Summary
Isoler des cellules souches adultes provenant de tissus mous musculosquelettiques basé sur la vitesse adhésion de la cellule dans le ballon.
Abstract
Les cellules souches adultes ont été longuement débattues en ce qui concerne leur application dans la médecine régénérative. Les cellules souches adultes ont suscité un grand enthousiasme pour le traitement des tissus blessés et malades à cause de leurs capacités impressionnantes de subir la différenciation des cellules de lignées multiples et leur capacité d'auto-renouvellement. Plus important encore, ces qualités ont fait de leur avantage pour une utilisation dans les thérapies transplantation de cellules autologues. Le protocole actuel va introduire le lecteur à la technique preplate modifiés lorsque les tissus mous de l'appareil locomoteur, des tendons et des muscles, par exemple, sont une
Protocol
En général, la procédure complète preplate modifiés nécessite 1-2 jours de préparation, 1 semaine d'effectuer la procédure technique, 2-3 jours d'identification de la cellule avec l'immunocytochimie, et un 2-3 semaines supplémentaires de l'expansion de la population de cellules souches. L'équipement requis pour la culture de cellules souches sont similaires à celles des autres systèmes de culture cellulaire qui inclut une centrifugeuse de paillasse, incubateur à CO 2, à flux laminaire de culture de tissus capot et d'un microscope inversé à fluorescence et équipé d'un appareil photo numérique. Les cellules souches isolées peuvent également être clonés et peuvent être stockées à long terme dans l'azote liquide pour le 1,2 actuelles ou futures études. Tous les réactifs et les matériaux utilisés pour cette procédure doivent être stériles et manipulés de façon aseptique.
Étape 1: Préparation
- Collagène plats manteau de culture de tissus et de flacons: collagène de type I dérivé de peau de veau (0,1 g dans 1 litre; Sigma-Aldrich). Le matériel en plastique pour recouvrir comprend: T-25 flacons, 6 ou 12 plaques à puits, des plats (60 et 100 mm, BD Falcon) comme décrit précédemment 1,2. Secouez la matériel en plastique chaque demi-heure, pendant 4 heures pour assurer une couche de collagène. La solution de collagène est ensuite retiré. Et le matériel en plastique enduit est ensuite mis à sécher dans la hotte de culture tissulaire avec la lumière UV et la hotte à la fois sur, pour assurer la stérilité et, enfin, ou remises couvertes pour une utilisation ultérieure.
- Préparer milieu de culture cellulaire: 400ml DMEM (DMEM, le glucose élevé; Invitrogen), 50mL inactivé par la chaleur sérum fœtal bovin (FBS, Invitrogen), 50 ml de cheval (HS, Invitrogen) sériques, et 5 ml d'extrait d'embryon Chick (PECO; Précis Chemical Co. ) seront filtrés sous vide en utilisant un dispositif jetable de 0,22 um de 500 ml système de filtre stérile (Corning). Stérile pénicilline / solution de streptomycine (Invitrogen) sera ajouté, enfin 100 unités / ml. Les solutions préparées peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins un mois. Cette solution est utilisée pour détacher les cellules du ballon lorsque les cultures scission ou la préparation des cellules pour la transplantation.
- Warm up de solutions pour l'isolement cellulaire: Les réactifs suivants doivent être réchauffés jusqu'à 37 ° C avant leur utilisation pour l'isolement cellulaire: solution de Hank saline tamponnée (HBSS, Invitrogen); 0,2% (poids / volume) de la collagénase de type XI (Sigma -Aldrich), avec une moyenne de 3200 unités de digestion du collagène par mL HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (poids / volume) trypsine (Invitrogen).
- Stériliser le matériel chirurgical en préparation: la procédure chirurgicale nécessite instruments chirurgicaux stériles, y compris: de taille différente forceps, les micro-ciseaux, ciseaux à iris et / ou les lames de bistouri. En outre, les 15 et 50 mL tubes à centrifuger en polypropylène (BD Falcon); filtre cellulaire (taille des pores de 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - et 27 aiguilles de calibre (BD PrecisionGlide) et 10 - ou 20 ml seringues stériles (BD).
Etape 2: biopsies tissulaires, l'isolement et dissociation mécanique 1-4
Les biopsies sont réalisées sous une hotte de culture stérile et comprennent fraîchement récoltés tendons et les muscles squelettiques sont obtenus à partir des muscles du tibia ou du soléaire du membre postérieur des souris de type sauvage (Femme C57BL/6J, 4-5 semaines d'âge ou plus jeunes, Jackson de laboratoire). Tout tissu conjonctif visibles, les vaisseaux sanguins et les tissus adipeux sont alors retirés de la biopsie. Les tissus du tendon et du muscle sont ensuite soigneusement identifiés sous un microscope chirurgical de dissection pour enlever les restes de la peau et les os et placés dans un plat contenant froid (4 ° C) HBSS (complétée par ajouter 5% de FBS). Les tissus sont ensuite isolés placés séparément sur des plats revêtues de collagène contenant HBSS froid et sera hachés (<1x1 mm 3) dans une bouillie grossière à l'aide de micro-ciseaux et / ou les lames de bistouri.
Etape 3: La digestion enzymatique des tissus:
Le tissu est ensuite hachée enzymatiquement dissocié par une série d'étapes 2,4,5
- Transférer les pâtes dans les tissus hachés séparée des tubes de 15 ml et centrifuger à ~ 3500 rpm à 4 ° C pendant 5 min.
- Retirer le surnageant, laver avec du HBSS et répéter la centrifugation à nouveau.
- Retirer le surnageant, et digérer ces boues en ajoutant 10 ml de préchauffée 0,2% de la collagénase de type XI (Sigma). Incuber pendant 60 min à 37 ° C tout en continuant doucement bercer les tubes. Sinon, serrer la main toutes les 10 min.
- Centrifugeuse et remettre ces boues dans 10 ml dispase (2,4 unités / ml, Gibco) solution. Incuber pendant 45 min à 37 ° C, en agitant doucement avec les mains ou à bascule toutes les 10 min.
- Centrifugeuse et re-suspendre ces boues dans 10 ml de solution HBSS 0,2% de trypsine. L'incubation varie en fonction de la mesure dans laquelle les cellules individuelles sont libérés des tissus qui peuvent être effectuées en observant la suspension sous microscope. Il n'est pas recommandé de dépasser 30 mn à 37 ° C avec inversant les tubes ou les secouant délicatement toutes les 10 min.
- Centrifuger les cellules résultants et re-suspendre le culot cellulaire dans 10 ml de prolifération moyen (PM).
- Dissocier la suspension cellulaire en passant l'extrait à travers une série d'aiguilles. Les cellules sont ensuite passés à travers une 2 fois 18G, puis un 23G, et enfin une aiguille 27G.
- Passez l'extrait cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 um.
Étape 4: Preplating d'isoler des populations de cellules différentes basées sur le taux d'adhésion cellulaire 1-3
- Centrifuger et remettre en suspension les culots cellulaires dans le milieu de prolifération.
- Plaque mélanges de la cellule sur un revêtus de collagène T-25 flacon (ou parabole de 60 mm) et la marquer comme PP1. La suspension cellulaire doit être observé comme possédant un grand nombre de noyaux de réfraction et d'autres débris sous le microscope.
- Incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié, 5% de CO 2 incubateur pendant 2 heures.
- Transfert cellules non adhérentes à un nouveau revêtus de collagène T-25 flacon (ou parabole de 60 mm) et la marque est aussi PP2. Ajouter 5 ml de PM dans la plaque étiquetés PP1. Les premières cellules adhérant qui se fixent sur le flacon sont surtout les myofibroblastes 3.
- Retour des flacons à l'incubateur pendant 24 heures supplémentaires, le transfert cellules non adhérentes à un nouveau revêtus de collagène T-25 flacon (ou plat) et la marquer comme PP3. Ajouter 5 ml de milieu de prolifération dans la plaque étiquetés PP2. Ces cellules adhérentes qui se rattachent à ce flacon sont principalement les fibroblastes 2,3.
- Retour flacons à l'incubateur et répétez la procédure dans un autre 24 heures jusqu'à PP6 population est créé. Maintenir chaque groupe de cellules en suspension et leur permettre de proliférer et de les examiner régulièrement à l'aide d'un microscope inversé. PP3-PP4 sont principalement myoblastes alors que les cellules satellites du muscle sont souvent perçus principalement dans PP5 2.
- La plupart des cellules adhérant lentement se fixent habituellement par PP6. A ce stade, les cellules semblent petits, ronds, de réfraction de lumière et sont très clairsemées en nombre et sont considérés comme une population de cellules souches 1,2.
Etape 5: identification et l'expansion de cellules souches isolées
- Le PP6 isolés cellules sont très peu nombreux et doivent être maintenues dans FBS riche prolifération moyen (20% de FBS dans DMEM) qui est changé tous les jours. La plupart des cellules présentes dans la filière PP6 la culture au cours des 1-2 après des semaines de culture, mais un grand, sain PP6 population est généralement créées après une 1-2 semaines supplémentaires de l'expansion. Les cellules souches isolées de souris hautement exprimer l'antigène des cellules souches 1 (SCA1), le CD34, le foie fœtal kinase 1 (FLK1), et des marqueurs autre tige 1,2,6,7 qui peut être visualisé via coloration immunocytochimique. Ces cellules souches présentent également des capacités de différenciation multiples 3,6,8.
- Les cellules isolées sont maintenus et élargis à une faible densité cellulaire en culture (12 puits plats à 50-100 cellules / puits ou la confluence <20-30% dans le ballon ou un plat) afin d'éviter 1,2 différenciation. Très peu de cellules sous forme de clones lors de l'expansion, et ces cellules souches clonées peuvent subir longtemps la prolifération (LTP) pour toute autre compétence d'études. Les cellules souches clonées peut également être stocker dans l'azote liquide en utilisant les procédures générales de stockage de cellules ex moyennes PM avec 10% de DMSO. Faire un certain nombre de stocks de faible passage des cellules souches pour toutes les autres études jusqu'à dos.
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Discussion
Il a été reconnu que certains tissus adultes contiennent des cellules souches multiples. Au cours des dernières années d'étude, les cellules souches ont été détectées dans les tissus mous musculo-squelettiques, y compris les muscles squelettiques et du tendon. Ce protocole actuel de détails d'une procédure, connue comme la technique preplate modifié, qui a été utilisé avec succès dans notre laboratoire afin d'isoler les cellules souches adultes à partir des tendons et des muscles squelettiques. En utilisant la technique décrite ci-dessus preplate modifiés, les cellules peuvent être divisés en plusieurs populations en fonction de leurs caractéristiques d'adhérence aux flacons revêtues de collagène (figure 1). Fibroblastes et les myofibroblastes trouve dans les tissus rapidement adhérer à la flacons revêtues de collagène dans les 24-48 heures et sont initialement séparées des autres cellules dans les PP1 PP2-. Les cellules myogéniques ou endothéliales adhèrent aux flacons revêtues de collagène, après une période plus longue, dans 48-96 heures (PP3-PP5), et peuvent être récoltés et identifiés par leurs marqueurs de surface cellulaire. Les cellules tard preplated, 96 heures ou plus tard (PP6), sont considérés comme des cellules souches adultes (figure 2). Les cellules preplate fin semblent petits, ronds et translucides au début de leur isolement et peut être encore caractérisé par cytométrie de flux ou immunocytochimie pour leur expression de l'antigène des cellules souches 1 (SCA1), le CD34, le foie fœtal kinase 1 (FLK1), et d'autres marqueurs de cellules souches (figure 3). Les cellules souches isolées ont la capacité d'auto-renouvellement et d'études expérimentales ont démontré leur multipotence travers leur différenciation en trois feuillets embryonnaires: mésoderme, ectoderme, endoderme et le 9. De multiples investigations ont également révélé que ces cellules souches se différencient en cellules de la lignée mésodermique dont les ostéocytes, les adipocytes, chondrocytes, cellules hématopoïétiques et 6,8. D'autres études ont démontré que les cellules souches adultes se différencier en lignées cellulaires ectoderme par leur expression de marqueurs de cellules neuronales et gliales et leur capacité à améliorer la fonction du membre, après le nerf périphérique a été endommagé 10. Ces cellules souches adultes isolés ont été bénéfiques pour la réparation des blessés et malades tissus musculo-squelettiques, et d'autres études in vivo ont été réalisées sur d'autres tissus, y compris le cœur, le foie et la moelle épinière ainsi que des conditions médicales spécifiques, comme la sous-muqueuse intestinale de petites et de la vessie pour traiter incontinence urinaire d'effort 9.
Figure 1.
Figure 2.
Figure 3.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs sont très reconnaissants de Mme Haiying Pan et M. Ian Bellayr pour leur aide technique sur l'isolement cellulaire pour les films en cours et M. Kyle Holden et M. Jonathan Lucas pour leur aide sur le montage de diapositives. Un grand merci à la liste de personnes suivantes qui ont été impliqués dans le développement des techniques preplate modifié au cours des dernières années: les Drs. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, KIMIMASA Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Nous sommes reconnaissants de l'assistance technique de James H. Cummins, Ryan Pruchnic, Joseph Feduska, Rebecca C. Schugar, Haiying Pan et Tebbets Jessica. L'auteur souhaite également souligner le soutien financier à ce travail de la Muscular Dystrophy Association (MDA), les National Institutes of Health (NIH), le Department of Defense (DOD), l'Hôpital pour enfants de Pittsburgh de l'UPMC, le ministère de chirurgie orthopédique, et l'Université de Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).
- Li, Y. &, Huard, J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).
- Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &, Sloper, J. C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).
- Lu, A. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).
- Lee, J. Y. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).
- Cao, B. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers. Gene Ther. 8, 627-637 (2001).
- Cao, B. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).
- Huard, J. Regenerative medicine based on muscle stem cells. J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).
- Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &, Huard, J. Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells. J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).
