Drosophila 간호사 세포의 미세 주입: 세포 내 전달의 방법

Overview

그들의 큰 규모 및 상대적으로 간단한 조직 때문에, Drosophila 간호원 세포는 살아있는 세포 화상 진찰 연구 결과에 이상적으로 적합합니다. 이 비디오는 세포로 전달되는 외인성 화합물에 대한 미세 주입 방법을 설명하고, 특징적인 프로토콜은 내인성 mRNA 전사체를 시각화하는 데 사용되는 분자 비콘(MBs)에게 불린 형광 올리고뉴클레오티드 프로브를 가진 절차를 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 Catrina 외에서발췌, 시각화 및 라이브 Drosophila 멜라노가스터 계란 챔버에서 내생 mRNAs를 추적, J. Vis. Exp. (2019).

1. 라이브 세포 이미징을 위한 MB 설계

1. 표적 RNA 서열을 접어 mfold 서버(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)로부터"RNA 형태"를 사용하여 mRNA 표적의 이차 구조를 예측한다.
   1. FASTA 형식으로 대상 시퀀스를 붙여 /업로드하고, 5 또는 10 % 하위 최적 (MFE 값의 5 또는 10 % 이내접기의 자유 에너지구조)를 선택하고 그에 따라 계산 된 접이식의 최대 수를 조정합니다 (예 : 10 % 하위 최적).
      참고: MB를 설계할 때 최적 이하의 이차 구조를 포함하면 최소 자유 에너지(MFE) 구조에 대해 예측된 것보다 더 유연하거나 더 단단할 수 있는 표적 mRNA 내의 영역을 식별할 수 있어 라이브 셀 이미징에 적합한 MB의 전반적인 설계를 향상시킵니다.
   2. 800뉴클레오티드(nt)의 mRNA 표적에 대한 "즉각적인 작업"을 선택하거나 801에서 8,000nt 사이의 mRNA 길이에 대한 "배치 작업"을 선택한다. "ss-count" 파일을 간단한 텍스트 파일로 저장합니다.
2. 원하는 매개 변수와 함께 PinMol 프로그램(https://bratulab.wordpress.com/software/)에대한 입력으로 1.1단계에서 얻은 "ss-count" 파일을 사용하여 mRNA 대상에 대한 여러 MB를 설계합니다(https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ PinMol 프로그램의 사용을 설명하는 자습서 참조).
   1. BLAST 분석을 수행하여 선택된 MB의 특이성을 결정합니다: 적절한 데이터베이스와 함께 "blastn"을 사용하십시오(예를 들어, oskar mRNA 특이적 MB는 "refseq-rna" 데이터베이스 및 드로소필라 멜라노가스터 유기체를 사용합니다).
   2. mRNA 표적의 조직별 발현(예를 들어, oskar mRNA Flybase> 고처리량 발현 데이터> FlyAtlas 해부학 마이크로어레이 또는 modENCODE 해부학 RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) 그리고 어떤 긍정적 인 폭발 안타와 비교. 관심있는 조직 / 세포에서 발현되는 다른 mRNAs와 >50 % 교차 호동성을 보여주는 프로브를 제거하십시오.
3. 라이브 세포 이미징(예: Cy5/BHQ2)을 수행하는 데 사용할 수 있는 현미경 설정에 적합한 플루오로포어 및 쿼처 쌍을 선택합니다.

2. MB 합성, 정화 및 특성화

1. 브라투에 이전에 설명된 바와 같이 사내 합성 및 정화, 분자 생물학 방법 (2006)또는 상업 제공 업체의 서비스, 합성 및 5 개의 MB (위의 참고 참조)를 합성하고 정화하기 위해 다음과 같은 라벨 방식을 사용하여 : [5'(플루오로포레)-(C3 또는 C6 링커)-(2'O-O-methyl MBnc).3... 역단계 HPLC를 사용하여, 집에서 또는 상업 공급자의 서비스를 사용하여 MB를 정화합니다.
   참고: 자동 프로브 합성에 사용되는 인산화는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 변형이 있어야 합니다. 또한 잠긴 핵산(LNA)과 2'-O-메틸 변형을 번갈아 가며 키메라를 사용하여 짧은 MB와 표적 mRNA 사이의 하이브리드의 안정성을 높일 수 있다.
2. 표적 RNA 영역의 서열과 일치하고 따라서 시험관 내 특성화에서 사용하기 위해 MB의 프로브 영역에 보완되는 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성한다(단계 2.3 에서 2.5; 위 노트 참조). 표적 mRNA 서열에서 발견되는 바와 같이 DNA-올리고뉴클레오티드 표적 모방을 통해 MB의 혼성화를 최대화하여 DNA 표적의 각 끝을 포함하는 것으로 나타났다.
   참고: 표적 서열을 검출하는 MB의 효율의 보다 엄격한 특성화는 상호 보완적인 DNA 올리고뉴클레오티드 대신 체외 합성 RNA 표적을 사용하여 수행될 수 있다.
3. MB만의 열성 절전을 수행하고, 용융 온도(Tm)를 측정하고, MB가 생리온도에서 원하는 헤어핀 모양을 가정하고 있음을 확인한다. 우리는 60 과 90 ° C 사이의 Tm 값을 관찰했다.
4. DNA 올리고뉴클레오티드 표적의 존재에서 MB의 열성 절제를 수행하고 MB:DNA 표적 하이브리드의 Tm을 측정하고, 이전에 브라투에 설명된 바와 같이, 분자 생물학 방법(2006). MB:DNA 하이브리드에 대해 55~60°C 사이의 Tm이 요구된다.
5. 해당 DNA 올리고뉴클레오티드 표적을 사용하여 체외 혼성화 반응을 수행하고, 이전에 브라투, 분자 생물학 방법(2006)에설명된 바와 같이, 생리적 온도에서 MB:DNA 하이브리드 형성의 효율을 결정한다. DNA 표적 모방을 갖는 빠른 혼성화 운동제가 원하지만, DNA 표적을 가진 높은 혼성화 효율을 보여주지 않는 MB는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 표적 mRNA를 통해 더 나은 성능을 가질 수 있다.

3. 미세 주입을위한 개별 계란 챔버의 해부 및 준비

1. 신선한 효모 페이스트와 함께 2-3 일 동안 새로 부화, 짝짓기 여성을 공급합니다.
2. 마취는 CO₂ 패드에서 날아가고, 미세 핀셋 (Dumont #5)을 사용하여 1-2 암컷을 유리 커버 슬립에 할로카본 오일 700 방울로 옮기습니다.
3. 핀셋 한 쌍을 사용하여, 스테레오 현미경 아래 위로 등쪽 측면으로 비행을 지향. 후면 끝에 작은 절개를 함으로써 암컷 복부를 해부하고 난소 쌍을 기름에 부드럽게 짜냅니다.
4. 난소를 새로운 커버슬립에 기름 방울에 떨어뜨립니다. 다른 트위저와 함께 난소 한 개를 부드럽게 집어 들고 있는 동안, 한 개의 트위저로 난소 한 개를 부드럽게 잡습니다. 오스카르 mRNA는 중기 우발생(stages > 7) 및 후 활발하게 국소화되고 있으며, 젊은 계란 챔버(stages & 7)는 주입하기가 더 어렵고 오래 생존하지 못한다. 개별 혈관 또는 계란 챔버가 분리되고 수직으로 정렬 될 때까지 (하향 이동)커버 슬립에 천천히 드래그합니다. 또한 ovariole 계란 사슬에서 원치 않는 단계를 대체 하 여 단일 계란 챔버를 분리.
   참고: 개별적으로 조롱된 달걀 챔버가 오일에 떠 있지 않고 덮개 슬립을 부착하는지 확인합니다. 이는 성공적인 미세 주입 및 이미지 수집 모두에 중요합니다.

4. 계란 챔버의 간호사 세포에 MB의 미세 주입

1. MB 용액을 준비하여 하나의 분자 비콘(예: osk2216Cy5) 또는 서로 다른 mRNA를 대상으로 하는 두 개의 MB를 혼합하여 관상으로 구별되는 형광(예: osk2216Cy5 및 drongo111Cy3)으로 표시한다. HybBuffer에서 각 MB(50mM Tris-HCl - pH 7.5, 1.5mM MgCl₂ 및 100mM NaCl)의 농도를 사용합니다. HybBuffer(예: osk82, osk1236, osk2216)에서 각각 200 ng/μL에서 동일한 mRNA를 대상으로 하는 동일한 플루오로포어로 표시된 4개의 MB의 칵테일. 마이크로 주입바늘을 적재하기 직전에 MB 용액을 회전시킵니다.
2. 목표를 선택합니다. 40배 오일 목표는 적절한 계란 챔버를 찾고 미세 주입을 수행하는 데 권장됩니다.
3. 해부된 달걀 챔버를 현미경 단계에 장착하여 커버슬립을 장착합니다. 초점 위치에서 목표를 가져와 서 중후반 발달 단계에서 계란 챔버를 식별하, 이는 미세 주입을 위해 적절히 지향됩니다(즉, AàP 축이 바늘 끝에 수직으로 되어 있어 난소세포에 대한 간호사 세포 근교 내에서 쉽게 주사할 수 있도록 한다).
4. ~1 μL MB 용액(1.1단계 참조)으로 바늘(상업용 또는 제조)을 적재하고 마이크로인젝터에 연결합니다. D. 멜라노가스터 계란 챔버의 미세 주입의 경우, 여러 간호사 세포에 구멍을 뚫는 것을 피하기 위해 현미경 단계 (예 : 30 °)에 각도 & 45 ° 에서 바늘 (재료의 표참조)을 지향합니다.
5. 500-1,000 hPa의 주입 압력과 100-250 hPa의 보상 압력으로 인젝터를 설정합니다(재료 표참조).
6. 천천히 달걀 챔버의 기름 드롭 무효의 영역을 시야에 가지고 무대를 이동합니다.
7. 마이크로 조작기 조이스틱을 사용하여 바늘을 오일 드롭으로 부드럽게 낮추고 팁을 시야 주변쪽으로 집중시합니다.
8. 바늘 끝에서 공기를 제거하고 바늘에서 흐름이 있는지 확인하기 위해 '깨끗한'기능을 수행합니다.
9. 바늘을 집 위치로 가져와 서 계란 챔버에 초점을 맞추고 마이크로 주입 한 다음 바늘을 다시 초점으로 가져 와서 계란 챔버의 가장자리 근처에 배치하십시오.
10. 간호사 세포로부터 여포 세포를 분리하는 막이 초점을 맞출 수 있도록 목표의 Z 위치의 미세 조정을 수행한다.
11. 바늘을 간호사 세포에 삽입하고 2-5 s에 대한 주사를 수행합니다.
12. 바늘을 부드럽게 제거하고 홈 위치로 철회하십시오.
13. 이미지 수집(60-63x 또는 100x)을 원하는 배율로 변경하고, 계란 챔버에 초점을 맞추고, 인수를 시작합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing