متعلق بالخلايا العصبية الثقافات الأساسي من الأمخاخ في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة شرانق

Summary

هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من العقول في وقت متأخر من مرحلة الشرانق ذبابة الفاكهة. آراء الثقافات الحية تظهر ثمرة neurite والتصوير باستخدام مستويات الكالسيوم Fura - 2.

Abstract

في هذا الفيديو ، ونبدي استعدادا للثقافات العصبية الأولية من العقول في وقت متأخر من مرحلة الشرانق ذبابة الفاكهة. يبدأ الإجراء مع إزالة العقول من الحيوانات في 70-78 ساعة بعد تشكيل puparium. وأظهرت أدمغة معزولة بعد حضانة قصيرة في غراء تليها يغسل عدة في وسط النمو المصل الحرة. ويتضح من عملية التفكك الميكانيكي للدماغ في كل قطرة 5 المجاهدين من وسائل الإعلام على ساترة. وعلى المحاور sheered و dendrites من الخلايا العصبية في مرحلة ما بعد الإنقسامية قبالة قرب سوما خلال تفارق ولكن تبدأ الخلايا العصبية لتجديد العمليات في غضون ساعات قليلة من الطلاء. تظهر الصور الثقافات تعيش في 2 يوما. الخلايا العصبية مواصلة تطويرها العمليات خلال الأسبوع الأول في مجال الثقافة. يمكن التعرف على السكان العصبية المحددة في الثقافة GAL4 باستخدام خطوط لمحرك التعبير أنسجة معينة من علامات الفلورسنت مثل GFP أو طلب تقديم العروض. وقد أظهرت التسجيلات خلية كاملة من الخلايا العصبية مثقف شكل وظيفي ونشطة بشكل تلقائي والمشابك كوليني GABAergic. قطعة شريط فيديو قصير يوضح ديناميات الكالسيوم في الخلايا العصبية مثقف باستخدام Fura - 2 باعتبارها الكالسيوم صبغ المؤشر لمراقبة العابرين الكالسيوم عفوية والنيكوتين أثار ردود الكالسيوم في طبق من الخلايا العصبية مثقف. هذه الثقافات الدماغ العذراء هي نظام نموذجا مفيدا يمكن من خلالها استخدام أدوات والدوائية الجينية لتحديد العوامل الجوهرية التي تؤثر على وخارجي تشكيل وظيفة نقاط الاشتباك العصبي المركزي.

Protocol

الاستعدادات قبل يوم من زراعة :

1. جعل تشريح محلول معقم.
2. جعل DMEM معقمة والاحتفاظ بها في 10 مل aliquots في 4 أسابيع لمدة 2 درجة مئوية.
3. جعل العقيمة DDM2 ملاحق وتجميد في 50 أو 100 aliquots ميكرولتر : 1 الشهر.
4. جعل كونا / laminin.
5. معطف coverslips.
   اختياري : قم CNBM العقيمة وتخزينها مجمدة لمدة تصل إلى 4 أشهر.

في يوم من زراعة

أولا تحضير محلول أنزيم (ES) في غطاء تدفق الصفحي

1. وضع 5 مل من تشريح الحل (DS) في أنبوب 15 مل الطرد المركزي.
2. تزن 0،8 ملغ من سيستين - L في إيبندورف 0.6 مل وإضافة 150 ميكرولتر من DS. ماصة صعودا ونزولا حتى تختفي البلورات.
3. إضافة 150 مل من DS / DS سيستين إلى 5 مل وتخلط جيدا.
4. إضافة 50 يو (وحدة) من غراء.
5. إضافة 7 مل من 0.1 OH نا N وتخلط جيدا. سيكون حل واضح في غضون 30 دقيقة. عندما يتم تنشيطها.
6. حل تصفية الانزيم مع 0.2 ملم تصفية المحاقن المعقمة إلى 1.5 مل المسمار سقف أنبوب microfuge
   
   غراء : هل ترغب في يو 50 س 5 مل. كل دفعة يختلف قليلا ، لذلك يجب حساب مقدار :
   37.3 ملغ / مل و 28.3 U / ملغ
   37.3 X 28.3 = 1055.59 يو / مل (1000 مل)
   50 U = 47.4 مل
   

II. جعل وسائل الاعلام DDM2

في يوم من زراعة : إضافة المكملات التالية لإجراء DDM2

إلى 10 مل من DMEM إضافة ملاحق ، وقبل زراعة :

1. 100μl ترانسفيرين
2. 100μl بوتريسين
3. 100μl السيلينيوم
4. 100μl البروجسترون
5. 50μl الأنسولين
6. 10μl 20 Hydroxyecdysone

ملاحظة : تحقق ما يكفي لجميع الثقافات DDM2 المخططة (كل الدماغ مطلي على ساترة واحد في الفردي 35 مم طبق بتري ، 1.5 مللي ثانية من وسائل الإعلام / ثقافة)

الخطوة يمكن أن تكون من الثالث إلى السادس في المختبرات nonsterile القيام به ، وينبغي أن يكتمل في 45 دقيقة أو أقل.

III. كوكتيل الشرانق

1. حدد 10-15 الشرانق من الجانبين من قارورة تشريح تحت المجهر.
2. الشرانق في مكان غطاء جافة 35 مم طبق بتري.

ملاحظة : نحن نستخدم العقل عموما من الشرانق ما بين 55-78 ساعة بعد تشكيل puparium (APF). يصعب قليلا إلى خارج تشريح الدماغ من الشرانق الاصغر منذ كبسولات رئيس تميل إلى الانهيار ، في حين أن المستوى العام للثمرة neurite أقل قليلا من أقدم الشرانق. في سلالة wildtype كانتون - S ، يتم التعرف على هذه المراحل من قبل عيون الصباغية التي البني الفاتح إلى الحمرة قليلا ، قليلا مع الصباغ في أماكن أخرى.

رابعا. قطع الرأس تحت مجهر تشريح

1. مكان قطرتين من محلول معقم في تشريح غطاء صحن بيتري ، بجانب الشرانق.
2. عقد بلطف خادرة واحدة مع غرامة ملقط في اليد اليسرى واستخدام حقنة قياس 27 إبرة تعلق على حقنة سم مكعب 1 في اليد اليمنى لإزالة إهاب في نهاية الأمامي للخادرة.
3. خادرة الضغط قليلا مع ملقط ورئيسا تبرز استخدام إبرة قياس 27 الى قطع العنق.
4. مع غيض من إبرة أو الملقط ، ونقل رأسه إلى قطرة من تشريح الحل.
5. كرر حتى يكون لديك رؤساء 10-15 في قطرة واحدة.

خامسا إزالة المخ من الرأس تحت مجهر تشريح

1. في كل ناحية عقد حقنة سم مكعب 1 مع إبرة قياس 27.
2. استخدام هذه لموقف رئيس الطيران في قطرة من تشريح حل حتى خرطوم باتجاهك والسطح الظهري للرأس والشمال.
3. ادخال الإبرة اليسار في خرطوم لدبوس رئيس لأسفل واستعمال إبرة الحق في إجراء شق في العين اليمنى التي تذهب من بطني إلى السطح الظهري.
4. ادخال الإبرة بالقرب من حق اليسار في منطقة خرطوم ثم استخدام الإبرة اليسار إلى خفض بلطف إهاب على العين اليسرى ، مما دفع الدماغ تجاه فتحة في العين اليمنى. وينبغي أن الدماغ الخروج من فتحة على اليمين ، سليمة نسبيا ، وغالبا مع كل من لو البصريةبيز لا تزال تعلق وأحيانا مصطبغة نسيج العين أيضا.
5. دفع الدماغ على الجزء الخلفي من الإبرة ونقل إلى قطرة من المياه المالحة عقيمة في تشريح جديدة معقمة ، 35 طبق بيتري ملم.
6. جمع 10-15 العقول لكل الوراثي.
   

سادسا. إزالة الفص البصري والعلاج الانزيم

1. في كل ناحية عقد حقنة سم مكعب 1 مع إبرة قياس 27 و استخدامها لجمع كل هذه العقول في منطقة واحدة صغيرة من قطرة من حل تشريح
2. استخدام المحاقن وأدوات القطع لإزالة الفص البصري في الدماغ من كل ذلك النسيج المتبقية للثقافة هي المنطقة المركزية في الدماغ.
3. استخدام pipetman 20 ميكرولتر ، التي حددت في 5 ميكرولتر ، لنقل كل العقول من النمط الجيني واحد لأنبوب إيبندورف تحتوي على 1 مل من محلول غراء العقيمة.
4. أدمغة المحتضنة في غراء لمدة 10-15 دقيقة على مجموعة المدورة في 60 دورة في الدقيقة.
5. أجهزة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق.
   

معقمة داخل غطاء تدفق الصفحي -- ينبغي لجميع الخطوات التي تعرض الأنسجة للهواء ينبغي القيام به في التدفق الصفحي غطاء لتنفيذ الخطوات المتبقية.

سابعا. غسل

1. إزالة حل ويحل محل الانزيم مع محلول معقم تشريح.
2. أجهزة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق.
3. يغسل مع محلول معقم تشريح ما مجموعه 3 مرات.
4. إزالة الملوحة تشريح واستبدالها مع DDM2.
5. أجهزة الطرد المركزي ، ويغسل ما مجموعه 2 مرات مع DDM2.
6. نقل العقول وسائل الإعلام إلى العقيمة 35 مم طبق بتري.
   

ثامنا. سحن والتصفيحات تشريح تحت المجهر

1. 5 المكان المقدس من DDM2 في وسط ساترة.
2. 1 نقل الدماغ لهذا الانخفاض من DDM2 مع طرف الصفراء.
3. تحت المجهر ، واستخدام إبر عيار 27 إلى النرد يصل الدماغ الى قطع صغيرة (وينبغي أن تتخذ <1 دقيقة).
4. تحت التوجيه البصري ، وكسر غيض من الزجاج الماصة التي تم سحبها إلى نقطة دقيقة بحيث يمكن أن تكون أكبر قطعة امتص برفق في غيض من الماصة وطرد مرة أخرى في المتوسط. نستخدم أنابيب شفط الفم القياسية التي تأتي مع 100 ميكرولتر الهيماتوكريت الزجاج الشعرية.
   
   ملاحظة : احرص على عدم الحصول على فقاعات في وسائل الإعلام ، وسوف تحتاج إلى تحديد تجريبيا الماصة أفضل حجم الاستخدام. الجيدة منها تسمح لك فصل المخ مع بعض الخلايا الفردية ومازال بعض كتل كبيرة ، في حوالي 30 ثانية / الدماغ. عندما تنظر إلى هذه في أعلى السلطة ، وينبغي أن حوالي 10-20 ٪ من الخلايا العصبية لا تزال بعض العمليات المتبقية ، وستظل هناك بعض كتل كبيرة. إذا كنت تنأى كثيرا ، وبعد ذلك سوف تكون جميع الخلايا المستديرة وسيكون لديهم الكثير لحقت بها أضرار أنهم لن يكتب له البقاء. هذه الخطوة تأخذ الممارسة ويجب أن يتم بسرعة لأن هناك عدد كبير السطحية إلى نسبة حجم ودرجة الحموضة والأسمولية من قطرة DDM2 يمكن أن تتغير بسرعة. الأنسجة يحتاج إلى أن يوضع في الحاضنة CO ₂ في أسرع وقت ممكن.
   
   
5. الكتابة على الغطاء طبق بيتري : "الوراثي ، والتاريخ والوقت".
6. وضع طبق بتري 35 ملم في طبق بتري مم 100 (مع kimwipe الرطب) والسماح للتسوية في الحاضنة CO ₂ لمدة 30 دقيقة.
7. الفيضانات الطبق 35 ملم مع 1.5 مل من DDM2.
8. إبقاء الثقافات في الحاضنة في 5 ٪ CO ₂ الحاضنة (23 درجة مئوية).
   
   ملاحظة : إذا لم يكن لديك الوصول إلى حاضنة CO ₂ التبريد ، واستخدام معيار الثقافة أنسجة الثدييات الحاضنة وضعت إما في غرفة باردة والحرارة إلى 23 درجة مئوية ، أو وضعها في المختبر ، إيقاف مؤقت ، واستخدام الجليد في صينية في أسفل الحاضنة لتنظيم درجة الحرارة في جميع أنحاء الغرفة.
   

تاسعا. تغذية الخلايا

1. يوم 1 (اليوم التالي) ، إضافة 0.5 مل من CNBM/B27 (وسائل الإعلام مشروطة) لجعل 03:01 DDM2 : CNBM/B27.
2. في يوم 5 1 مل تحل محل وسائل الاعلام لل03:01 DDM2 : CNBM/B27.
3. مع إبقاء خلايا التغذية 03:01 DDM2 : CNBM/B27 كل 4-5 أيام.
   
   ملاحظة : يمكن زراعتها دون الثقافات وسائل الإعلام غير مشروطة ولكن العصبية الخلايا العصبية يبدو قليلا أكثر هشاشة وأكثر صعوبة لاستخدامها في تجارب الكهربية.

Discussion

يمكن زراعة الخلايا العصبية التي تحصد من أدمغة الفئران الجنينية / ما بعد الولادة في الثقافة الخلية الأولية حيث تمتد neurites اتصالات وشكل متشابك وظيفية. هي راسخة طرق تحضير هذه الثقافات والدراسات في ثقافات القوارض العصبية لعبت دورا حاسما في تحديد الجينات والعوامل البيئية المتورطين في التنظيم وتشكيل المشبك وظيفة (وGoslin بانكر ، 1991). بينما يمكن أيضا أن الخلايا العصبية للحشرات من مختلف الأنواع يمكن زراعتها في الثقافة ، فإن الخلايا العصبية فقط الحشرات تظهر لتشكيل اتصالات متشابك وظيفية في مجال الثقافة هي من ذبابة الفاكهة (Rohrbough وآخرون ، 2003). Neuroblasts حصاد منتصف مرحلة المعيدة أجنة ذبابة الفاكهة التي تزرع في وسائل الإعلام المعرفة تؤدي إلى الخلايا العصبية التي يتم كهربائيا منفعل والشكل ، interneuronal الفنية اتصالات متشابك (O'Dowd ، 1995 ؛ لي وO'Dowd ، 1999). للتعرف على العوامل التي تنظم شكل متشابك وظيفة في الخلايا العصبية يعرف أن تشارك في التوسط في السلوكيات الكبار قمنا بتطوير تقنية هو موضح في هذا الفيديو لزراعة الخلايا العصبية من الحصاد والعقول في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة (سو وO'Dowd ، 2003). كانت واحدة من السمات الرئيسية لهذا الإجراء لاستخدام غراء ، بدلا من الانزيمات كولاجيناز أو القاسية الأخرى المستخدمة تقليديا في إعداد الثقافات العصبية للحشرات. غراء النتائج في فصل الخلايا العصبية الاحتفاظ العمليات محواري القصيرة التي البقاء على قيد الحياة ، تجديد العمليات لالتهاب الأعصاب ، وشكل وظيفي اتصالات متشابك interneuronal. تسجيلات كاملة في الخلية التي تم تحديدها من السكان ، بما في ذلك خلايا الجسم فطر كينيون ، وتبين أن انتقال سريع بوساطة متشابك مثير في الثقافات التي nAChRs بينما يتم تثبيط مستقبلات GABA بوساطة (سو وO'Dowd ، 2003). لدينا التحليل المجهري الإلكترون الأخيرة يدل على أن الخلايا العصبية في نقاط الاشتباك العصبي نموذج الثقافة مع السمات الهيكلية التي تشبه على حد سواء الكيميائية والكهربائية نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ الكبار (يا وآخرون ، 2007). كما هو موضح في الفيديو ، والثقافات هي أيضا قابلة لل- 2 Fura دراسات التصوير الكالسيوم وعلينا استخدام هذه الآليات لتحقيق التغيرات الخلوية الكامنة عفوية وأثار في مستويات الكالسيوم في الخلايا السكان الخلية التي تم تحديدها بما في ذلك الخلايا والخلايا العصبية كينيون كوليني (جيانغ وآخرون القاعدة ، 2005 ؛. Campusano وآخرون ، 2007). مع مجموعة من الأدوات الوراثية الواسعة المتاحة في هذا النظام ذبابة الفاكهة الثقافة يوفر أداة مفيدة جدا لتحديد المنظمين الجوهرية وخارجي للهيكل المشبك المركزية ، وظيفة ، واللدونة.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.