Mikroinjektion av drosophilasjuksköterskeceller: En metod för intracellulär leverans

Overview

På grund av deras stora storlek och relativt enkla organisation är Drosophila sjuksköterskeceller idealiska för levande cellavbildningsstudier. Denna video beskriver en microinjection metod för exogena föreningar leverans i cellerna, och det presenterade protokollet visar förfarandet med fluorescerande oligonucleotide sonder kallas molekylära fyrar (MBs) används för att visualisera endogena mRNA transkriptioner.

Protocol

Detta protokoll är utdrag ur Catrina et al., Visualisering och spårning Endogena mRNAs i Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).

1. Design av MBs för Live Cell Imaging

1. Vik mål-RNA-sekvensen för att förutsäga mRNA-målets sekundära struktur med hjälp av "RNA-formuläret"från mfold-servern( http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form ).
   1. Klistra in/ladda upp målsekvensen i FASTA-format, välj 5 eller 10% suboptimalitet (strukturer med fri energi att vika inom 5 respektive 10% av MFE-värdet) och justera det maximala antalet beräknade vikningar i enlighet därmed (t.ex. större för 10% suboptimalitet).
      OBS: Införandet av suboptimala sekundära strukturer vid utformning av MBs gör det möjligt att identifiera regioner inom mål mRNA som kan vara mer flexibla eller styva än vad som förutsågs enbart för den minsta fria energistrukturen (MFE), vilket förbättrar den övergripande utformningen av MBs som lämpar sig för levande cellavbildning.
   2. Välj ett "omedelbart jobb" för mRNA-mål på 800 nukleotider (nt) eller ett "batchjobb" för mRNA-längder mellan 801 och 8 000 nt. Spara filen "ss-count" som enkel textfil.
2. Använd filen "ss-count" som erhålls i steg 1.1 som indata för PinMol-programmet (https://bratulab.wordpress.com/software/) med önskade parametrar, för att utforma flera MBs för mRNA-målet (se handledningar som beskriver användningen av PinMol-programmet vid https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
   1. Bestäm särdragen hos utvalda MBs genom att utföra BLAST-analys: använd "blastn" med lämplig databas (t.ex. för oskar mRNA-specifika MBs använd databasen "refseq-rna" och Drosophila melanogaster organism).
   2. Identifiera alla vävnadsspecifika uttryck för mRNA-mål (t.ex. för Oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray eller modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) och jämför med eventuella positiva BLAST-träffar. Eliminera sonder som visar >50% korshomologi med andra mRNAs som också uttrycks i vävnaden/cellen av intresse.
3. Välj det fluorofor- och quencherpar som är lämpligt för den mikroskopiuppsättning som finns tillgänglig för att utföra levande cellavbildning (t.ex. Cy5/BHQ2).

2. MB syntes, rening och karakterisering

1. Använd in-house syntes och rening som tidigare beskrivits i Bratu, Methods in Molecular Biology (2006), eller tjänster från kommersiella leverantörer, för att syntetisera och rena en till fem MBs (se ovan anmärkning), med hjälp av följande märkningsschema: [5'(Fluorophore)-(C3 eller C6 linker)-(2'-O-metyl MB-sekvens)-(Quencher)3']. Rena MBs med hjälp av HPLC i omvänd fas, internt eller med hjälp av den kommersiella leverantörens tjänster.
   OBS: Fosforamiditer som används för automatiserad sondsyntesmåste ha 2'- O-metyl ribonukleotid modifiering. Man kan också använda chimeras av alternerande låst nukleinsyra (LNA) och 2'-O-metylmodifieringar för att öka stabiliteten hos en hybrid mellan en kortare MB och dess mål mRNA.
2. Syntetisera DNA-oligonukleotider som matchar sekvensen av den riktade RNA-regionen och därmed kompletterar sondregionen MBs, för användning i in vitro-karakterisering (se steg 2.3 till 2.5; ovan anmärkning). Maximera hybridiseringen av MB med DNA-oligonukleotid målet efterlikna, genom att inkludera i varje ände av DNA-målet fyra ytterligare nukleotider, som finns i målet mRNA sekvens.
   OBS: En mer rigorös karakterisering av MB: s effektivitet för att upptäcka den riktade sekvensen kan utföras med hjälp av in vitro syntetiserade RNA-mål istället för kompletterande DNA-oligonukleotider.
3. Utför termisk denaturering av MB ensam, mät dess smälttemperatur (Tm) och bekräfta att MB antar önskad hårnålsform vid fysiologisk temperatur. Vi har observerat Tm värden mellan 60 och 90 °C.
4. Utför termisk denaturering av MB i närvaro av DNA-oligonukleotidmålet och mät MB:DNA-målhybridens Tm, som tidigare beskrivits i Bratu, Metoder i molekylärbiologi (2006). En Tm mellan 55 och 60 °C önskas för MB:DNA-hybriden.
5. Utför hybridiseringsreaktioner in vitro med motsvarande DNA-oligonukleotidmål och bestäm effektiviteten hos MB:DNA-hybridbildning vid fysiologisk temperatur, som tidigare beskrivits i Bratu, Metoder i molekylärbiologi (2006). Snabbhybridisering kinetik med DNA-målet efterlikna önskas, men MBs som inte visar hög hybridisering effektivitet med DNA-mål kan ha en bättre prestanda med målet mRNA in vitro och/eller in vivo.

3. Dissekering och beredning av enskilda äggkammare för mikroinjektion

1. Mata nykläckta, parade honor i 2-3 dagar med färsk jästpasta.
2. Söva flugor på en CO_2-dyna och, med hjälp av fina pincett (Dumont #5), överför 1-2 honor till en droppe Halocarbonolja 700 på en glaskåpa.
3. Använd ett par pincett, orientera flugan med den dorsala sidan upp under ett stereomikroskop. Dissekera den kvinnliga buken genom att göra ett litet snitt i den bakre änden och pressa försiktigt äggstockarna i oljan.
4. Explantera äggstockarna på en oljedroppe på ett nytt täckglas. Håll försiktigt en äggstock med en pincett medan du nyper av de yngsta stadierna av ovariolen med den andra pincetten. Oskar mRNA är aktivt lokaliserad vid och efter mid-oogenesis (steg > 7), och yngre äggkammare (steg < 7) är svårare att injicera och överlever inte så länge. Dra långsamt på lockets glid (med en nedåtgående rörelse) tills enskilda ovarioler eller äggkammare isoleras och justeras vertikalt. Ytterligare separera enstaka äggkammare genom att förskjuta de oönskade stadierna från ovarioläggkedjan.
   OBS: Se till att individuellt retade äggkammare inte flyter i oljan och att de klibbar vid täckspingen. Detta är viktigt för både framgångsrik mikroinjektion och bildförvärv.

4. Mikroinjektion av MBs i sjuksköterskecellerna i äggkammare

1. Förbered MB-lösningen med hjälp av en molekylär fyr (t.ex. osk2216Cy5) eller en blandning av två MBs som riktar sig till olika mRNAs och som är märkta med spektroskt distinkta fluorforer (t.ex. osk2216Cy5 och drongo111Cy3). Använd en koncentration på 200-300 ng/μL varje MB i HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl₂ och 100 mM NaCl). För en cocktail av fyra MBs märkta med samma fluorfor som riktar in sig på samma mRNA vid 200 ng/μL vardera i HybBuffer (t.ex. osk82, osk1236, osk2216). Snurra ner MB-lösningen omedelbart innan du laddar nålen för mikroinjektion.
2. Välj målet. Ett 40x oljemål rekommenderas för att hitta en lämplig äggkammare och för att utföra mikroinjektion.
3. Montera täckglaset med dissekerad äggkammare på mikroskopstadiet. Ta upp målet i fokuspositionen och identifiera en äggkammare i ett utvecklingsstadium mellan mitten och sent, som är korrekt orienterat för mikroinjektion (dvs. med AàP-axeln vinkelrätt mot nålspetsen för att möjliggöra enkel injektion i en sjuksköterska cell proximal till äggcellen).
4. Ladda en nål (kommersiell eller beredd internt) med ~1 μL MB lösning (se steg 1.1) och anslut den till mikroinjektorn. För mikroinjektioner i D. melanogaster äggkammare, orientera nålen (se Materialförteckningen)i vinkel <45° till mikroskopstadiet (t.ex. 30°) för att undvika punktering av flera sjuksköterskeceller.
5. Ställ in injektorn med ett injektionstryck på 500-1 000 hPa och ett kompensationstryck på 100–250 hPa (se materialförteckning).
6. Flytta långsamt scenen för att få in synfältet ett område av oljedroppe tomrummet av äggkammare.
7. Använd styrspaken micromanipulator, sänk försiktigt nålen i oljedroppen och sätt spetsen i fokus mot synfältets periferi.
8. Utför en "ren" funktion för att avlägsna luften från nålens spets och för att säkerställa att det finns flöde från nålen.
9. För nålen till hempositionen och fokusera på äggkammaren som ska mikroin injiceras, sätt sedan nålen i fokus igen och placera den nära äggkammarens kant.
10. Gör en fin justering av målets Z-position så att membranet som separerar follikelcellerna från sjuksköterskecellerna är i fokus.
11. Sätt in nålen i en sjuksköterskecell och utför injektion i 2-5 s.
12. Ta försiktigt bort nålen och dra tillbaka den till hemläget.
13. Ändra målet till önskad förstoring för bildförvärv (60-63x eller 100x), fokusera på äggkammaren och börja förvärvet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing