Summary
Balona hücre bağlılık hızına göre kas-iskelet yumuşak dokulardan Yalıtımlı yetişkin kök hücreleri.
Abstract
Yetişkin kök hücreleri uzun rejeneratif tıp uygulama ile ilgili olarak ele alınmıştır. Yetişkin kök hücreleri, çok soyundan hücre farklılaşması ve kendi kendini yenileme yeteneği geçmesi etkileyici yetenekleri nedeniyle yaralı ve hastalıklı dokuların tedavisi için büyük bir heyecan yarattı. En önemlisi, bu niteliklere otolog hücre nakli tedavileri kullanmak için onları avantajlı hale getirmiştir. Geçerli protokol, kas-iskelet sistemi, örneğin, tendon ve kas, yumuşak doku 1 değiştirilmiş preplate tekniğini okuyucularına tanıtacak
Protocol
Genel olarak, komple değiştirilmiş preplate prosedürü hazırlık 1-2 gün, 1 hafta teknik yordamı gerçekleştirmeden, 2-3 gün hücre immünsitokimya kimlik, kök hücre nüfus büyümesi ek bir 2-3 hafta gerektirir. Kök hücre kültürü için gerekli ekipman, bir tezgah üstü santrifüj, CO2 inkübatör, Laminer akış doku kültürü kaputu ve floresans ve bir dijital kamera ile donatılmış bir inverted mikroskop içeren diğer hücre kültür sistemleri bu benzer . Izole edilen kök hücreler de klonlanmış olabilir ve mevcut ya da gelecekteki çalışmaları için 1,2 sıvı nitrojen içinde uzun vadeli saklanabilir. Bu prosedür için kullanılan tüm reaktifler ve malzemelerin steril olması ve aseptik olarak ele gerekir.
Adım 1: Hazırlık
- Kollajen kat doku kültürü yemekleri ve balonları: buzağı deri (1 litre suda 0.1 g; Sigma-Aldrich) türetilen Tip I kollajen. Kat için plasticware içerir: T-25 şişeler 1,2 önce açıklandığı gibi, 6 veya 12 sıra tabak, yemekler (60 ve 100 mm, BD Falcon). Yavaşça kollajen bile kaplama sağlamak için 4 saat boyunca plasticware, her yarım saatte bir sallamak. Kollajen çözüm daha sonra kaldırılır. Ve kaplı plasticware sonra kısırlık sağlamak için, UV ışık ve kaput, hem doku kültürü kaputu kurumaya izin verilir, ve son olarak Tekrar kapatılan veya daha sonra kullanmak için kapalı.
- Hücre kültür ortamı hazırlayın, 50ml Isı İnaktif Fetal Bovine Serum (FBS, Invitrogen), 50ml At Serum (HS, Invitrogen) ve 5 ml Civciv Embriyo Extract (CEE; Doğru Chemical Co 400ml DMEM (Invitrogen DMEM, yüksek glukoz): ) bir tek 0.22 mikron 500 ml steril filtre sistemi (Corning) kullanarak filtreli elektrik süpürgesi olacak. Steril penisilin / streptomisin çözüm (Invitrogen) sonunda 100 Birimler / mL eklenecektir. Hazırlanan çözümler en az bir ay süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Bu çözüm, balon hücreleri ayırmak için kullanılan bölme kültürleri veya transplantasyon için hücrelerin hazırlanması.
- Hücre izolasyon çözümleri kadar Isınma: Aşağıdaki reaktifler 37 kadar ısınmış olması için ° C hücre izolasyonu için kullanılması önce: Hank Tamponlu Tuz Çözüm (HBSS, Invitrogen); 0.2% (ağırlık / hacim) kollajenaz-tip XI (Sigma Dispase 2.4 units/1mL (Invitrogen);% 0.5 'lik (ağırlık / hacim) tripsin (Invitrogen) başına 3.200 ml HBSS kollajen sindirim birimlerinin ortalama-Aldrich).
- Cerrahi teçhizat hazırlık sterilize:: Cerrahi işlem de dahil olmak üzere steril cerrahi aletler gerektiren farklı büyüklükteki forseps, mikro-makas, iris makası ve / veya bisturi ağızları. Ayrıca, 15 ve 50 ml polipropilen santrifüj tüpleri (BD Falcon); Hücre süzgeç (gözenek büyüklüğü 70 m) (BD Falcon), 18 - 23 - ve 27-gauge iğne (BD PrecisionGlide), 10 - veya 20 ml steril şırıngalar (BD).
Adım 2: Doku biyopsi, izolasyon ve mekanik disosiasyon 1-4
Doku biyopsileri steril bir kültür kaputun altında yapılır ve taze hasat tendon ve iskelet kasları, wild-tip farelerden hindlimb (Kadın C57BL/6J, 4-5 yaş hafta ya da daha genç, Jackson tibia veya soleus kas elde edilen Laboratuvar). Biyopsi örnekleri görünür bir bağ dokusu, kan damarları ve yağ dokusu daha sonra kaldırılır. Tendon ve kas dokuları, deri ve kemik kalıntıları kaldırmak için bir cerrahi diseksiyon mikroskobu altında dikkatle tespit ve bir tabak içinde bulunduğu soğuk (4 ° C) HBSS (% 5 FBS ile takviye). Izole dokularda sonra soğuk HBSS içeren kollajen kaplı yemekleri ayrı ayrı yerleştirilir ve kaba bir bulamaç haline mikro-makas ve / veya bisturi ağızları kullanarak (<1x1 mm 3) kıyılmış olacak .
Adım 3: Enzimatik sindirim dokuların:
Kıyılmış doku adımları 2,4,5 bir dizi enzimatik ayrışmış
- Ayrı 15 ml tüpler ve 4 ~ 3500 rpm'de santrifüj ° C 5 dakika içine kıyılmış doku çamurlar aktarın.
- Süpernatantı HBSS ile yıkayın ve tekrar santrifüj tekrarlayın.
- Süpernatantı prewarmed% 0.2 kollajenaz tip XI (Sigma) 10 ml ekleyerek bu çamurlar sindiremez. 60 dakika için 37 ° ° C'de sürekli tüpler hafifçe sallanan. Alternatif olarak, her 10 dakikada bir, el sallayın.
- Santrifüj ve 10 ml dispase (2.4 Birimler / mL Gibco) çözümü bu çamurlar tekrar süspansiyon. Elleriyle sallayarak veya her 10 dakikada bir hafifçe sallanan 37 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
- 10 ml% 0.2 tripsin HBSS çözüm bu çamurlar Santrifüj ve yeniden askıya. Kuluçka tek hücreleri, mikroskop altında süspansiyon gözlemleyerek yapılabilir dokulardan yayımlanan hangi ölçüde değişecektir. Tüpleri ile tersine ° C 37 30 dakika aşmak için tavsiye veya her 10 dakikada bir nazikçe sallanan değildir.
- Sonuçlanan hücre Santrifüjs ve yeniden askıya hücre pelletini Silahların Yayılmasını Önleme Orta (PM) 10 ml.
- Iğne bir dizi özü geçerek hücre süspansiyonu ayrıştırmaları. Hücreler daha sonra bir 18G ile 23G 2 kez geçti ve nihayet bir 27G iğne.
- 70 mikron hücre süzgeç vasıtasıyla hücre özü iletin.
Adım 4: hücre adezyon oranı 1-3 dayalı farklı hücre popülasyonlarının izole Preplating
- Santrifüj ve hücre pelletleri tekrar süspansiyon Silahların Yayılmasının Önlenmesi Orta.
- Plate hücre kollajen kaplı bir T-25 balonuna (veya 60 mm yemek) üzerine karışımları ve PP1 olarak işaretlemek. Hücre süspansiyonu, mikroskop altında çok sayıda kırılma çekirdek ve diğer enkaz sahip olarak dikkat edilmelidir.
- 37 inkübe ° C, 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir,% 5 CO 2 inkübatör .
- T-25 balonuna (veya 60 mm çanak) ve mark PP2 olarak yeni bir kollajen kaplı nonadherent hücreleri aktarın. PP1 etiketli plakasına PM 5 ml ekleyin. Balona ekleyebilirsiniz erken yapışan hücreler çoğunlukla miyofibroblastlar 3.
- (Ya da çanak) T-25 balon yeni bir kollajen kaplı nonadherent hücreleri transferi ve PP3 olarak işaretlemek, başka bir 24 saat süreyle inkübatör şişeler dönün. Silahların Yayılmasının Önlenmesi Orta PP2 etiketli plakasına 5 ml ekleyin. Bu balona eklemek Bu kalarak hücreleri çoğunlukla fibroblastlar 2,3.
- Inkübatör şişeler dönün ve 24 saat içinde nüfus PP6 oluşturuluncaya kadar işlemi tekrarlayın. Her grup askıya hücreleri korumak ve çoğalmaya başlar ve ters bir mikroskop kullanılarak düzenli olarak incelemeye olanak sağlar. Kas uydu hücreleri genellikle PP5 2 çoğunlukla görülürken PP3-PP4 çoğunlukla matür.
- Yavaş yavaş kalarak hücrelerinin çoğu genellikle PP6 takın. Bu aşamada hücreler küçük, yuvarlak, ışık kırılma görünür ve sayısı çok azdır ve bir kök hücre nüfus 1,2 olarak kabul edilir.
Adım 5: Tanımlama ve izole edilen kök hücrelerin genişlemesi
- Izole PP6 hücreleri sayıca çok azdır ve günlük değiştirildi FBS zengin Silahların Yayılmasını Önleme Orta (% 20 DMEM içinde FBS) muhafaza edilmesi gerekir. Hücrelerin çoğu, kültür, aşağıdaki 1-2 hafta boyunca PP6 kültür kalıp mevcut, ama büyük, sağlıklı PP6 nüfus genellikle genişleme ek bir 1-2 hafta sonra oluşturulur. Farelerden elde edilen izole edilen kök hücreler, son derece 1 (SCA1) kök hücre antijen, CD34, fetal karaciğer kinaz 1 (Flk1) ve immünositokimyasal boyama aracılığı ile görsel olarak diğer kök belirteçlerinin 1,2,6,7 ifade eder. Bu kök hücrelerin, aynı zamanda birden fazla farklılaşma kapasiteleri 3,6,8 sergilemek .
- Izole hücreler korunur ve farklılaşma 1,2 önlemek için (iyi ya da <% 20-30 izdiham şişesi veya çanak 12 50-100 hücreleri iyi tabaklar /) düşük bir kültür hücre yoğunluğu genişletilmiş. Çok az sayıda hücre genişleme sırasında klonlar formu ve bu klonlanmış kök hücrelerinin başka herhangi bir yeterlilik çalışmaları için uzun süre proliferasyonu (LTP) yaptırmalıdırlar. Klonlanmış kök hücreler de% 10 DMSO ile PM orta örneğin genel hücre depolama prosedürleri kullanarak sıvı azot deposu olabilir. Kök hücreler, herhangi bir diğer geri çalışmalar için düşük geçiş stoklarının bir dizi olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu, bazı yetişkin dokularda çok kök hücreler içerdiğini kabul edilmiştir. Çalışmanın son birkaç yıl içinde, kök hücre, iskelet kas ve tendon gibi yumuşak kas-iskelet dokuları, tespit edilmiştir. Tendon ve iskelet kası yetişkin kök hücreleri izole etmek için başarılı bir laboratuvarda kullanılan olmuştur değiştirilmiş preplate tekniği olarak bilinen bu akım protokol detaylarının bir prosedür. Hücreleri yukarıda açıklanan değiştirilmiş preplate tekniği kullanarak çeşitli popülasyonları kollajen kaplı şişeler (Şekil 1) yapışma özelliklerine göre ayrılabilir. Fibroblastlar ve miyofibroblastlar dokularda bulunan kollajen kaplı şişeler 24-48 saat içinde hızla uymak ve başlangıçta PP1-PP2 diğer hücrelere ayrılır. Miyojenik veya endotel hücreleri 48-96 saat içinde uzun bir süre, (PP3-PP5) sonra kollajen kaplı şişeler yapışırlar ve hasat ve hücre yüzey belirteçleri ile tespit edilebilir. Sonra preplated hücreleri, 96 saat veya sonrası (PP6), yetişkin kök hücreleri (Şekil 2) olarak kabul edilir. Geç preplate hücreleri, küçük, yuvarlak ve onların izolasyon başında saydam görünür ve daha fazla kök hücre antijeni 1 (SCA-1), CD34, fetal karaciğer kinaz 1 (Flk1) kendi ifadesi için flow sitometri veya immünsitokimya tarafından karakterize edilebilir ve diğer kök hücre belirteçleri (Şekil 3). : Mezoderm, ektoderm, ve endoderm 9 izole edilen kök hücreler, kendini yenileme ve deneysel çalışmalar için kapasite üç germ kendi farklılaşma yoluyla multipotency göstermiştir . Çoklu soruşturmaları da, bu kök hücreler mezoderm soy osteositler, adipositler, kondrosit ve hematopoetik hücrelerin 6,8 dahil olmak üzere hücre içine ayırt ortaya koymuştur. Diğer çalışmalar, yetişkin kök hücreleri, nöronal ve glial hücre belirteçleri ve periferik sinir 10 hasar edildikten sonra ekstremite işlevini geliştirmek için yeteneklerini kendi ifade ile ektoderm hücre soyları içine ayırt göstermiştir. Bu izole yetişkin kök hücreler, yaralı ve hastalıklı kas-iskelet dokuların tamiri için faydalı olmuştur ve in vivo çalışmalar ile ilgili diğer kalp, karaciğer, ve omurilik gibi ince barsak submukoza ve tedavi mesane gibi belirli tıbbi durumlar da dahil olmak üzere diğer dokularda yapılmamıştır stres üriner inkontinans 9.
Şekil 1.
Şekil 2.
Şekil 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, güncel film ve slayt düzenleme hakkında yardım için Sayın Kyle Holden ve Sayın Jonathan Lucas için hücre izolasyonu, teknik yardım, Bayan Haiying Pan ve Bay Ian Bellayr büyük takdir. Dr: Geçtiğimiz yıllarda modifiye preplate tekniklerinin geliştirilmesi ile ilgili olan kişilerin aşağıdaki listeye çok teşekkürler. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita Ron Jankowski, Makato Ikezawa. James H. Cummins, Ryan Pruchnic, Joseph Feduska, Rebecca C. Schugar, Haiying Pan ve Jessica Tebbets teknik yardım için teşekkür ediyoruz. Yazar ayrıca Müsküler Distrofi Derneği (MDA), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Savunma Bakanlığı (DOD), UPMC, Pittsburgh Çocuk Hastanesi, Anabilim Dalı Bu çalışma için mali destek kabul etmek gibi. Ortopedi ve Travmatoloji ve Pittsburgh Üniversitesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).
- Li, Y. &, Huard, J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).
- Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &, Sloper, J. C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).
- Lu, A. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).
- Lee, J. Y. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).
- Cao, B. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers. Gene Ther. 8, 627-637 (2001).
- Cao, B. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).
- Huard, J. Regenerative medicine based on muscle stem cells. J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).
- Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &, Huard, J. Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells. J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).
