Microiniezione di cellule infermiere Drosophila: un metodo di consegna intracellulare

Overview

A causa delle loro grandi dimensioni e dell'organizzazione relativamente semplice, le cellule infermiere Drosophila sono ideali per gli studi di imaging di cellule vive. Questo video descrive un metodo di microiniezione per la consegna di composti esogeni nelle cellule, e il protocollo in primo piano dimostra la procedura con sonde oligonucleotidi fluorescenti chiamate fari molecolari (MB) utilizzati per visualizzare trascrizioni di mRNA endogeno.

Protocol

Questo protocollo è tratto da Catrina et al., Visualizzando e monitorando mRNA endogeni in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).

1. Progettazione di MB per l'imaging di cellule vive

1. Piegare la sequenza di RNA di destinazione per prevedere la struttura secondaria della destinazione dell'mRNA utilizzando la "forma RNA" dal server mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. Incollare/caricare la sequenza di destinazione in formato FASTA, selezionare il 5 o il 10% di sub-ottimalità (strutture con un'energia libera di piegatura entro rispettivamente il 5 o il 10% del valore MFE) e regolare di conseguenza il numero massimo di piegamenti calcolati (ad esempio più grandi per il 10% di non ottimalità).
      NOTA: L'inclusione di strutture secondarie non ottimali nella progettazione di MB consente l'identificazione di regioni all'interno dell'mRNA target che possono essere più flessibili o più rigide di quanto previsto solo per la struttura a energia libera minima (MFE), il che migliora la progettazione complessiva di MB adatti per l'imaging di cellule vive.
   2. Selezionare un "lavoro immediato" per bersagli di mRNA di 800 nucleotidi (nt) o un "processo batch" per lunghezze di mRNA tra 801 e 8.000 nt. Salvare il file "ss-count" come file di testo semplice.
2. Utilizzare il file "ss-count" ottenuto nel passaggio 1.1 come input per il programma PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) con i parametri desiderati, per progettare diversi MB per la destinazione dell'mRNA (vedere esercitazioni che descrivono l'utilizzo del programma PinMol a https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
   1. Determinare la specificità delle MB selezionate eseguendo l'analisi BLAST: utilizzare "blastn" con l'appositi database (ad esempio per gli MB specifici dell'MRNA di Oskar utilizzare il database "refseq-rna" e l'organismo Drosophila melanogaster).
   2. Identificare qualsiasi espressione specifica del tessuto del target di mRNA (ad esempio per oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray o modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) e confrontare con eventuali colpi BLAST positivi. Elimina le sonde che mostrano >50% di omologia incrociata con altri mRNA che sono espressi anche nel tessuto / cellula di interesse.
3. Selezionare la coppia di fluorofofori e quencher appropriata per la configurazione della microscopia disponibile per eseguire l'imaging a cellule vive (ad esempio Cy5/BHQ2).

2. Sintesi, purificazione e caratterizzazione MB

1. Utilizzare la sintesi e la purificazione internamente come descritto in precedenza in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006)o servizi di fornitori commerciali, per sintetizzare e purificare da uno a cinque MB (vedi nota sopra), utilizzando il seguente schema di etichettatura: [5'(Fluorophore)-(C3 o C6 linker)-(2'-O-sequenza MB metile)-(Quencher)3']. Purificare gli MB utilizzando HPLC in fase inversa, internamente o utilizzando i servizi del fornitore commerciale.
   NOTA: I fosforamiditi utilizzati per la sintesi automatica della sonda devono avere la modifica 2'-O-metil ribonucleotide. Si possono anche usare chimere di acido nucleico bloccato alternato (LNA) e 2'-O-metile modifiche per aumentare la stabilità di un ibrido tra un MB più corto e il suo mRNA bersaglio.
2. Sintetizzare oligonucleotidi di DNA che corrispondono alla sequenza della regione dell'RNA bersaglio e quindi sono complementari alla regione della sonda degli MB, per l'uso nella caratterizzazione in vitro (vedere i passaggi da 2.3 a 2.5; nota sopra). Massimizzare l'ibridazione dell'MB con l'imitazione del bersaglio DNA-oligonucleottide, includendo su ogni estremità del bersaglio del DNA quattro nucleotidi aggiuntivi, come si trova nella sequenza di mRNA bersaglio.
   NOTA: Una caratterizzazione più rigorosa dell'efficienza del MB per rilevare la sequenza mirata può essere eseguita utilizzando bersagli di RNA sintetizzati in vitro invece di oligonucleotidi del DNA complementari.
3. Eseguire la denaturazione termica del solo MB, misurarne la temperatura di fusione (Tm) e confermare che l'MB assume la forma del tornante desiderata a temperatura fisiologica. Abbiamo osservato valori Tm tra 60 e 90 °C.
4. Eseguire la denaturazione termica dell'MB in presenza del bersaglio oligonucleotide del DNA e misurare il Tm dell'ibrido bersaglio MB:DNA, come precedentemente descritto in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Si desidera un Tm compreso tra 55 e 60 °C per l'ibrido MB:DNA.
5. Eseguire reazioni di ibridazione in vitro con il corrispondente bersaglio oligonucleotide del DNA e determinare l'efficienza della formazione ibrida MB:DNA a temperatura fisiologica, come precedentemente descritto in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Si desidera una cinetica di ibridazione rapida con la mimica bersaglio del DNA, tuttavia gli MB che non mostrano un'elevata efficienza di ibridazione con bersagli di DNA possono avere prestazioni migliori con l'mRNA bersaglio in vitro e / o in vivo.

3. Dissezione e preparazione delle singole camere delle uova per la microiniezione

1. Nutrire le femmine appena schiuse e accoppiate per 2-3 giorni con pasta di lievito fresco.
2. L'anestetizza vola su un cuscinetto di CO₂ e, usando una pinzetta fine (Dumont #5), trasferisce 1-2 femmine in una goccia di olio di alocarbonio 700 su uno scivolo di copertura di vetro.
3. Usando un paio di pinzette, orientare la mosca con il lato dorsale verso l'alto sotto uno stereomicroscopio. Sezionare l'addome femminile facendo una piccola incisione all'estremità posteriore e spremere delicatamente il paio di ovaie nell'olio.
4. Espianta le ovaie su una goccia d'olio su un nuovo copripasci. Tenere delicatamente un'ovaia con una pinzetta mentre si pizzicano le fasi più giovani dell'ovariolo con l'altra pinzetta. oskar mRNA è attivamente localizzato a e dopo la metà dell'oogenesi (stadi > 7), e le camere delle uova più giovani (stadi < 7) sono più difficili da iniettare e non sopravvivono così a lungo. Trascinare lentamente sul coperchio scivolare (con un movimento verso il basso) fino a quando i singoli ovariole o camere d'uovo sono isolati e allineati verticalmente. Separare ulteriormente le singole camere delle uova spostando gli stadi indesiderati dalla catena delle uova ovariole.
   NOTA: Assicurarsi che le camere delle uova prese in giro individualmente non galleggino nell'olio e che aderiscano allo scivolo di copertura. Questo è importante sia per la microiniezione di successo che per l'acquisizione di immagini.

4. Microiniezione di MB nelle celle infermiere delle camere delle uova

1. Preparare la soluzione MB, utilizzando un faro molecolare (ad esempio osk2216Cy5), o un mix di due MB che prendono di mira mRNA diversi e che sono etichettati con fluorofori spettralmente distinti (ad esempio osk2216Cy5 e drongo1111Cy3). Utilizzare una concentrazione di 200-300 ng/μL ciascuna MB in HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1.5 mM MgCl₂ e 100 mM NaCl). Per un cocktail di quattro MB etichettati con lo stesso fluorofore che prendono di mira lo stesso mRNA a 200 ng/μL ciascuno in HybBuffer (ad esempio osk82, osk1236, osk2216). Far girare la soluzione MB immediatamente prima di caricare l'ago per la microiniezione.
2. Selezionare l'obiettivo. Si raccomanda un obiettivo di olio 40x per trovare una camera d'uovo appropriata e per eseguire la microiniezione.
3. Montare il coverslip con camera d'uovo sezionata sullo stadio del microscopio. Portare l'obiettivo nella posizione di messa a fuoco e identificare una camera d'uovo in una fase di sviluppo medio-tardiva, che è correttamente orientata per la microiniezione (cioè, con l'asse AàP perpendicolare alla punta dell'ago per consentire una facile iniezione all'interno di una cellula infermiera prossimale all'ovocita).
4. Caricare un ago (commerciale o preparato internamente) con una soluzione di ~1 μL MB (vedere fase 1.1) e collegarlo al microiniettore. Per le microiniezioni nelle camere d'uovo D. melanogaster, orientare l'ago (vedi Tabella dei materiali)con un angolo <45° allo stadio del microscopio (ad esempio 30°) per evitare di forare più cellule di infermiere.
5. Impostare l'iniettore con pressione di iniezione di 500-1.000 hPa e pressione di compensazione di 100-250 hPa (vedi Tabella dei materiali).
6. Spostare lentamente il palco per portare nel campo visivo un'area del vuoto di goccia d'olio delle camere delle uova.
7. Utilizzando il joystick del micromanipolatore, abbassare delicatamente l'ago nella goccia d'olio e mettere a fuoco la punta verso la periferia del campo visivo.
8. Eseguire una funzione "pulita" per rimuovere l'aria dalla punta dell'ago e per garantire che ci sia flusso dall'ago.
9. Portare l'ago nella posizione di casa e concentrarsi sulla camera delle uova da microiniettare, quindi riportare l'ago a fuoco e posizionarlo vicino al bordo della camera dell'uovo.
10. Eseguire una regolazione fine della posizione Z dell'obiettivo in modo che la membrana che separa le cellule follicolari dalle cellule dell'infermiere sia a fuoco.
11. Inserire l'ago in una cella di infermiera ed eseguire l'iniezione per 2-5 s.
12. Rimuovere delicatamente l'ago e ritrarlo nella posizione di casa.
13. Modificare l'obiettivo con l'ingrandimento desiderato per l'acquisizione dell'immagine (60-63x o 100x), concentrarsi sulla camera delle uova e iniziare l'acquisizione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing