brukt i tidligere studier. Disse metodene tillot oss å forstå responsen til den fremre kapselen og cellene til linseformendring eller aldring 2,4. Disse metodene har også blitt brukt til å undersøke ekvatoriell fibercelleutvidelse på grunn av linseformendring eller aldring 2,4 og for å bestemme NMIIAs rolle i å etablere presise sekskantede former og perifer fibercelleorganisasjon20.

Helmonteringsbilder gir mulighet for høy romlig oppløsning og ansiktsavbildning av linsestruktur. I det fremre linseområdet er helmontert avbildning fordelaktig for flatmontert avbildning ved å forhindre skade som kan endre kapselstrukturintegritet og / eller epitelcellulær morfologi. I tillegg er grensesnittet mellom epitel- og fiberceller bevart. Denne metoden gir fordeler i forhold til visualisering av linseseksjoner, da ansiktsavbildning gir større romlig oppløsning og tillater analyse av epitelcelleområde og nukleært område / form det valgte området (dvs. mid-lateral, som vist her) eller andre regioner av celler. Videre tillater avbildningsmetodene kvantifisering av morfologiske egenskaper på bestemte punkter langs linsens ekvatoriale regioner, noe som muliggjør visualisering av sekskantede former, meridional radcellepakking, dreiepunkt og fibercellebredder, noe som ikke ville være lett oppnåelig via bildefargede linseseksjoner på grunn av mangel på romlig oppløsning og vevsforvrengning som kan oppstå under seksjonering.

De skisserte protokollene tillater også avbildning av levende linser for å spore spesifikke linsestrukturer og celler over tid. Live lens imaging protocol var medvirkende i en tidligere studie, hvor gjentatte målinger analyse av kapseltykkelse og epitelcelleområde fra en underpopulasjon av celler fra samme linse før og etter linsekompresjon for å indusere linseflattning ble utført4. Det ble fastslått at linsekompresjon induserte en reduksjon i kapseltykkelse og en økning i epitelcelleområdet. På grunn av betydelig variasjon i kapseltykkelse og epitelcelleområde mellom individuelle linser og størrelsen på effektene på disse parametrene forårsaket av linsekompresjon, ville det være vanskelig å oppdage forskjeller hvis en uavhengig måledesign ble brukt (dvs. sammenligning av individuelle ikke-komprimerte linser versus individuelle komprimerte linser). Ved hjelp av levende bildebehandlingsmetoder har helmonterte bilder på levende muslinser som endogent uttrykker LifeACT-GFP26 for å visualisere F-aktin i epitelceller22, som muliggjør sporing av F-aktinreorganisering i levende epitelceller, blitt utført.

Mens de skisserte protokollene ble utviklet for avbildning av muselinser og kan tilpasses for å visualisere linsestrukturer i andre arter, er fargeprotokollene for å visualisere linse både fremre og ekvatoriale perifere strukturer i andre gnagerlinser (rotte, marsvin) så vel som i andre pattedyrlinser (ku, makak og menneske; data ikke vist). Visualisering av strukturer i større linser krever lengre fiksering (4% PFA, på is, 4 timer), blokkering (1 time) og farging (over natten, 4 ° C). Merk at avbildningen i forskjellige arter bare ble utført på faste linser. Live imaging av linser fra andre arter kan være utfordrende da live imaging protokollen bruker linser fra transgene mus som uttrykker fluorogene proteiner. Derfor kan denne avbildningen utelukke avbildningslinser av andre arter der genetiske modifikasjoner ikke er vanlige. Imidlertid har vi vært i stand til å utføre levende visualisering av linseepitelcellemembraner eller F-aktin ved å prestainere muselinser med den lipofile sonden, FM4-64 eller en F-aktinbindende sonde, henholdsvis SiR-Jasplakinolide (SiR-aktin) (ikke vist). Det kan være mulig å bruke slike sonder til å avbilde levende linser fra andre arter. Det må imidlertid utvises forsiktighet ved bruk av slike sonder for å unngå virkninger utenfor målet. for eksempel kan SiR-Jasplakinolide føre til endret F-aktindynamikk27. En annen begrensning ved fargemetodene, enten det er på levende eller faste linser, er at slike sonder har begrenset penetrasjon. Derfor er avbildning begrenset til perifere områder. Det er mulig å avbilde indre regioner (dvs. dype fiberceller) ved hjelp av linser fra tdTomato transgene mus4, som igjen er avhengig av det transgene uttrykket av fluorogene proteiner. Uttrykket må også være høyt nok for lyse signaler i dype fiberceller.

Ikke desto mindre har protokollene som er skissert muliggjort effektiv morfologisk kvantifisering av perifere linsefunksjoner 2,4,20. Kvantifiseringsmetodene er effektive og bruker åpen kildekode, offentlig tilgjengelig FIJI ImageJ-programvare. Mens manuelle sporingsverktøy ble brukt til å identifisere regioner av interesse, kan det være mulig å automatisere identifiseringen av interesseområder. Automatisering kan være så enkelt som å bruke fluorescerende terskel for å forbedre kontrasten for FIJI ImageJ-basert identifisering av bestemte strukturer (dvs. kjernegrenser), eller mer komplekse maskinlæringsalgoritmer for å oppdage celleformforskjeller (dvs. uregelmessige epitel- eller fibercelleformer). Mer kompleks analyse kan kreve enten spesialiserte plugins eller bildebehandlingsprogramvare. Spesialiserte plugins eller programvare kan også tillate å oppnå 3D-volumetriske morfologiske tiltak fra anskaffede z-stabler. Samlet sett, mens de beskrevne kvantifiseringsmetodene er lett tilgjengelige, kostnadseffektive og egnet for mange nyttige utfallsmål 2,4,20, kan bildeprotokollplattformen, i kombinasjon med sofistikert programvareanalyse, gi et vell av ytterligere morfologiske målinger for fremtidige studier.

Linsen er et intrikat biologisk vev med spesialiserte funksjoner som er avhengige av plassering og dybdeavhengige geometrier av cellene og deres tilhørende strukturer. Ved å bruke avbildningsprotokollene og kvantifiseringsmetodene som er demonstrert her, vil det gi en større forståelse av hvordan linsestrukturer og den komplekse organiseringen av linsen er etablert. Videre vil avbildningsprotokollene og kvantifiseringsmetodene bidra til å avgrense forholdet mellom linsestruktur og funksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Eye Institute Grant R01 EY032056 til CC og R01 EY017724 til VMF, samt National Institute of General Medical Sciences under tilskuddsnummer P20GM139760. STI ble støttet av NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del av Chemistry-Biology Interface predoctoral training program, og av en University of Delaware Graduate Scholars Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Biopsy Punch Acuderm Inc NC9084780
Agarose Apex BioResearch Products 20-102GP
Antimycotic/Antibiotic Cytiva SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Prometheus 25-529
Delicate task wipes Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish) World Precision International FD35-100
Hoescht 33342 Biotium 40046
Laser scanning confocal Microscope 880 Zeiss
MatTek Imaging Dish MatTek Life Sciences P35G-1.5-14
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 100503-917
PBS GenClone 25-507B
Phenol red-free medium 199 Gibco 11043023
Rhodamine-Phalloidin Thermo Fisher 00027
Triton X100 Sigma-Aldrich 11332481001
WGA-640 Biotium CF 640R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Tags

Biologi utgave 203
Helmonteringsavbildning for å visualisere og kvantifisere perifer linsestruktur, cellemorfologi og organisasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., … More

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., Fowler, V. M., Cheng, C., Parreno, J. Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization. J. Vis. Exp. (203), e66017, doi:10.3791/66017 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter