嗜血性护士细胞的微注射：细胞内分娩方法

Overview

由于其体积大，组织相对简单 ，Drosophila 护士细胞非常适合活细胞成像研究。该视频描述了一种将外源化合物输送到细胞中的微注射方法，并采用了用于可视化内源性mRNA成绩单的荧光寡核苷酸探头的程序。

Protocol

本协议摘自卡特里娜等人，可视化和跟踪内源性mRNA在活的德罗索菲拉梅拉诺加斯特蛋室，J.维斯Exp。(2019).

1. 用于活细胞成像的 MB 设计

1. 折叠目标RNA序列，使用mfold服务器（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）中的"RNA形式"预测mRNA目标的次要结构。
   1. 以 FASTA 格式粘贴/上传目标序列，选择 5% 或 10% 的次优性（分别在 MFE 值的 5% 或 10% 范围内具有自由折叠能量的结构），并相应地调整计算折叠的最大次数（例如，大于 10% 的次优）。
      注： 在设计 MB 时，采用次优次要结构，可识别目标 mRNA 内的区域，这些区域可能比预测的最小自由能源 （MFE） 结构更灵活或更刚性，从而改进了适合活细胞成像的 MB 的总体设计。
   2. 为 800 核苷酸 （nt） 的 mRNA 目标选择"即时工作"，或为 801 至 8，000 nt 之间的 mRNA 长度选择"批量作业"。将"s-计数"文件保存为简单的文本文件。
2. 使用步骤 1.1 中获得的"ss-count"文件作为具有所需参数的 PinMol 程序（https://bratulab.wordpress.com/software/）的输入，为 mRNA 目标设计多个 MB（参见描述 pinMol 程序在 https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/的使用情况的教程）。
   1. 通过执行 BLAST 分析确定选定 MB 的特异性：使用具有相应数据库的"爆炸"（例如，对于使用"refseq-rna"数据库和褪黑莲酯有机体的oskar mRNA 特定 MBs）。
   2. 识别 mRNA 靶点的任何组织特定表达（例如 ，对于奥斯卡 mRNA 飞基+ 高通量表达数据» FlyAtlas 解剖微阵骨或模组代码解剖 RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015）并与任何积极的爆炸命中进行比较。消除显示 +50% 与其他 mRNA 的交叉同源的探头，这些探头也表示在感兴趣的组织/细胞中。
3. 选择适合用于执行活细胞成像的显微镜设置的氟化物和淬火对（例如 Cy5/BHQ2）。

2. MB 合成、纯化和特征化

1. 使用Bratu、分子生物学方法 （2006）或商业提供商的服务的内部合成和纯化，使用以下标记方案合成和纯化 1 到 5 MB（见上文说明）：[5'（氟磷）-（C3 或 C6 链接器）-（2'-O - 甲基MB 序列）-（昆彻）3']。使用反相 HPLC 在内部或使用商业提供商的服务净化 MB。
   注： 用于自动探头合成的磷酰胺必须具有2'-O-甲基核糖核苷酸修饰。人们还可以使用交替锁定核酸 （LNA） 和 2'-O- 甲基修饰的幻想，以提高较短的 MB 与其目标 mRNA 之间的混合的稳定性。
2. 合成与目标RNA区域序列相匹配的DNA寡核苷酸，因此与 MBs 的探针区域相辅相成，用于 体外 特征（见步骤 2.3 至 2.5;以上注释）。最大限度地混合MB与DNA-寡核苷酸目标模仿，通过包括在DNA目标的每一端四个额外的核苷酸，如在目标mRNA序列中发现。
   注： 使用体外合成RNA靶点而不是互补的DNA寡核苷酸，可以更严格地描述MB检测目标序列的效率。
3. 单独执行MB的热变性，测量其熔化温度（Tm），并确认MB在生理温度下假设所需的发夹形状。我们观察到 Tm 值在 60 到 90 °C 之间。
4. 在DNA寡核苷酸靶点存在的情况下进行MB的热变性，并测量MB：DNA靶点杂交的Tm，如《 分子生物学方法》（2006年）中先前描述的布拉图。MB：DNA 混合需要 55 至 60 °C 之间的 Tm。
5. 执行体外杂交反应与相应的DNA寡核苷酸目标，并确定MB：DNA混合形成在生理温度的效率，如之前在 布拉图，分子生物学方法（2006年）中描述。需要使用 DNA 目标模拟的快速杂交动力学，但是与 DNA 靶点不表现出高杂交效率的 MB 在体外和/或体内与目标 mRNA 的性能可能更好。

3. 微注射个体卵室的解剖和准备

1. 用新鲜酵母糊喂养新孵化、配对的女性2-3天。
2. 麻醉苍蝇在二氧化碳_垫 上，并使用细钳子（杜蒙#5），转移1-2女性到一滴卤碳油700玻璃盖滑。
3. 使用一对钳子，在立体显微镜下将苍蝇与后侧对齐。通过在后端做一个小切口来解剖女性腹部，并轻轻地将一对卵巢挤压到油中。
4. 将卵巢涂在新的盖片上的油滴上。用一个钳子轻轻握住一个卵巢，同时用另一个钳子捏掉卵巢最年轻的阶段。 oskar mRNA在中生代（阶段>7）和年轻的卵室（阶段>lt：7）是积极的本地化，更难注射，不能生存很长时间。慢慢拖动盖滑（向下运动），直到单独的卵泡或卵室被隔离并垂直对齐。通过从卵巢蛋链中取代不需要的阶段，进一步分离单个卵室。
   注： 确保单独调戏的蛋室不会漂浮在油中，并确保它们粘在盖滑上。这对成功的微投影和图像采集都很重要。

4. 将 MBs 微注入蛋室的护士牢房

1. 使用一个分子信标（如 osk2216Cy5）或两个 MB 的组合来准备 MB 解决方案，这些 MB 针对不同的 mRNA，并标有光谱上不同的氟磷（例如 osk2216Cy5 和 drongo1111Cy3）。在海布弗（50 mM 特里斯-HCl - pH 7.5、1.5 mm MgCl 2 和 100 mM NaCl）中使用每个 MB 的浓度为 200-300 ng/μL。对于在 HybBuffer （例如 osk82， osk1236， osk2216） 中分别以 200 ng/μL 的相同 mRNA 标记的四个 MB 的鸡尾酒。在加载针头进行微注射之前，立即旋转MB溶液。
2. 选择目标。建议为寻找合适的蛋室和进行微注射而实现 40 倍的油目标。
3. 将盖唇与解剖蛋室一起安装到显微镜舞台上。在焦点位置提出目标，并在中后期发育阶段识别卵室，该卵室正确定位为微注射（即 A =P 轴垂直于针尖，以便在靠近卵母细胞的护士细胞内轻松注射）。
4. 用 ~1 μL MB 溶液加载针头（在内部进行商业或准备），并将其连接到微注射器。对于 D. 梅拉诺加斯特 蛋室中的微注射，将针头（见 材料表）定向到显微镜阶段（如 30°），以避免刺穿多个护士细胞。
5. 设置注射器的注射压力为 500-1，000 hPa 和补偿压力为 100-250 hPa（参见 材料表）。
6. 慢慢移动舞台，在视野中带来一个区域的油滴空蛋室。
7. 使用微操纵器操纵杆，轻轻地将针头放入油滴中，使其尖端聚焦在视场的外围。
8. 执行"清洁"功能，从针尖取出空气，并确保针头有流动。
9. 将针头带到家庭位置，聚焦在蛋室进行微注射，然后将针头重新聚焦并放置在蛋室边缘附近。
10. 对目标的Z位置进行微调，使将毛囊细胞与护士细胞分离的膜成为焦点。
11. 将针头插入护士细胞，注射2-5次。
12. 轻轻取出针头，将其缩回主位置。
13. 将目标更改为图像采集所需的放大倍数（60-63 倍或 100 倍），专注于蛋室，并开始采集。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing