Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66017
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

Summary

Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.

Abstract

Oküler lens, ışığı farklı mesafelerden retinaya odaklamak için şeklini değiştiren şeffaf esnek bir dokudur. Kapsül adı verilen organı çevreleyen bir bazal zarın yanı sıra, lens, ön hemisferde tek katmanlı bir epitel hücresi tabakası ve bir yığın lens lifi hücresi kütlesinden oluşan tamamen hücreseldir. Yaşam boyunca, epitel hücreleri lens ekvatorundaki çimlenme bölgesinde çoğalır ve ekvatoral epitel hücreleri göç eder, uzar ve yeni oluşan lif hücrelerine farklılaşır. Ekvatoral epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş parke taşı şeklindeki hücrelerden morfolojiyi, meridyen sıraları oluşturan hizalanmış altıgen şekilli hücrelere büyük ölçüde değiştirir. Yeni oluşan mercek lifi hücreleri, altıgen hücre şeklini korur ve ön ve arka kutuplara doğru uzar, böylece önceki nesil liflerin üzerine binen yeni bir hücre kabuğu oluşturur. Lens epitel hücrelerinin lif hücrelerine dikkat çekici morfogenezini yönlendiren mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Lens yapısını, gelişimini ve işlevini daha iyi anlamak için, tüm oküler lens yuvalarını kullanarak periferik yapıları görüntülemek için yeni görüntüleme protokolleri geliştirilmiştir. Burada, kapsül kalınlığını, epitel hücre alanını, hücre nükleer alanını ve şeklini, meridyen sıra hücre sırasını ve paketlemesini ve lif hücre genişliklerini ölçme yöntemleri gösterilmektedir. Bu ölçümler, yaşam boyu lens büyümesi sırasında meydana gelen hücresel değişiklikleri aydınlatmak ve yaş veya patoloji ile meydana gelen değişiklikleri anlamak için gereklidir.

Introduction

Oküler lens, gözün ön bölgesinde yer alan ve ışığı retinaya ince odaklama işlevi gören esnek, şeffaf bir dokudur. Lensin işlev görme yeteneği, kısmen karmaşık mimarisine ve organizasyonunabağlanabilir 1,2,3,4,5,6. Lens dokusunu çevreleyen, lens yapısını ve biyomekanik özelliklerini korumak için gerekli olan bir bazal membranolan kapsüldür 7,8,9. Lensin kendisi tamamen hücreseldir ve iki hücre tipinden oluşur: epitelyal ve fiber hücreler. Epitel tabakası, lensin10 ön hemisferini kaplayan tek bir küboidal hücre tabakasından oluşur. Yaşam boyunca, epitel hücreleri çoğalır ve lens kapsülü boyunca lens ekvatoruna doğru göç eder. Anterior epitel hücreleri enine kesitte hareketsiz ve parke taşıdır ve lens ekvatorunun yakınında epitel hücreleri çoğalır ve yeni lif hücrelerine farklılaşma sürecinden geçmeye başlar11,12. Ekvator epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş hücrelerden altıgen şekilli hücrelerle organize meridyen sıralarına dönüşür. Altıgen hücre şekli, bu farklılaşan hücrelerin bazal tarafında korunurken, apikal taraf lens dayanak noktasında veya modiolus 4,13,14,15'te daralır ve sabitlenir. Ekvatoral epitel hücreleri yeni oluşan lif hücrelerine uzamaya başladığında, hücrelerin apikal uçları ön epitel hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca ön kutba doğru hareket ederken, bazal uçlar lens kapsülü boyunca arka kutba doğru hareket eder. Yeni nesil fiber hücreler, önceki nesil hücrelerin üzerini kaplayarak küresel lif kabukları oluşturur. Hücre uzaması ve olgunlaşma süreci sırasında, lif hücreleri morfolojilerini önemli ölçüde değiştirir 11,12,16. Bu lif hücreleri, lens kütlesinin 11,12,16,17,18 kütlesini oluşturur.

Karmaşık lens mikro yapılarının, hücre morfolojisinin ve benzersiz hücresel organizasyonun kurulmasına katkıda bulunan moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca, lens kapsülünün ve hücre yapısının genel lens fonksiyonuna (saydamlık, lens şekli değişikliği) katkısı belirsizdir. Bununla birlikte, bu ilişkiler yeni görüntüleme metodolojisi ve lens yapısal ve hücresel özelliklerinin kantitatif değerlendirmeleri kullanılarak aydınlatılmaktadır2,4,19,20,21,22. Lens kapsülünün, epitel hücrelerinin ve periferik fiber hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlükte görüntülenmesine izin veren tüm lensleri görüntülemek için yeni protokoller geliştirilmiştir. Bu, kapsül kalınlığını, hücre boyutunu, hücre çekirdeği boyutunu ve daireselliğini, meridyen sıra sırasını, fiber hücre paketlemesini ve fiber hücre genişliklerini ölçmek için metodolojiyi içerir. Bu görselleştirme ve görüntü niceleme yöntemleri, derinlemesine morfometrik incelemeye izin verir ve genel 3D doku yapısını koruyarak diğer görselleştirme yöntemlerine (düz bağlantıların veya doku kesitlerinin görüntülenmesi) göre avantajlara sahiptir. Bu yöntemler, yeni hipotezlerin test edilmesine izin vermiştir ve lens hücresi paterni gelişimi ve işlevinin anlaşılmasında sürekli ilerlemeyi sağlayacaktır.

Aşağıdaki deneyler için, her iki cinsiyetten 6 ila 10 haftalık yaşlar arasında C57BL/6J arka planında vahşi tip ve Rosa26-tdDomates fareleri tandem dimer-Domates (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) kullanıyoruz. tdTomato fareleri, N-terminal miristilasyon ve iç sistein-palmitoilasyon bölgeleri23 yoluyla plazma zarını hedef alan mutasyona uğramış bir MARCKS proteininin N-terminal 8 amino asitlerine kaynaşmış tdTomato proteininin ekspresyonu yoluyla canlı lenslerde hücresel plazma zarlarının görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca orijinal olarak Dr. Robert Adelstein'dan (Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) elde edilen NMIIAE1841K / E1841K fareleri24 kullanıyoruz. Daha önce açıklandığı gibi, CP49 boncuklu ara filament proteini kaybına sahip (olgun lif hücresi morfolojisini ve tüm lens biyomekaniğini korur) FvBN/129SvEv/C57Bl6 arka planındaki NMIIAE1841K/E1841K fareleri, C57BL6/J vahşi tip farelerle geri çaprazlanır. Yavruları vahşi tip CP49 alelinin varlığı açısından taradık.

Konfokal görüntüleme, 20x (NA = 0.8, çalışma mesafesi = 0.55mm, 1x yakınlaştırma), 40x (NA = 1.3 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.2mm, 1x yakınlaştırma) veya 63x (NA = 1.4 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.19mm, 1x yakınlaştırma) büyütme ile lazer taramalı konfokal floresan mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi. Tüm görüntüler, optik kesit kalınlığının belirleyicisi olan iğne deliği boyutu kullanılarak 1 Airy Unit'e kadar elde edilmiştir (ortaya çıkan optik kalınlıklar şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Görüntüler Zen Software'de işlendi. Görüntüler .tif formatta dışa aktarıldı ve ardından FIJI ImageJ Yazılımına (imageJ.net) aktarıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fareler, patojen içermeyen bir ortamda tutulan Delaware Üniversitesi hayvan tesisinde barındırılır. CO2 inhalasyonu ile ötenazi de dahil olmak üzere tüm hayvan prosedürleri, Delaware Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış hayvan protokollerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Tüm lens yuvası hazırlığı ve görüntüleme

  1. Tüm montaj görüntüleme için lenslerin sabitlenmesi
    1. Ötenaziyi takiben, daha önce tarif edildiği gibi gözleri enüklee edin ve lensleri inceleyin25. Diseksiyonu takiben, lensleri hemen oda sıcaklığında taze 1x fosfat tamponlu salin (PBS; 1.1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3.0 mM Na2HPO 4-7H2O; pH 7.4) içine aktarın.
      NOT: Lensler PBS'de uzun süre saklanırsa hücresel morfoloji değişebilir, bu nedenle diseksiyondan hemen ~ 10 dakika sonra düzeltilmesi önerilir.
    2. Lens ön bölgesinin tam montajlı görüntülenmesi için, oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj tüpünde 1x PBS'de 0,5 mL yeni yapılmış %4 paraformaldehit (PFA) içine daldırarak tüm lensleri sabitleyin. 30 dakika sonra, lensleri 3x (yıkama başına 5 dakika) 1x PBS ile yıkayın. Adım 1.2'ye geçin veya 1 °C'de 4x PBS'de saklayın. Sabit lensler 5 güne kadar saklanabilir.
    3. Lens ekvator bölgesinin tam montajlı görüntülenmesi için, oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj tüpünde 1x PBS'de 0,5 mL yeni yapılmış %4 PFA'ya daldırarak tüm lensleri sabitleyin. 1 saat sonra, lensleri 3x (yıkama başına 5 dakika) 1x PBS ile yıkayın. Adım 1.3'e geçin veya 1x PBS'de 4 °C'de saklayın. Sabit lensler 5 güne kadar saklanabilir.
  2. Ön lens bölgesinin tamamı (Sabit veya canlı)
    1. Sabit lenslerin tam montajlı görüntülenmesi için adım 1.2.3'e geçin.
    2. Canlı lenslerin tam montajlı görüntülenmesi için, lensleri %1 antibiyotik/antimikotik içeren 1 mL Orta 199 (fenol kırmızısı içermeyen) içeren 48 oyuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Lensleri görüntülemeye kadar 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. Görüntülemeden önce, lensleri floresan etiketli Buğday Tohumu Aglütinini (WGA-640, 1:500) ve Hoechst 33342 (1:500) içeren bir çözelti içinde Orta 199'da en az 10 dakika inkübe edin. Adım 1.5'e geçin.
    3. Lens kapsülünü, F-aktini ve sabit lenslerin çekirdeklerini boyamak için, lensleri WGA-640 (1:500), rodamin-phalloidin (1:50) ve Hoechst 33342 (1:500) içeren 500 μL'lik bir çözeltiye geçirgenleştirme/bloke etme tamponuna yerleştirin (%0,3 Triton, %0,3 sığır serum albümini (Fraksiyon V) ve %3 keçi serumu içeren 1x PBS) bir mikrosantrifüj tüpünde. Lensleri gece boyunca 4 °C'de boyayın.
    4. Gece boyunca inkübasyondan sonra, lensleri 3x (yıkama başına 5 dakika) 1 mL 1x PBS ile yıkayın. Görüntüleme lenslerine geçin.
    5. Konfokal görüntüleme için sabit lensi stabilize etmek için, daha önce açıklandığı gibi bir görüntüleme kabı üzerinde agarozda lens immobilizasyon divotları oluşturun21 (Şekil 1).
      1. Çözelti sıvılaşana kadar bir mikrodalga kullanarak PBS'de% 2 agarozu ısıtın ve hafifçe karıştırın. 250 μL sıvılaştırılmış %2 agarozu cam tabanlı bir tabağa pipetleyin (Şekil 1A) ve esnek bir plastik lamel kullanarak agarozu tabak boyunca düzleştirin (Şekil 1B). Agaroz soğuduktan ve tamamen katılaştıktan sonra, ince uçlu forseps kullanarak lameli çıkarın (Şekil 1C) ve çanağın ortasında agarozda bir delik oluşturmak için 3 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanın (Şekil 1D).
      2. Hassas bir görev mendili kullanarak fazla agarozu çıkarın (Şekil 1E). Agaroz küfünü 1x PBS ile nemlendirin ve kullanana kadar 4 °C'de tutun. Agaroz küfleri 1 haftaya kadar başarıyla saklanmıştır.
    6. Embriyo forseps kullanarak, canlı veya sabit lensi, ~2 mL 1x PBS (sabit lens) veya fenol kırmızısı içermeyen Medium 199 (canlı lens) içeren agarozdaki divot'a yavaşça aktarın (Şekil 1F) ve ardından tabağı ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Lensin ön bölge objektife bakacak şekilde yerleştirildiğini doğrulamak için çekirdek boyamayı görselleştirin. Herhangi bir çekirdek gözlenmezse, arka bölge hedefe bakıyor olabilir.
    7. Lensi ters çevirmek için kavisli forseps kullanın ve ön bölge objektife bakacak şekilde lensi hafifçe ~180° döndürün. Konfokal mikroskop kullanarak görüntüler elde edin.
    8. Lens kapsüllerinin görselleştirilmesi için, 0,3 μm adım boyutuna sahip 40x objektif kullanarak z-yığını görüntüleri elde edin. Lens kapsülünün yüzeyinden önceki ilk görüntüyü (WGA boyama ile gösterilir) ve epitel hücrelerinin apikal yüzeyinden sonraki son görüntüyü elde edin. Epitel hücrelerini görselleştirmek için, lens epitel hücrelerinin görselleştirilmesi için 0,3 μm'lik bir adım boyutuna sahip 63x objektif kullanarak z-yığını görüntüleri elde edin.
      NOT: Bu mikroskop parametreleri, kapsül kalınlığının veya epitel hücre alanının görüntü ölçümü için gerekli olan görüntülerin yeterli üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonuna izin verir. Daha önce tarif edildiği gibi epitel hücresi tek tabakasının ötesini görüntüleyerek canlı lens tdTomato lenslerinde sütürlerin görüntülenmesi de mümkündür4.
  3. Lens ekvatoral epitel ve lif hücre boyama
    1. Sabit lensleri 0.5 mL'lik bir rodamin-phalloidin çözeltisine yerleştirin (1:300), WGA-640 (1:250) ve Hoechst 33342 (1:500) geçirgenlik/bloke edici çözelti içinde (% 3 BSA,% 3 keçi serumu ve% 0.3 Triton) bir mikrosantrifüj tüpü içinde. Gece boyunca 4 °C'de muhafaza edin.
    2. Gece boyunca inkübasyondan sonra, lensleri 1 mL 1x PBS'de 3x yıkayın (yıkama başına 5 dakika).
    3. Daha önce tarif edildiği gibi lens immobilizasyon agaroz takozları oluşturun 4,10.
      1. Kısaca, cam tabanlı tabaklarda (FD35-100, WPI) 1x PBS'de ~5-6 mL erimiş %2 agarozu tabaklara dökerek agaroz takozları oluşturun (Şekil 2A). Agaroz katılaştığında (Şekil 2B), keskin bir bıçakla üçgen bir divot oluşturun (Şekil 2C). Agaroz kamasını çıkarın ve agaroz kabına 1 mL 1x PBS yerleştirin (Şekil 2D).
      2. Agarozun kesilmesinden geride kalmış olabilecek herhangi bir kalıntı agarozu aspire edin. Birden fazla farklı boyuttaki lense uyacak şekilde çanak başına birden fazla kama oluşturulabilir (gösterilmemiştir). Agaroz kalıbını saklamak için, agaroz kalıbının üzerine 1 mL 1x PBS yerleştirin ve 4 °C'de tutun. Takozlar 1 haftaya kadar saklanabilir.
    4. Kavisli cımbız kullanarak, lensi 1 mL 1x PBS içeren bir agaroz kamasının içine yerleştirin ve lensin ekvator bölgesi, konfokal objektifin üzerindeki mikroskop camına bakacak şekilde ayarlayın (Şekil 2E-F). Ekvator bölgesinin odakta olduğunu doğrulamak için çekirdekleri görselleştirin ve çekirdeklerin ekvatorda sıralar halinde hizalandığından emin olun. Ekvatoral epitel hücreleri, düzensiz bir şekilde paketlendikleri ve şekillendirildikleri için de tanımlanabilir. Ayrıca, meridyen sıra hücreleri, hücre zarlarında F-aktin boyaması ile gösterilen hassas bir şekilde hizalanır ve altıgen şeklindedir.
    5. Görüş alanındaki çekirdekler rastgele paketlenirse, merceğin ön tarafı objektife bakar. Çekirdekler gözlemlenemiyorsa, merceğin arka tarafı büyük olasılıkla objektife bakıyordur. Mercek ekvatoruna oturmuyorsa, merceği yeniden yönlendirin ve mercek ekvatorunda tam olarak hizalanmış çekirdekler gözlemlenene kadar merceği döndürmek için kavisli cımbızı kullanın.
    6. Lazer taramalı konfokal mikroskop (20x objektif, NA = 0.8, adım boyutu 0.5 μm ve/veya 40x yağ objektifi, NA = 1.3, adım boyutu 0.4 μm) kullanarak lens ekvatoral epitel ve lif hücrelerini görüntüleyin. Ekvatoral epitel hücrelerinin en üstte olduğu, ardından hemen altında meridyen sırası ve lif hücrelerinin bulunduğu z-yığını toplamadan önce görüntüleri döndürün.

2. Görüntü analizi metodolojisi

  1. Lens kapsülü kalınlığı ölçümü
    1. WGA ile etiketlenmiş canlı tdTomato lenslerin veya WGA ve rho-phalloidin ile etiketlenmiş sabit lenslerin 40x objektifi (0,3 μm adım boyutu) ile elde edilen z-yığını görüntüleri kullanarak, 3D rekonstrüksiyonun XZ görünümünde optik bir 2D projeksiyon elde edin ve .tif formatında kaydedin. Zen yazılımını kullanarak görüntüleri işleyin.
    2. XZ dilim (.tif) görüntülerini FIJI ImageJ yazılımında açın.
    3. Lens kapsülü kalınlığını ölçmek için düz çizgi işlevini kullanın (Şekil 3A,B'de gösterilmiştir). Çizgi genişliğini 50 piksel olarak ayarlamak için Çizgi genişliğini 50 piksel olarak ayarlayın > Seçenekleri Düzenle > seçin. Bu çizgi genişliği, mikroskop ayarlarıyla yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için ampirik olarak belirlendi. Optimum çizgi genişliği, diğer mikroskoplarda/mikroskop ayarlarında veya diğer türlerden lensler kullanıldığında farklılık gösterebilir. Ardından, kapsülün üst yüzeyinden epitel hücrelerinin bazal bölgesinin altına bir çizgi çizin.
    4. Ctrl + T tuşlarına basarak satırı ilgilendiğiniz bir bölge olarak kaydedin.
    5. Kanalları görüntü, renk ve bölünmüş kanallar için sekmelere ayırın.
    6. Ctrl + K tuşlarına basarak kapsül kanalı çizgisi boyunca yoğunluğu ölçün.
    7. Bir elektronik tabloda, yoğunluk değerlerini mesafenin bir fonksiyonu olarak çizin ve sırasıyla epitel hücrelerinin kapsül yüzeyini ve bazal bölgesini temsil eden kapsül ve F-aktin için yoğunluk tepe noktalarını belirleyin. X ekseninde çizgi mesafesi bulunur.
    8. Ardından, kapsül ve epitelyal floresan yoğunluk pikleri arasındaki mesafeyi belirleyerek kapsül kalınlığını hesaplayın (Şekil 3C, D).
  2. Hücre alanı analizi
    1. Canlı tdTomato lenslerinde veya falloidin ile etiketlenmiş sabit lenslerde 63x objektif lens (NA = 1.4; 0.3 μm adım boyutu) kullanılarak elde edilen z-yığını görüntülerini kullanarak, epitel hücrelerinin orta (lateral) bölgesinin odakta olduğu yere karşılık gelen bir z-yığını konfokal görüntüden bir XY görünüm dilimini analiz edin. Yan zarların, tdTomato membran boyası kullanılarak veya lateral hücre zarlarında bulunan falloidin görselleştirilerek görülebildiğine dikkat edin.
      NOT: Merceğin eğriliği nedeniyle (XZ görünümünde görüldüğü gibi; Şekil 4A-C), görüntüde tüm epitel hücreleri odakta olmayacaktır. Epitelin orta bölgesi, hem hücre yan zarlarının (Şekil 4D-E) hem de çekirdeklerin (Şekil 4G-I) odakta olduğu bölgeye karşılık gelir.
    2. Görüntüyü .tif olarak dışa aktarın ve FIJI ImageJ'de açın.
    3. Analiz için FIJI ImageJ'de ölçeği ayarlamak için, konfokal görüntüden bir ölçek çubuğunun uzunluğu olan bir çizgi oluşturmak için çizgi aracını kullanın.
    4. Çizginin piksel uzunluğunu ve ölçek çubuğunun uzunluğunu kaydedin. Araç çubuğu menüsünde Çözümle'ye gidin ve Ölçeği Ayarla'yı seçin. Piksel sayısını, yani Piksel cinsinden Mesafe'ye çizginin uzunluğunu girin ve Bilinen Mesafe'ye ölçek çubuğunun bilinen uzunluğunu girin.
    5. Hücre sınırlarının bir göstergesi olarak tdTomato veya rodamin-phalloidin boyamayı kullanarak, çokgen aracını kullanarak görüntüde odakta olan bir hücre popülasyonunu manuel olarak ana hatlarıyla belirtin. Yalnızca yanal zarların görülebildiği hücreleri izleyin (Şekil 4E) ve kısmen görünür hücrelerin (yani görüntülerin kenarında) izlemekten kaçının. Ctrl+T tuşlarına basarak yatırım getirisinden tasarruf edin. Araç çubuğu menüsünde Düzenle'ye gidin ve Dışını Temizle'yi seçin. Şimdi FIJI ImageJ'de Ctrl + M tuşlarına basarak toplam hücre alanını (ROI) ölçün.
    6. ROI alanını toplam hücre sayısına bölerek ortalama hücre alanını hesaplayın. Hücre sayısını belirlemenin basit bir yolu, çekirdek sayısını saymaktır. Çekirdek kanalına (mavi) gidin. ROI menüsünde, hücrelerin kaydedilmiş ROI anahattını seçin (Şekil 4G). Düzenle'ye gidip Dışını temizle'ye tıklayarak YG'nin dışını temizleyin (Şekil 4H). Çok noktalı aracı kullanarak, tek tek çekirdeklere tıklayarak çekirdekleri sayın.
  3. Hücresel nükleer alan ve şekil analizi
    1. Çekirdek alanı ve şekil analizi için, tdTomato epitel hücrelerinin orta (lateral) bölgesinin odakta olduğu yere karşılık gelen bir z-yığını konfokal görüntüden bir XY düzlemi görünümü optik kesitini analiz edin. Nükleer alanın en büyük olduğu konfokal bir görüntüden bir z-yığını dilimini analiz edin (Şekil 5A); Bu, çekirdeğin orta kısmını temsil eder.
      NOT: Merceğin eğriliği nedeniyle, XZ görünümünde görülebileceği gibi tüm çekirdeklerin odakta olmayacağını unutmayın (Şekil 4G ve Şekil 5A).
    2. Odakta olan bir çekirdek alt popülasyonu seçin ve bir yatırım getirisi kaydedin.
    3. Dışını Temizle işlevini kullanın. ROI içinde, Serbest El seçim aracını (soldan dördüncü menü düğmesi) kullanarak, çekirdeklerin sınırlarını dikkatlice izleyin (Şekil 5B). Ctrl+T tuşlarına basarak her nükleer izi ROI penceresine kaydedin. Yalnızca tüm çekirdeklerin görülebildiği ve çekirdeklerin birbirine değmediği ana hatları çizin.
    4. Tüm çekirdekler ana hatlarıyla belirtildikten sonra, Ctrl+M tuşlarına basarak tek tek hücrelerin nükleer alanını ve şeklini (yani daireselliğini) ölçün.
    5. Verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın ve ortalama nükleer alanı ve döngüselliği hesaplayın (Şekil 5C).
  4. Meridional sıra epitelyal paketleme
    1. Meridyen sırası bozukluğunu ölçmek için 20x objektif (0,5 μm adım boyutu) kullanarak görüntüler elde edin.
    2. Görüntülerdeki lens dayanak noktasını/modiolusu tanımlayın. Dayanak noktası, uzayan epitel hücrelerinin apikal uçlarının, ekvatordaki ilk lif hücresi farklılaşması ve uzaması sırasında bir bağlantı noktası oluşturmak üzere daraldığı bölgedir. Dayanak noktasını parlak F-aktin yoğunluğuna ( Şekil 6A'da XZ görünümünde ok ucu ile gösterilir; Şekil 6B'de kırmızı kesikli çizgi ile gösterilir) ve XY görünümünde tek bir optik bölümde hücresel organizasyondaki değişikliğe göre tanımlayın.
      NOT: Ek olarak, epitel hücrelerinin hem bazal hem de apikal bölgelerinin F-aktin boyaması dayanak noktasının üzerinde belirgindir, oysa uzama hücrelerinin sadece bazal bölgesi dayanak noktasının altında belirgindir (Şekil 6A). Dayanak noktasının üzerindeki epitel hücreleri düzensiz bir şekilde paketlenir ve rozetler oluşturma eğilimindeyken, dayanak noktasının altındaki lif hücreleri, zarda parlak F-aktin boyaması ile gösterilen paralel sıralar halinde düzenlenir (Şekil 6B).
    3. 2 aylık farelerde dayanak noktası tanımlandıktan sonra, XY düzleminde dayanak noktasına (lens kapsülüne doğru) ~4.5-5 μm periferik tek optik bölümü seçin. Bu mesafe, 2 aylık farelerdeki meridyen sıra hücrelerinin tüm çekirdeklerinin, dayanak noktasına ~ 5 μm periferik olduklarında odakta olduğu gözlemine dayanarak seçilir. Tek optik bölümü (.tif) kaydedin. Resmi FIJI'de açın.
      NOT: Bu analiz sadece 2 aylık fareler üzerinde yapılmıştır ve bu nedenle bu mesafenin yaşla değişip değişmediği sonucuna varılamaz.
    4. Görüntü analizi gerçekleştirmeden önce, adım 2.2.2'yi kullanarak ImageJ'de ölçeği μm olarak ayarlayın.
    5. Şekil 7A'da gösterildiği gibi, nükleer hizalamayı tanımlayarak serbest çizgi aracını (ilgilenilen bölge/ ROI) kullanarak tüm meridyen sıra bölgelerini manuel olarak ana hatlarıyla belirtin. Ctrl+T tuşlarına basarak yatırım getirisinden tasarruf edin. Araç çubuğu menüsünde Düzenle'ye gidin ve Dışını Temizle'yi seçin. FIJI ImageJ'de Ctrl + M tuşlarına basarak toplam hücre alanını (ROI) ölçün.
    6. FIJI ImageJ'deki serbest çizgi aracını kullanarak ana hatlarını çizerek F-aktin boyama ile gösterilen herhangi bir bozukluk bölgesini tanımlayın. Düzensiz bölgeler için kriterler arasında satırların dallanması, düzensiz paketleme ve satırların yanlış hizalanması yer alır (Şekil 7B), daha öncegösterildiği gibi 20.
    7. FIJI ImageJ'de Ctrl + M tuşlarına basarak özetlenen düzensiz alanı ölçün/yamalı. Bir elektronik tablodaki toplam düzensiz alanı toplayın.
    8. Toplam düzensiz alanı ROI alanına bölün, ardından yüzde düzensiz bir alan elde etmek için 100 ile çarpın. Herhangi bir bozukluk gözlenmezse, düzensiz bölge için %0 değerini koyun.
  5. Komşu hücrelerin meridyen sıra sayısı
    1. Komşu hücrelerin sayısını ölçmek için, 40x yağ objektifi (0.4 μm adım boyutu) ile elde edilen F-aktin lekeli görüntüleri kullanın.
    2. Meridyen sıra hücrelerinin bazal bölgesinde, F-aktinin meridyen sıra hücrelerinin tüm çevresi boyunca zenginleştirildiği lens kapsülünden içe doğru bir optik kesit (XY düzlemi) tanımlayın, tüm meridyen sıra hücreleri odakta ve aynı düzlemdedir.
    3. Her meridyen sıra hücresinin sahip olduğu bitişik hücrelerin sayısını sayın (Şekil 8). Bir e-tabloda altı bitişik hücreye sahip hücrelerin ortalama yüzdesini ölçün.
      NOT: 20x objektife sahip bitişik hücrelerin sayısını belirleyin. Bununla birlikte, altıgen şeklini 40x objektifle gözlemlemek önemli ölçüde daha kolaydır.
  6. Ekvatoral lif hücrelerinin görüntü analizi
    1. 20x objektif (0,5 μm adım boyutu) ile rodamin falloidin lekeli lenslerin z-stack konfokal görüntülerini alın.
    2. Dayanak noktasını adım 2.4.2'de belirtildiği gibi tanımlayın. Dayanak noktası tanımlandıktan sonra, tek bir optik bölüm seçin. Standardizasyon amacıyla ve lensler arasında karşılaştırma yapmak için, XY düzlemindeki dayanak noktasından ~10 μm içeriye doğru fiber hücre genişliklerini ölçün (Şekil 9A).
    3. Ham görüntüleri FIJI ImageJ'ye aktarın. FIJI ImageJ'de, F-aktin lekeli pikler arasındaki mesafeyi ölçmek için birkaç bitişik fiber hücre boyunca bir çizgi (genellikle ~ 300-400 μm uzunluğunda) çizin (çizgi tarama analizi; Şekil 9A; pembe çizgi).
    4. Ctrl+K tuşlarına basarak FIJI'de çizgi tarama mesafesi üzerinden floresan yoğunluğunu elde edin. Ardından, tepeler arası mesafeyi hesaplamak için verileri elektronik tabloya aktarın (örnek Şekil 9A-B'de gösterilmiştir). Bu, lif hücre genişliklerine karşılık gelir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ön lens kapsülü, epitel hücre alanı ve nükleer alan
Lens kapsülü kalınlığını analiz etmek için, canlı veya sabit lenslerdeki lens kapsüllerini WGA ile boyadık. Lens epitel hücrelerini, canlı lenslerde membranları tdTomato ile etiketleyerek (Şekil 2A) veya sabit lenslerde hücre membranlarında F-aktin için rodamin-phalloidin boyaması yoluyla tanımladık (Şekil 2B). Ortogonal (XZ) bir projeksiyonda, WGA ve tdTomato/rodamin-falloidin için boyama, floresan yoğunluğunun tepeden tepeye çizgi tarama analizini yapmamızı sağlar. WGA kanalındaki majör pik kapsüler yüzeyi gösterirken, tdTomato/rodamin-phalloidin kanalındaki majör pik epitel hücrelerinin bazal bölgesini gösterir. Bu pikler arasındaki mesafeyi hesaplayarak kapsül kalınlığı elde edebiliriz. Çizgi tarama analizi, 9 haftalık bir fare canlı merceğinden alınan kapsüllerin 11.2 μm kalınlığa sahip olduğunu ve 9 haftalık bir fare sabit merceğinden alınan kapsüllerin 12.5 μm kalınlığa sahip olduğunu göstermektedir. Gözlenen bu kapsül kalınlıkları önceki bulguları temsil etmektedir 2,4.

tdTomato etiketli transgenik fare lenslerinin (veya rodamin-falloidin lekeli lenslerin; gösterilmemiştir) tam montajlı görüntülemesi, epitel hücre morfolojisinin canlı olarak görüntülenmesine izin verir. Ortogonal (XZ) projeksiyon, lens epitel hücresinin yandan görünümünü sağlarken, lateral bölgelerdeki düzlemsel (XY) görünüm, epitelyal poligonal şeklin görselleştirilmesine izin verir. Sağlıklı lenslerde hücreler arasında herhangi bir boşluk gözlemlemeyiz. Bir görüntüdeki hücre popülasyonunu izleyerek ve alanı ROI içindeki hücre sayısına bölerek ortalama hücre alanını hesaplayabiliriz. Hücre sayısı, belirli bir ROI'deki Hoechst boyalı çekirdeklerin sayısı sayılarak belirlenir. Analiz, önceki çalışmalarla uyumlu olarak 260μm2'lik bir ortalama hücre alanı göstermektedir 2,4.

Çekirdeklerin Hoechst boyaması ayrıca epitel hücrelerinde lens epitel hücresi nükleer morfometrisinin incelenmesine izin verir. Ortogonal (XZ) çıkıntılar, çekirdeklerin yandan görünümüne izin verir. Düzlemsel (XY) görünüm, çekirdeklerin dairesel/elipsoid şekillerini gösterir. Çekirdeklerin izlenmesi, tek tek hücrelerin nükleer alanının ve dairesellik gibi diğer şekil parametrelerinin hesaplanmasına olanak tanır. Analiz, ortalama 0.8 dairesellik ile 64μm2'lik bir ortalama nükleer alan göstermektedir. 1'e yakın dairesellik değerleri mükemmel bir daireyi gösterirken, 0'a yaklaşan değerler daha uzun bir morfolojiyi gösterir.

Ekvatoral epitel hücresi ambalajı, fiber hücre altıgen ambalajı ve fiber hücre genişlikleri
Lens ekvator bölgesinin düzlemsel (XY) görünümü, dayanak noktasında birleşen altıgen şekilli ve düzenli olarak paketlenmiş lens epitel hücrelerini gösterir. Dayanak noktası, uzayan epitel hücrelerinin apikal uçlarının, ekvator 4,13,14,15'teki ilk lif hücresi farklılaşması ve uzaması sırasında bir bağlantı noktası oluşturmak üzere daraldığı yerdir (Şekil 6B, kırmızı kesikli bir çizgi ile gösterilmiştir). Dayanak noktası, ekvatoral epitel hücrelerini ve lif hücrelerini ayıran sürekli bir çizgi oluşturan artan F-aktin boyamasına dayalı olarak lokalize edilebilir (Şekil 6B, kırmızı kesikli çizgi). Hücresel zarlardaki F-aktin boyaması, dayanak noktasının altındaki hücrelerin hassas bir şekilde hizalandığı ve paralel sıralar halinde düzenlendiği hücre şeklindeki değişiklikleri de gösterir (Şekil 6). Hücre çekirdekleri de dayanak noktasının altında hizalanır.

Lens meridyen sıra epitel hücrelerini ve lif hücrelerini görselleştirmek için, meridyen sıra hücrelerinin bazal bölgesinin göründüğü XY düzleminde dayanak noktasına (lens kapsülüne doğru) 4.5-5 μm periferik bir görüntü, daha önce açıklandığı gibiseçilir 20. Meridyen sıra bozukluğunu ölçmek için, bir ilgi alanı (ROI) ana hatlarıyla belirtilmiştir (Şekil 7A; sarı kutu). Wildtype lens görüntüsündeki ROI alanı 15.833μm2'dir. Gözlenebilir bir bozukluk olmadığı için bozukluk alanı yüzdesi 0'dır. Kas dışı miyozin IIA'nın (NMIIA), NMIIA-E1841K mutasyonuna sahip fareler kullanılarak hücre altıgen paketlemede oynadığı kritik rol daha önce tanımlanmıştır20. Şekil 7A , meridyen sıra hücresi bozukluğunu göstermek için temsili bir NMIIAE1841K/E1841K lens ekvator görüntüsünü göstermektedir. Meridyen sırası ROI'si 20.757μm2 idi. Daha sonra, düzensiz yamaların toplam alanı izlendi. Toplam bozukluk alanı 3.185μm2 idi. Hesaplanan bozukluk yüzdesi %15.3 olarak belirlendi (düzensiz alan x 100/toplam ROI; Şekil 7B). Bu yüzde düzensiz alan, önceki bir çalışmada20 aralığındadır.

Daha sonra, vahşi tip meridyen sıra hücrelerinde altıgen paketlemenin incelenmesi gösterilmiştir20. F-aktin, meridyen sıra hücrelerinin tüm çevresi etrafında ve vahşi tip (yani, NMIIA +/+) lenslerde hücre zarlarının bazal bölgelerinin altı köşesinde zenginleştirildiğinden, hücre şekillerini ve paketleme organizasyonunu değerlendirmek için F-aktin boyama kullanıldı. Temsili resim 1'de, hücreler etiketlendi ve her hücrenin etrafındaki bitişik hücrelerin sayısı sayıldı. Resim 1'de, on hücrenin hepsinde altı bitişik hücre vardır, bu da bu hücrelerin bir petek paketleme organizasyonunda düzenlendiğini düşündürmektedir (Şekil 8). Buna karşılık, 10 hücreden sekizi (hücrelerin %80'i) görüntü 2'de hücrelerin düzensiz bir şekilde paketlendiğini gösteren altı bitişik hücreye sahiptir (Şekil 8).

Son olarak, lif hücre genişliğini ölçmek için, rodamin-falloidin ile etiketlenmiş sabit vahşi tip lenslerde dayanak noktasından ~10 μm içeriye doğru yerleştirilmiş periferik lif hücreleri incelendi (Şekil 9A)2,4. Dikkat çekici bir şekilde, canlı tdTomato fareleri kullanarak lif hücre genişliklerini ölçmek de mümkündür, ancak tdTomato için heterozigot olan lenslerden gelen sinyal ekvator bölgelerinde zayıf olma eğilimindedir. Bu nedenle, daha güçlü floresansa sahip oldukları (gösterilmemiştir) bulunduğundan, tdTomato için homozigot olan farelerin kullanılması önerilir. Çizgi tarama analizi kullanılarak F-aktin ile boyanmış hücre sınırları arasındaki mesafe, lif hücresi genişliği 2,4'ü belirtmek için daha önce tarif edildiği gibi ölçülmüştür (Şekil 9B). Bu analiz, vahşi tip lenslerde ortalama tepe mesafesinin 11.45 ± 2.11 μm olduğunu ortaya koymuştur (4 farklı fare lensi görüntüsünden N=117 fiber hücre, Şekil 9B).

Figure 1
Şekil 1: Görüntüleme sırasında lensi hareketsiz hale getirmek için agaroz divot oluşturma adımları. (A) Bir cam tabanlı tabak kullanarak, pipetle sıvılaştırılmış %2 agaroz. (B) Esnek bir kapak kızağı ile düzleştirin ve (C) soğuduğunda ince uçlu forseps kullanarak çıkarın. (D) Divot için 3 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanarak bir delik açın. (E) Kalan agaroları aspire edin, PBS ile durulayın, tüy bırakmayan bir mendil kullanarak yüzeyi silerek temizleyin. (F) Tüm lensi dikkatlice divot içine monte edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Lens ekvatoryal epitel ve lif hücrelerini görüntülemek için agaroz divot oluşturma adımları. (A) Doku kültürü kabına %2 erimiş agaroz dökün. (B) Agarozu tamamen katılaşana kadar oda sıcaklığında soğutun. (C) Keskin bir bıçakla üçgen bir divot oluşturun. (D) Doku kültürü kabına 1 mL 1x PBS koyun. (E) Kesilen merceği, (F) mercek ekvatoruna yaslanmış agaroz duvarları arasına sıkışmış olarak kamaya yerleştirin (kırmızı ok). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Lens kapsülü kalınlığının belirlenmesi. (A) canlı ve (B) sabit lens kapsüllerinin konfokal z-yığınlarının rekonstrüksiyonlarından sagital (X, Z düzlemi görünümü) optik kesitler. (C) canlı ve (D) sabit lenslerin çizgi taramasının floresan yoğunluğu, kapsülün üst yüzeyine ve kapsüle bitişik epitel hücrelerinin (kırmızı) bazal bölgesine karşılık gelen tek bir WGA (yeşil) tepe noktası gösterir. Kapsül kalınlığını ölçmek için iki tepe noktası arasındaki mesafe ölçülür. tdTomato/Rhodamine-Phalloidin ve WGA kanallarında sırasıyla 1,0 μm ve 1,2 μm'lik optik kesitlerle sonuçlanan 1 havadar birim iğne deliğine sahip 40x yağ objektifi kullanılarak elde edilen görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Epitel hücre alanının nicelleştirilmesi. (A) X, Hücre zarları için (B) tdTomato ve çekirdekler için (C) Hoechst ile işaretlenmiş lens epitel hücrelerinin Z düzlemi görünümü. (D) Lens epitel hücrelerinin orta bölgesinin X, Y düzlemi görünümü. (E) tdTomato sinyali, odakta olan bir hücre grubuna karşılık gelen bir ilgi alanını tanımlamak için bir kılavuz olarak kullanılır. (F) Tanımlanan bölgenin alanı belirlenir. (G) Çekirdekler için Hoechst boyama, tanımlanan bölgedeki hücre sayısını belirlemek için kullanılır. (H) Çekirdek sayısı, (I) FIJI ImageJ'nin çok noktalı aracı kullanılarak sayılır. Ortalama hücre alanını hesaplamak için, tanımlanan ilgilenilen bölgenin toplam alanını toplam hücre sayısına bölün. Hoechst ve tdTomato kanallarında sırasıyla 0,7 μm ve 1,0 μm'lik optik kesitlerle sonuçlanan 1 havadar birim iğne deliğine sahip 63x yağ objektifi kullanılarak elde edilen görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Nükleer alan ve şeklin belirlenmesi. (A) Çekirdeğin orta bölgesinin XY düzlemi görünümü. (B) Çekirdeklerin odakta olduğu bir ilgi alanı tanımlanmıştır. ROI içindeki çekirdekler ana hatlarıyla belirtilmiştir. (C) Tek tek hücrelerin çekirdeklerinin alanı ve daireselliği tablo haline getirildi ve alan ve dairesellik ortalamaları hesaplandı. Hoechst kanalında 0,7 μm'lik bir optik kesitle sonuçlanan 1 havadar birim iğne deliğine sahip 63x yağ objektifi kullanılarak elde edilen görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Lens dayanak noktasının tanımlanması. F-aktin ve çekirdekler, dayanak noktası ve meridyen sıralarını tanımlamak için kullanılabilir. (A) XZ görünümü, dayanak noktasına karşılık gelen F-aktin için zenginleştirilmiş falloidin boyamasını gösterir. (B) Lens dayanağı odakta olan tek optik XY düzlemi görüntüleme bölümü. Çekirdekler için Hoechst boyama, dayanak noktasının üzerindeki çekirdeklerin düzensiz bir şekilde paketlendiğini, dayanak noktasının altındaki çekirdeklerin ise tam olarak hizalandığını gösterir (Sağ üst). F-aktin için falloidin boyama, dayanak noktasının üstündeki hücrelerin düzensiz şekilli olduğunu, dayanak noktasının altındaki hücrelerin ise paralel sıralar halinde paketlendiğini gösterir (Sol alt). Kırmızı kesikli çizgi, dayanak noktasının yerini gösterir. Hoechst, Rhodamine-Phalloidin ve WGA-640 kanallarında sırasıyla 1,5 μm, 2,0 μm ve 2,2 μm'lik optik kesitlerle sonuçlanan 1 havadar birim iğne deliğine sahip 20x objektif kullanılarak elde edilen görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Meridyen sıra bozukluğunun belirlenmesi. (A) Tek XY düzlemi, vahşi tip ve NMIIAE1841K/E1841K meridyen sıra hücrelerinin optik bölümü, dayanak noktasından ~5 μm uzakta (lens kapsülüne doğru). Tüm meridyen sıra hücreleri, nükleer hizalamaya dayalı olarak mavi renkle özetlenmiştir. Wildtype lenste F-aktin (kırmızı) boyama, meridyen sıra hücrelerinin herhangi bir bozukluk belirtisi göstermeden (%0) tam olarak hizalandığını gösterir. Wildtype'da temsili bir sıralı bölge ana hatlarıyla belirtilmiştir (turuncu). Düzensiz hücreli lenslerde, düzensiz bölgeleri (sarı) ana hatlarıyla belirtiriz. (B) Wildtype'dan sıralı bölgenin yüksek büyütmesi (A'da turuncu kutu). (C) (I) sıraların dallanması, (II) düzensiz hücre şekli ve petek ambalajının kaybı ve (III) sıraların yanlış hizalanması dahil olmak üzere farklı bozukluk türlerini gösteren düzensiz alanların yüksek büyütmesi. NMIIAE1841K/E1841K lensten alınan görüntülerde %15.3 meridyen sıra hücre bozukluğu görülmektedir. Hoechst ve Rhodamine-Phalloidin kanallarında sırasıyla 1,5 μm ve 2,0 μm'lik optik kesitlerle sonuçlanan 1 havadar birim iğne deliğine sahip 20x objektif kullanılarak elde edilen görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Lens meridyonel sıra hücreli petek ambalajının analizi. (A) F-aktin için rodamin-falloidin ile boyanmış meridyen sıra hücrelerinin tek optik XY kesitleri. Düşük büyütmeli görüntüler (Üst panel), değerlendirilen hücreleri gösterir (pembe ile numaralandırılmıştır). Sarı renkle özetlenen bölge büyütülür (Alt panel). Sarı roma rakamları, bitişik hücrelerin sayısıdır. Resim 1, her biri 6 bitişik hücreye sahip, altıgen şeklinde olan hücreleri göstermektedir. Resim 2'de sırasıyla 5 ve 7 bitişik hücreye sahip 1 ve 5 numaralı hücrelerde düzensizlikler vardır. (B) Veriler, hesaplanan altıgen hücrelerin yüzdesi ile kaydedilir ve tablo haline getirilir. Rhodamine-Phalloidin kanalında 1,0 μm'lik bir optik kesitle sonuçlanan 1 havadar birim iğne deliğine sahip 40x objektif kullanılarak elde edilen görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Fiber hücre genişliklerinin analizi. (A) Dayanak noktasından ~10 μm içerideki lens fiber hücrelerinin tek optik XY görünüm bölümü. Hücre zarlarında F-aktin görselleştirmesi için hücreler rodamin-falloidin ile boyandı. Bir dizi fiber hücrenin üzerine bir çizgi (pembe; çizgi) çizilir. (B) Mesafenin bir fonksiyonu olarak F-aktin yoğunluklarının temsili çizgi taraması. Tepe arası mesafe, lif hücresi genişliğini temsil eder. Rhodamine-Phalloidin kanallarında 1,0 μm'lik bir optik kesitle sonuçlanan 1 havadar birim iğne deliğine sahip 40x objektif kullanılarak elde edilen görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan protokoller, lensin ön ve ekvator bölgelerindeki periferik lens yapılarının ve hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar. Bu çalışmada, genel 3D lens mimarisinin korunduğu sağlam (canlı veya sabit) lensler kullanılarak lens çevre yapılarının görüntülenmesine yönelik yöntemler gösterilmiştir. Ek olarak, halka açık FIJI ImageJ yazılımı kullanılarak morfometrik kantitatif analiz için basit yöntemler sağlanmıştır. Tüm montaj görselleştirme ve miktar tayini yöntemleri önceki çalışmalarda kullanılmıştır. Bu yöntemler, ön kapsül ve hücrelerin lens şekli değişikliğine veya yaşlanmaya tepkisini anlamamızı sağladı 2,4. Bu yöntemler aynı zamanda lens şekli değişikliği veya yaşlanma 2,4 nedeniyle ekvatoral lif hücresi genişlemesini incelemek ve NMIIA'nın kesin altıgen şekiller ve periferik lif hücre organizasyonu oluşturmadaki rolünü belirlemek için kullanılmıştır20.

Tam montajlı görüntüleme, lens yapısının yüksek uzamsal çözünürlüklü ve yüz görüntülemesine olanak tanır. Ön lens bölgesinde, kapsül yapısı bütünlüğünü ve/veya epitelyal hücresel morfolojiyi değiştirebilecek hasarı önleyerek tam montajlı görüntüleme, düz montajlı görüntülemeye göre avantajlıdır. Ek olarak, epitel ve lif hücreleri arasındaki arayüz korunur. Bu yöntem, lens bölümlerinin görselleştirilmesine göre avantajlar sağlar, çünkü en yüz görüntüleme daha fazla uzamsal çözünürlük sağlar ve epitel hücre alanının ve nükleer alanın/seçilen bölgenin (yani, burada gösterildiği gibi orta-lateral) veya hücrelerin diğer bölgelerinin analizine izin verir. Ayrıca, görüntüleme yöntemleri, merceğin ekvator bölgeleri boyunca belirli noktalardaki morfolojik özelliklerin ölçülmesine izin vererek, altıgen şekillerin, meridyen sıralı hücre paketlemesinin, dayanak noktasının ve fiber hücre genişliklerinin görselleştirilmesini sağlar, bu da kesitleme sırasında meydana gelebilecek uzamsal çözünürlük eksikliği ve doku distorsiyonu nedeniyle görüntüleme ile boyanmış lens kesitleri ile kolayca elde edilemez.

Ana hatlarıyla belirtilen protokoller, zaman içinde belirli lens yapılarını ve hücrelerini izlemek için canlı lenslerin görüntülenmesine de izin verir. Canlı lens görüntüleme protokolü, lens düzleşmesini indüklemek için lens sıkıştırmasından önce ve sonra aynı lensten alınan bir hücre alt popülasyonundan kapsül kalınlığı ve epitel hücre alanının tekrarlanan ölçümlerinin analizinin yapıldığı önceki bir çalışmada etkiliydi4. Lens sıkışmasının kapsül kalınlığında azalmaya ve epitel hücre alanında artışa neden olduğu belirlendi. Tek tek lensler arasındaki kapsül kalınlığı ve epitel hücre alanındaki önemli farklılıklar ve lens sıkıştırmasının neden olduğu bu parametreler üzerindeki etkilerin büyüklüğü nedeniyle, bağımsız bir ölçüm tasarımı kullanılsaydı farklılıkları tespit etmek zor olurdu (yani, tek tek sıkıştırılmamış lenslerin tek tek sıkıştırılmış lenslerle karşılaştırılması). Canlı görüntüleme yöntemleri kullanılarak, canlı epitel hücrelerinde F-aktin reorganizasyonunun izlenmesini sağlayan epitel hücrelerinde22 F-aktini görselleştirmek için LifeACT-GFP26'yı endojen olarak eksprese eden canlı fare lensleri üzerinde tam montajlı görüntüleme yapılmıştır.

Ana hatlarıyla belirtilen protokoller fare lenslerini görüntülemek için geliştirilmiş ve diğer türlerdeki lens yapılarını görselleştirmek için uyarlanabilirken, boyama protokolleri diğer kemirgen lenslerinde (sıçan, kobay) ve diğer memeli lenslerinde (, makak ve insan; veriler gösterilmemiştir) lensin hem ön hem de ekvatoral periferik yapılarını görselleştirmek için tasarlanmıştır. Daha büyük lenslerde yapıların görselleştirilmesi daha uzun fiksasyon (%4 PFA, buz üzerinde, 4 saat), blokaj (1 saat) ve boyama (gece boyunca, 4 °C) gerektirir. Farklı türlerde görüntüleme sadece sabit lenslerde yapıldı. Canlı görüntüleme protokolü, florojenik proteinleri eksprese eden transgenik farelerden alınan lensleri kullandığından, diğer türlerden alınan lenslerin canlı görüntülenmesi zor olabilir. Bu nedenle, bu görüntüleme, genetik modifikasyonların yaygın olmadığı diğer türlerin görüntüleme lenslerini engelleyebilir. Bununla birlikte, fare lenslerini sırasıyla lipofilik prob, FM4-64 veya bir F-aktin bağlayıcı prob, SiR-Jasplakinolide (SiR-aktin) ile önceden boyayarak lens epitel hücre zarlarının veya F-aktinin canlı görselleştirmesini gerçekleştirebildik (gösterilmemiştir). Diğer türlerin canlı lenslerini görüntülemek için bu tür probları kullanmak mümkün olabilir. Bununla birlikte, hedef dışı etkilerden kaçınmak için bu tür probları kullanırken dikkatli olunmalıdır; örneğin, SiR-Jasplakinolide, F-aktin dinamiklerinindeğişmesine yol açabilir 27. Boyama yöntemlerinin bir başka sınırlaması, ister canlı ister sabit lenslerde olsun, bu tür probların sınırlı penetrasyona sahip olmasıdır. Bu nedenle görüntüleme periferik bölgelerle sınırlıdır. Yine florojenik proteinlerin transgenik ekspresyonuna dayanan tdTomato transgenik fareleri4'ten elde edilen lensleri kullanarak iç bölgeleri (yani derin lif hücrelerini) görüntülemek mümkündür. İfade ayrıca derin lif hücrelerinde parlak sinyaller için yeterince yüksek olmalıdır.

Bununla birlikte, özetlenen protokoller periferik lens özelliklerinin etkili morfolojik kantitasyonunu sağlamıştır 2,4,20. Niceleme metodolojileri etkilidir ve açık kaynaklı, halka açık FIJI ImageJ yazılımını kullanır. İlgilenilen bölgeleri belirlemek için manuel izleme araçları kullanılırken, ilgilenilen bölgelerin tanımlanmasını otomatikleştirmek mümkün olabilir. Otomasyon, belirli yapıların (yani çekirdek sınırları) FIJI ImageJ tabanlı tanımlanması için kontrastı artırmak için floresan eşikleme uygulamak veya hücre şekli farklılıklarını (yani düzensiz epitel veya lif hücre şekilleri) tespit etmek için daha karmaşık makine öğrenimi algoritmaları uygulamak kadar basit olabilir. Daha karmaşık analizler, özel eklentiler veya görüntüleme yazılımı gerektirebilir. Özel eklentiler veya yazılımlar, elde edilen z-yığınlarından 3B hacimsel morfolojik ölçümlerin elde edilmesine de izin verebilir. Genel olarak, açıklanan niceleme yöntemleri kolayca erişilebilir, uygun maliyetli ve birçok yararlı sonuç ölçütü için uygun olsa da 2,4,20, görüntüleme protokolü platformu, karmaşık yazılım analizi ile birlikte, gelecekteki çalışmalar için çok sayıda ek morfolojik ölçüm sağlayabilir.

Lens, hücrelerin ve bunlarla ilişkili yapıların konumuna ve derinliğe bağlı geometrilerine dayanan özel işlevlere sahip karmaşık bir biyolojik dokudur. Burada gösterilen görüntüleme protokollerinin ve niceleme yöntemlerinin kullanılması, lens yapılarının ve lensin karmaşık organizasyonunun nasıl kurulduğunun daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Ayrıca, görüntüleme protokolleri ve kantifikasyon yöntemleri, lens yapısı ve işlevleri arasındaki ilişkileri tanımlamaya yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, CC'ye EY032056 Ulusal Göz Enstitüsü Hibe R01 ve VMF'ye EY017724 R01'in yanı sıra P20GM139760 numaralı hibe numarası altında Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. S.T.I, Kimya-Biyoloji Arayüzü doktora öncesi eğitim programının bir parçası olarak NIH-NIGMS T32-GM133395 ve Delaware Üniversitesi Lisansüstü Akademisyenler Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Biopsy Punch Acuderm Inc NC9084780
Agarose Apex BioResearch Products 20-102GP
Antimycotic/Antibiotic Cytiva SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Prometheus 25-529
Delicate task wipes Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish) World Precision International FD35-100
Hoescht 33342 Biotium 40046
Laser scanning confocal Microscope 880 Zeiss
MatTek Imaging Dish MatTek Life Sciences P35G-1.5-14
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 100503-917
PBS GenClone 25-507B
Phenol red-free medium 199 Gibco 11043023
Rhodamine-Phalloidin Thermo Fisher 00027
Triton X100 Sigma-Aldrich 11332481001
WGA-640 Biotium CF 640R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Tags

Biyoloji Sayı 203
Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., … More

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., Fowler, V. M., Cheng, C., Parreno, J. Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization. J. Vis. Exp. (203), e66017, doi:10.3791/66017 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter